实验九沉淀反应 目的要求 1.了解沉淀反应在预防医学和兽医学中的意义。 2.初步掌握炭疽沉淀原的制备和环状沉淀反应，琼脂扩散反应的操作方法。 原理将可溶性抗原与相应的抗体混合，在适量电解质存在下，经过一定时间，即可形 成肉跟可见的沉淀物 称为沉淀反应。参与沉淀反应的抗原称为沉淀原 抗体称为沉淀素 沉淀反应通常都是利用己知抗体检查未知抗原，以诊断传染病。但也用于以已知的抗原 测定未知的抗体，以测定免疫血清的效价和诊断疫病。 操作步豫 一、环状沉淀反应（以炭疽为例） 炭疽环状沉淀反应又称为阿斯可里(Ascoli)氏反应。具体操作方法如图实9-1所示。 (一)沉淀原的制备 1,热浸法取被检材料（如各种实质脏器、血液、渗出液等）】一3g,在乳钵内研碎 然后加5~10倍生理盐水混合，用移液管吸至试管内，置于水浴锅中煮沸15~30分钟，用 中性石棉过滤，获得的透明滤液，即为被检的沉淀 果过滤液混浊不透明，可再过滤 次。 2.冷浸法用以检查怀疑为炭疽病畜的皮革和兽毛等材料，操作前，先将其高压灭菌 30分钟，以保证检查者的安全。然后取被检材料1g,浸于5~10倍的0.5%石炭酸生理盐水 中，在室温下或普通冰箱浸泡14一20小时，用中性石棉过滤，透明的滤液即为沉淀原。 (二)方法与判定 用毛细吸管吸取少量炭疽沉淀素血清，沿管壁徐徐注入沉淀反应管内，通常达管的1/3 高处，再用另一支毛细吸管吸取制备的沉淀原，沿管壁缓慢注入，使之重叠于炭疽沉淀素血 清上面，达到试管的23高处（注意：不 1研醉 2加5-10倍盐水3将魏暖入试管内夏发生气湘或摇动)。直立静置，在15 钟内，两液面水界处芳出现洁断、整之 的环状白轮， 则为阳性 为了验证反应的正确性，检验时可做 之商。下三种对照试验：】 4沸15-30 钟5过滤层积法7结果 1.炭疽沉淀素血清加标准炭疽沉淀 8 其，应为阳性： 2.标准炭疽沉淀原加健康马血清，应 阴性： 上月性 3.生理盐水加炭疽沉淀素血清，应为 、琼脂扩散沉淀反应（以炭直为例） 抗原、抗体在含有电解质的琼脂凝胶基质中可以向四周自由扩 ,如果二者是相应的具 有特异性，则在一定部位相遇，并发生反应，出现肉眼可见的白色沉淀线。此种反应为琼脂 扩散沉淀反应。 由于一种抗原可能含有数种抗原成分，因而在凝胶中的扩散速度也不一样，所以在凝胶 中可以和抗血清形成数条沉淀线，每一条沉淀线即代表一种抗原成分。所以琼脂扩散反应除
实验九 沉淀反应 目的要求 1．了解沉淀反应在预防医学和兽医学中的意义。 2．初步掌握炭疽沉淀原的制备和环状沉淀反应，琼脂扩散反应的操作方法。 原理 将可溶性抗原与相应的抗体混合，在适量电解质存在下，经过一定时间，即可形 成肉眼可见的沉淀物，称为沉淀反应。参与沉淀反应的抗原称为沉淀原，抗体称为沉淀素。 沉淀反应通常都是利用已知抗体检查未知抗原，以诊断传染病。但也用于以已知的抗原 测定未知的抗体，以测定免疫血清的效价和诊断疫病。 操作步骤 一、环状沉淀反应（以炭疽为例） 将含有抗原的透明浸出液重叠于含有抗体的免疫血清上，在两液交界处发生环状的白色 沉淀物，即称为环状沉淀反应。 炭疽环状沉淀反应又称为阿斯可里（Ascoli）氏反应。具体操作方法如图实 9-1 所示。 （一）沉淀原的制备 1．热浸法 取被检材料（如各种实质脏器、血液、渗出液等）1～3g，在乳钵内研碎， 然后加 5～10 倍生理盐水混合，用移液管吸至试管内，置于水浴锅中煮沸 15～30 分钟，用 中性石棉过滤，获得的透明滤液，即为被检的沉淀原。如果过滤液混浊不透明，可再过滤— 次。 2．冷浸法 用以检查怀疑为炭疽病畜的皮革和兽毛等材料，操作前，先将其高压灭菌 30 分钟，以保证检查者的安全。然后取被检材料 1g，浸于 5～10 倍的 0.5％石炭酸生理盐水 中，在室温下或普通冰箱浸泡 14～20 小时，用中性石棉过滤，透明的滤液即为沉淀原。 （二）方法与判定 用毛细吸管吸取少量炭疽沉淀素血清，沿管壁徐徐注入沉淀反应管内，通常达管的 1/3 高处，再用另一支毛细吸管吸取制备的沉淀原，沿管壁缓慢注入，使之重叠于炭疽沉淀素血 清上面，达到试管的 2/3 高处（注意！不 要发生气泡或摇动）。直立静置，在 1～5 分钟内，两液面交界处若出现清晰、整齐 的环状白轮，则为阳性。 为了验证反应的正确性，检验时可做 如下三种对照试验； 1．炭疽沉淀素血清加标准炭疽沉淀 原，应为阳性； 2．标准炭疽沉淀原加健康马血清，应 为阴性； 3．生理盐水加炭疽沉淀素血清，应为 阴性。 二、琼脂扩散沉淀反应（以炭疽为例） 抗原、抗体在含有电解质的琼脂凝胶基质中可以向四周自由扩散，如果二者是相应的具 有特异性，则在—定部位相遇，并发生反应，出现肉眼可见的白色沉淀线。此种反应为琼脂 扩散沉淀反应。 由于一种抗原可能含有数种抗原成分，因而在凝胶中的扩散速度也不一样，所以在凝胶 中可以和抗血清形成数条沉淀线，每一条沉淀线即代表一种抗原成分。所以琼脂扩散反应除 图 9-1 炭疽沉淀反应操作方法图解
用作微生物的鉴定、疾病诊断外，还可用作抗原成分的分析。该反应的操作方法如下： (一)琼脂凝胶的制备 1.取精制琼脂 11.2g ,放入100ml含1/万硫柳汞的磷酸缓冲液(PBS)或硼酸 缓冲液(BBS)中，水浴加热融化混匀。 2.融化后以两层纱布夹薄层脱脂棉过滤，除去不溶性杂质。 3.将直径90mm的洁净平皿放在平台上。每平皿倒入热的琼脂15~18毫升，厚度约 25mm左右。注意不要产生气泡，冷磊后加盖，扣平皿倒置，防止水分蒸发，放在普通冰 箱中可保存2周左 4.将琼脂平】 放于事先绘制好的图案上，用打孔器照图案打孔，外周孔径为6mm,中 央孔径为4mm,孔间距3mm,见图9-2。 (三)加样与判定 打孔后用琼脂写字墨水，在琼脂板上端写上日期及编号等。 ①② 在中央孔加入标准炭疽沉淀原，在外周孔1、2、3、4，各加炭 疽沉淀素血清至孔满为止。 中液体吸 皿倒置以 @'O]⊙ 防水分蒸发：将琼脂板放入铺有数层湿纱布的带盖搏瓷盘中， 置15~30℃室温或37℃恒温箱中，24小时后，即可出现较粗的 ⑤⊙ 白色明显的沉淀线。 图92琼脂扩散反应图 若用琼脂扩散反应诊断传染病，测是往中央孔滴加被松 血清1滴（约0.025~0.05ml),在周围孔滴加不同浓度的 原各1滴，放湿盒中静置于室温下或37℃恒温箱中2一5天，观察结果。若阳性反应，则名 抗原与抗体孔之间出现1~2条或多条白色沉淀线。阴性者，则无白色沉淀线
用作微生物的鉴定、疾病诊断外，还可用作抗原成分的分析。该反应的操作方法如下： （一）琼脂凝胶的制备 1. 取精制琼脂干粉 1～1.2g，放入 100ml 含 1／万硫柳汞的磷酸缓冲液（PBS）或硼酸 缓冲液（BBS）中，水浴加热融化混匀。 2．融化后以两层纱布夹薄层脱脂棉过滤，除去不溶性杂质。 3．将直径 90mm 的洁净平皿放在平台上。每平皿倒入热的琼脂 15～18 毫升，厚度约 2.5mm 左右。注意不要产生气泡，冷凝后加盖，把平皿倒置，防止水分蒸发，放在普通冰 箱中可保存 2 周左右。 4．将琼脂平皿放于事先绘制好的图案上，用打孔器照图案打孔，外周孔径为 6mm，中 央孔径为 4mm，孔间距 3mm，见图 9-2。 （三）加样与判定 打孔后用琼脂写字墨水，在琼脂板上端写上日期及编号等。 在中央孔加入标准炭疽沉淀原，在外周孔 1、2、3、4，各加炭 疽沉淀素血清至孔满为止。待孔中液体吸干后，将平皿倒置以 防水分蒸发；将琼脂板放入铺有数层湿纱布的带盖搪瓷盘中， 置 15～30℃室温或 37℃恒温箱中，24 小时后，即可出现较粗的 白色明显的沉淀线。 若用琼脂扩散反应诊断传染病，则是往中央孔滴加被检 血清 1 滴（约 0.025～0.05ml），在周围孔滴加不同浓度的抗 原各 1 滴，放湿盒中静置于室温下或 37℃恒温箱中 2～5 天，观察结果。若阳性反应，则在 抗原与抗体孔之间出现 1～2 条或多条白色沉淀线。阴性者，则无白色沉淀线。 图 9-2 琼脂扩散反应图