实验五真菌的分离培养及形态观察 真菌分离培养应考虑所分离真茵的特性，配制合适的培养基，选择所需的气体环境。同 时，由于真菌分离材料常污染有大量细菌，所以可在培养基中加入抗菌素并在分离培养过程 中严格执行无南操作。 目的要求 .2. 掌握真菌分离培养方法。 认识真菌茵落的特征，比较与细菌菌落有何不同 3.了解真菌载片培养法。 4.掌握观察真菌的基本方法，并观察其形态特征。 操作步骤 、真菌的分高培养方法 平板划线分离法 1.取适合真菌的琼脂培养基融化，冷至45℃，注入无菌平皿中，每皿15~20ml,制 成平板待用。 2.取要分离的材料（如田土、混杂的或污染的真茵培养物、真菌）少许，投入盛无菌 水的试管内，振摇，使分离菌悬浮于水中。 3.将接种环经火焰灭菌并冷却后，蘸取上述菌悬浮液，进行平板划线（同细菌的划线法）： 4.划线完毕，置温箱中培养2一5d,待长出菌落后，钓取可疑单个菌落先作制片检查 若只有一种所需要的真菌生长，即可进行钓菌纯培养。如有杂菌可从单个菌落中钓少许菌制 成悬液，再作划线分离培养，有时需反复多次，才得纯种。另外，也可在放大镜的观察下， 用无蘭极子夹取一段待分离的真菌南丝，直接放在平板上作分离培养，可获得该种直蘭的纯 培兼 (二)稀释分高法 1.取盛有无茵水的试管5支（每管9ml),分别标记1、2、3、4、5号。取样品（如田 土等)1g,投入1号管内，振摇，使悬浮均匀。 2.用1ml灭菌吸管，按无菌操作法，从1号管中吸取1ml悬浮液注入2号管中，并摇 匀：同样由2号管取1l至3号管依此类推。直至5号管。注意每稀释一管应更换一支 灭菌吸管 3.用2支无菌吸管分别由4号、5号试管中各取1ml悬液，并分别注入2个灭菌培养 皿中，再加入融化后冷至45℃的琼脂培养基约15ml,轻轻在桌面上摇转，静置，使冷凝成 平板。然后倒置温箱中培养，2~5d后，从中挑选单个菌落，并移植于斜面上。 二，真萌培养性状观察 (一)真菌在周体培养基上的生长表现 1酵母菌茵落：酵母菌在固体培养基上多呈油脂状或蜡脂状，表面光滑、湿润、黏稠 有的表面呈粉粒状、粗糙或皱褶。菌落边缘有整齐、缺损或带丝状。菌落颜色有乳白色、黄 色或红色等。 2.霉菌菌落：将不同霉菌在固体培养基上培养2一5d,可见霉菌菌落呈绒毛状、絮状 蜘蛛网状等。菌落大小依种而异，有的能扩展到整个固体培养基，有的有一定的局限性（直 径1~2mm或更小)。 很多霉菌的孢子能产生色素，致使茵落表面、背面甚至培养基呈现不 同的颜色，如黄色、绿色、青色、黑色、橙色等。 (二)真菌在液体培养基中的生长表现 1,酵母菌注意观察其混浊度、沉淀物及表面生长性状等
实验五 真菌的分离培养及形态观察 真菌分离培养应考虑所分离真菌的特性，配制合适的培养基，选择所需的气体环境。同 时, 由于真菌分离材料常污染有大量细菌，所以可在培养基中加入抗菌素并在分离培养过程 中严格执行无菌操作。 目的要求 1．掌握真菌分离培养方法。 2．认识真菌菌落的特征，比较与细菌菌落有何不同。 3．了解真菌载片培养法。 4．掌握观察真菌的基本方法，并观察其形态特征。 操作步骤 —、真菌的分离培养方法 （－）平板划线分离法 1．取适合真菌的琼脂培养基融化，冷至 45℃，注入无菌平皿中，每皿 15～20ml，制 成平板待用。 2．取要分离的材料（如田土、混杂的或污染的真菌培养物、真菌）少许，投入盛无菌 水的试管内，振摇，使分离菌悬浮于水中。 3．将接种环经火焰灭菌并冷却后，蘸取上述菌悬浮液，进行平板划线(同细菌的划线法)。 4．划线完毕，置温箱中培养 2～5d，待长出菌落后，钓取可疑单个菌落先作制片检查， 若只有一种所需要的真菌生长，即可进行钓菌纯培养。如有杂菌可从单个菌落中钓少许菌制 成悬液，再作划线分离培养，有时需反复多次，才得纯种。另外，也可在放大镜的观察下， 用无菌镊子夹取一段待分离的真菌菌丝，直接放在平板上作分离培养，可获得该种真菌的纯 培养。 （二）稀释分离法 1．取盛有无菌水的试管 5 支（每管 9ml），分别标记 1、2、3、4、5 号。取样品（如田 土等）1g，投入 1 号管内，振摇，使悬浮均匀。 2．用 1ml 灭菌吸管，按无菌操作法，从 1 号管中吸取 1ml 悬浮液注入 2 号管中，并摇 匀；同样由 2 号管取 1ml 至 3 号管，依此类推，直至 5 号管。注意每稀释一管应更换一支 灭菌吸管。 3．用 2 支无菌吸管分别由 4 号、5 号试管中各取 1ml 悬液，并分别注入 2 个灭菌培养 皿中，再加入融化后冷至 45℃的琼脂培养基约 15ml，轻轻在桌面上摇转，静置，使冷凝成 平板。然后倒置温箱中培养，2～5d 后，从中挑选单个菌落，并移植于斜面上。 二．真菌培养性状观察 （一）真菌在固体培养基上的生长表现 1 .酵母菌菌落：酵母菌在固体培养基上多呈油脂状或蜡脂状，表面光滑、湿润、黏稠， 有的表面呈粉粒状、粗糙或皱褶。菌落边缘有整齐、缺损或带丝状。菌落颜色有乳白色、黄 色或红色等。 2. 霉菌菌落：将不同霉菌在固体培养基上培养 2～5d，可见霉菌菌落呈绒毛状、絮状、 蜘蛛网状等。菌落大小依种而异，有的能扩展到整个固体培养基，有的有一定的局限性（直 径 1～2mm 或更小）。很多霉菌的孢子能产生色素，致使菌落表面、背面甚至培养基呈现不 同的颜色，如黄色、绿色、青色、黑色、橙色等。 （二）真菌在液体培养基中的生长表现 1. 酵母菌 注意观察其混浊度、沉淀物及表面生长性状等
2.霉菌霉菌在液体培养基中生长，一般都在表面形成菌层，且不同的霉菌有不同的 形态和颜色 三。真菌的形态观察 真菌水没片的制备及观察 常用美兰染色液制备真菌水浸片来观察真菌的菌体形态，并且活细胞能还原美蓝为无 色，故可区别死细胞、活细胞。 1.酵母菌水浸片的制备 将美 兰染色液 滴滴加在干净的载玻片中央，如不染色则加蒸馏水 一滴，用接触环以无 菌操作取培养48h左右的酵母菌体少许，在液滴中轻轻涂抹均匀（液体培养物可直接取一接 种环培养液于玻片上)并加盖干净盖玻片。为避免产生气泡，应先将其一边接触液滴，再慢 慢放下盖片。然后置于显微镜载物台上进行观察，注意酵母菌的形态、大小和芽体，同时可 以根据是否染上颜色来区别死、活细胞。 2.霉菌水浸片 在干净载玻片上加蒸馏水或美兰染色液一滴。取培养2一5d的根霉或毛霉、培养3~5d 的曲霉、青霉或木霉、培养2d左右的白地霉同上法制片。霉菌要选择有无性孢子的菌体 用解别针桃取少量菌丝体放在载玻片的液滴中，将玻片置于解剖镜下，细心地用解剂针将萧 丝体分散成自然状态，然后加盖玻片，注意不要让其产生气泡，盖后不再移动玻片，以免弄 乱菌丝。制好片后，就可以在显微镜下观察。 观察时注意它们的菌丝有 无隔膜、孢子囊柄与分生孢子柄的形状、分生孢子小梗的若生 方式、孢子囊的形态、足细胞与假根的有无、孢子囊孢子和分生孢子的形状和颜色、节孢子 的形状和特点等。并且要区别根霉与毛霉、青霉、曲霉、木霉之间的异同点以及白地霉的特 点。 (二)蛋黄封闭标本的名 霉菌的封闭标本，常用乳酸石炭酸液封片，其中含有的甘油使标本不宜干燥，而石炭酸 又有防腐作用。在封片液中，还可加入棉蓝或其它酸性染料，以便于观察菌体 在洁净载玻片上滴一滴乳酸石炭酸棉蓝染色液，用解剖针从霉菌菌落的边缘处取少许带 有孢子的菌丝于染液中，再细心地把菌丝挑成自然状态，然后用盖玻片盖上，注意不要产生 气泡。在温暖干燥室内放数日，让水分蒸发一部分，使盖玻片与载玻片紧贴，即可封片。封 片时，先用清洁的纱布或脱脂棉将盖玻片四周擦净，并在盖玻片周围涂一圈加拿大树胶或合 成树胶，风干后即成封闭标本 (三)真菌的载片培养 真菌的载片培养法不仅可克服水浸片制片的困难，还可使对菌丝分枝和孢子着生状态的 观察获得更满意的效果 取直径门cm左右圆形滤纸一张，铺放于一个直轻9em 的平皿底部（图5-1），上放一U形玻棒，其上再 放一张干净的载玻片与一张盖玻片， 盖好平皿盖进 行灭菌。挑取真菌孢子接入盛有灭菌水的试管中， 摇振试管制成孢子悬液备用。用灭菌滴管吸取灭湖 后融化的真菌固体培养基少许，滴于上述灭菌平皿 内的载玻片中央，并以接种环将孢子悬液接种在培 图5-1真南的载片培养 养基四周，加上盖玻片，并轻轻压贴一下。 为防1 L培养皿：2U形玻棒：3.滤纸 培养过程中培养基干燥，可在滤纸上滴加灭菌20% 甘油液3~4ml,然后盖上平皿盖，即成所谓湿室载 4载玻片：5.盖玻片：6.固体培养基 片培养。放在适宜温度（多数真菌为20一30℃）的
2. 霉菌 霉菌在液体培养基中生长，一般都在表面形成菌层，且不同的霉菌有不同的 形态和颜色。 三． 真菌的形态观察 （一）真菌水浸片的制备及观察 常用美兰染色液制备真菌水浸片来观察真菌的菌体形态，并且活细胞能还原美蓝为无 色，故可区别死细胞、活细胞。 1. 酵母菌水浸片的制备 将美兰染色液一滴滴加在干净的载玻片中央，如不染色则加蒸馏水一滴，用接触环以无 菌操作取培养 48h 左右的酵母菌体少许，在液滴中轻轻涂抹均匀（液体培养物可直接取一接 种环培养液于玻片上）并加盖干净盖玻片。为避免产生气泡，应先将其一边接触液滴，再慢 慢放下盖片。然后置于显微镜载物台上进行观察，注意酵母菌的形态、大小和芽体，同时可 以根据是否染上颜色来区别死、活细胞。 2. 霉菌水浸片的制备 在干净载玻片上加蒸馏水或美兰染色液一滴。取培养 2～5d 的根霉或毛霉、培养 3～5d 的曲霉、青霉或木霉、培养 2d 左右的白地霉同上法制片。霉菌要选择有无性孢子的菌体， 用解剖针挑取少量菌丝体放在载玻片的液滴中，将玻片置于解剖镜下，细心地用解剖针将菌 丝体分散成自然状态，然后加盖玻片，注意不要让其产生气泡，盖后不再移动玻片，以免弄 乱菌丝。制好片后，就可以在显微镜下观察。 观察时注意它们的菌丝有无隔膜、孢子囊柄与分生孢子柄的形状、分生孢子小梗的着生 方式、孢子囊的形态、足细胞与假根的有无、孢子囊孢子和分生孢子的形状和颜色、节孢子 的形状和特点等。并且要区别根霉与毛霉、青霉、曲霉、木霉之间的异同点以及白地霉的特 点。 （二）霉菌封闭标本的制备 霉菌的封闭标本，常用乳酸石炭酸液封片，其中含有的甘油使标本不宜干燥，而石炭酸 又有防腐作用。在封片液中，还可加入棉蓝或其它酸性染料，以便于观察菌体。 在洁净载玻片上滴一滴乳酸石炭酸棉蓝染色液，用解剖针从霉菌菌落的边缘处取少许带 有孢子的菌丝于染液中，再细心地把菌丝挑成自然状态，然后用盖玻片盖上，注意不要产生 气泡。在温暖干燥室内放数日，让水分蒸发一部分，使盖玻片与载玻片紧贴，即可封片。封 片时，先用清洁的纱布或脱脂棉将盖玻片四周擦净，并在盖玻片周围涂一圈加拿大树胶或合 成树胶，风干后即成封闭标本。 （三）真菌的载片培养 真菌的载片培养法不仅可克服水浸片制片的困难，还可使对菌丝分枝和孢子着生状态的 观察获得更满意的效果。 取直径7cm左右圆形滤纸一张，铺放于一个直径9cm 的平皿底部（图 5-1），上放一 U 形玻棒，其上再平 放一张干净的载玻片与一张盖玻片，盖好平皿盖进 行灭菌。挑取真菌孢子接入盛有灭菌水的试管中， 摇振试管制成孢子悬液备用。用灭菌滴管吸取灭菌 后融化的真菌固体培养基少许，滴于上述灭菌平皿 内的载玻片中央，并以接种环将孢子悬液接种在培 养基四周，加上盖玻片，并轻轻压贴一下。为防止 培养过程中培养基干燥，可在滤纸上滴加灭菌 20％ 甘油液 3～4ml，然后盖上平皿盖，即成所谓湿室载 片培养。放在适宜温度（多数真菌为 20～30℃）的 图 5-1 真菌的载片培养 1.培养皿；2.U 形玻棒；3.滤纸； 4.载玻片；5.盖玻片；6.固体培养基
培养箱内培养，定期取出在低倍镜下观察，可以看到孢子萌发、发芽管的长出、菌丝的生长、 无隔菌丝中孢子囊柄与孢子囊孢子形成的过程、有隔菌丝上足细胞生长、锁状联合的发生、 孢子着生状态等
培养箱内培养，定期取出在低倍镜下观察，可以看到孢子萌发、发芽管的长出、菌丝的生长、 无隔菌丝中孢子囊柄与孢子囊孢子形成的过程、有隔菌丝上足细胞生长、锁状联合的发生、 孢子着生状态等