实验六细菌的生化试验 目的要求 1.通过本试验加深对细菌生化反应原理和意义的理解： 2.掌握常规细菌生化试验操作方法。 操作步骤 一、糖类发酵（分解）试验 原理：细菌含有分解不同糖 (醇、苷)类的酶，因而分解各种糖（醇、苷）类的能力也 不一样。有些细菌分解某些糖（醇、苷）产酸（符号：+、产气（符号：O),培养基由兰 变黄（指示剂澳麝香草酚兰由兰遇酸变黄的结果），并有气泡：有些产酸，仅培养基变黄： 有些不分解糖类（符号：一），培养基仍为兰色。 (一)活用于需氧南的方法 培养基用邓亭氏(D 1)蛋白胨水溶液（蛋白胨1g,氯化销0， 100m pH7.6 按05一%的比例分别加人各种精，每00m加入2加的02溴醇香时蓝或用16肠 溴甲酚紫酒精溶液0.1ml)作指示剂。分装于试管（每一个试管事先都加有一枚倒立的小发 酵管)，10磅高压灭菌10分钟。 如在培养基中加入琼脂达0.5一0.7%，则成半固体，可省去倒立的小发酵管。 0,2%溴器香草酚蓝溶液配法： 淚麝香草酚蓝 02g 0.IN NaOH 5ml 蒸馏水 95ml 方法：从琼脂斜面的纯培养物上，用接种环取少量被检细菌接种于糖发酵管培养基中（如 为半固体，应穿刺)，在37℃培养， 一般观察2一3天，观察时用上述符号标记之。 (二)适用于厌氧菌的方法 培养基： 蛋白陈 20g 氯化钠 动形 1.6%溴甲酚紫酒精溶液1ml 10g 硫乙醇酸钠 12 蒸馏水 1000ml 将陈、盐、硫乙醇酸钠、琼脂和水放于烧瓶内，加热使融化，再加入所需的糖，调整 pH到7.0，加入指示剂， 分装试管，在10磅高压灭菌15分钟后，做成高层。 方法将厌氧菌的培养物用穿刺接种法接种于上述培养基的深部，于37℃培养。结果 观察同需氧菌。 二、V一P试验（二乙酰试验） 原理：某些细菌能从葡萄糖·丙酮酸·乙酰甲基甲醇(Acetymethyl carbinol)→2,3- 2,3-bytavlene cy小ycol),在有碱存在时氧化成二乙酰，后者和陈中的胍基 起作用，产生粉 合物。其反应式为： 2CH;COCOOH -CHCOCHOHCH十2C0: 丙酮酸 乙酰甲基甲醇 -2H CHsCHOHCHOHCH KOH CH;COCOCH
实验六 细菌的生化试验 目的要求 1．通过本试验加深对细菌生化反应原理和意义的理解； 2．掌握常规细菌生化试验操作方法。 操作步骤 一、糖类发酵（分解）试验 原理：细菌含有分解不同糖（醇、苷）类的酶，因而分解各种糖（醇、苷）类的能力也 不一样。有些细菌分解某些糖（醇、苷）产酸（符号：+）、产气（符号：○），培养基由兰 变黄（指示剂溴麝香草酚兰由兰遇酸变黄的结果），并有气泡；有些产酸，仅培养基变黄； 有些不分解糖类（符号：－），培养基仍为兰色。 （一）适用于需氧菌的方法 培养基 用邓亨氏（Dunham）蛋白胨水溶液（蛋白胨 1g，氯化钠 0.5g，水 100ml，pH7.6 按 0.5～1％的比例分别加入各种糖），每 100ml 加入 1.2ml 的 0.2％溴麝香草酚蓝（或用 1.6％ 溴甲酚紫酒精溶液 0.1ml）作指示剂。分装于试管（每一个试管事先都加有一枚倒立的小发 酵管），10 磅高压灭菌 10 分钟。 如在培养基中加入琼脂达 0.5～0.7％，则成半固体，可省去倒立的小发酵管。 0.2％溴麝香草酚蓝溶液配法： 溴麝香草酚蓝 0.2g 0.1N NaOH 5ml 蒸馏水 95ml 方法：从琼脂斜面的纯培养物上，用接种环取少量被检细菌接种于糖发酵管培养基中（如 为半固体，应穿刺），在 37℃培养，一般观察 2～3 天，观察时用上述符号标记之。 （二）适用于厌氧菌的方法 培养基： 蛋白胨 20g 氯化钠 5g 琼脂 1g 1.6％溴甲酚紫酒精溶液 1ml 糖 10g 硫乙醇酸钠 1g 蒸馏水 1000ml 将胨、盐、硫乙醇酸钠、琼脂和水放于烧瓶内，加热使融化，再加入所需的糖，调整 pH 到 7.0，加入指示剂，分装试管，在 10 磅高压灭菌 15 分钟后，做成高层。 方法 将厌氧菌的培养物用穿刺接种法接种于上述培养基的深部，于 37℃培养。结果 观察同需氧菌。 二、V－P 试验（二乙酰试验） 原理：某些细菌能从葡萄糖→丙酮酸→乙酰甲基甲醇（Acetymethyl carbinol）→2，3- 丁烯二醇（2，3-bytaylene cylycol），在有碱存在时氧化成二乙酰，后者和胨中的胍基化合物 起作用，产生粉红色的化合物。其反应式为： 2CH3COCOOH——→CH3COCHOHCH3 十 2CO2 丙酮酸 乙酰甲基甲醇 CH3CHOHCHOHCH3 → − KOH 2H CH3COCOCH3
2,3丁烯二醇 丁二酮（二乙酰） 乙酰甲基甲醇 丁二酮（二乙酰） O=C-CH, HN-CNCCH. O=C-CH, +HN-CNH, N=C-CH; 丁二丽 胍基 红色化合物 培养基：含葡萄糖、KHPO4、蛋白陈各5g,完全溶解于1000ml水中后，分装试管内， 间歇灭菌或10磅10分钟灭菌。 方法： 1.O’Mea’g法 ●将被检细氯氧化钾溶于100m1蒸富水中，加入03巴型成 接种 于葡萄糖蛋白胨水培养后， 于3 一37℃培养48小时，于每毫升培养物 中加入0.1ml,猛烈摇振混合。 2.Baritt's法 试剂：6%ā-奈酚酒精溶液为甲液，40%氢氧化钾为乙液。 同上法接种培养细菌，于2ml培养液内加入甲液1ml和乙液0.4毫升，摇振混合。 试验时强阳性者约于5分钟后，可产生粉红色反应（长时间无反应，置室温过夜），次 日不变者为阴性 三、甲基红(M.R.)试验 原理：某些细菌在糖代谢过程中生成丙酮酸，有的甚至进一步被分解为甲酸、乙酸、乳 酸等，而不是生成V一P试验中的二乙酰，从而使培养基的DH下降至45或以下(V一P试 验的培养物pH常在45以上)，故加入甲基红试剂呈红色。本试验常与V一P试验一起使用， 因为前者呈阳性的细菌， 后者通常为阴性 培养基：同V一P试验培养基。 甲基红指示剂：0.1g甲基红溶于300ml95%酒精中，再加入蒸馏水200ml。 方法：接种细菌于培养液中，37℃培养2~7天后，于培养物中加入几滴试剂，变红色 者为阳性反应。 四、淀粉水解试验 原理：细菌如产生淀粉酶可将淀粉分解为糖类，在培养基上滴加碘液，可在菌落周围出 现透明区。 淀粉琼脂培养基： pH76的肉浸汤琼脂 90ml 无菌羊血清（只对不易生长的细菌才加） 5ml 无菌3%淀粉溶液 10m 将琼脂加热融化，冷却到45℃，加入淀粉溶液及羊血清，混匀后，倾注平板。 方法：将细菌划线接种于上述平板上，在37℃培养24小时。生长后取出，在菌落处滴 加革兰氏碘液少许，观察。 结果：培养基呈深蓝色，能水解淀粉的细菌及其茵落周围有透明的环 五、枸酸盐利用试验 原理：当细菌利用铵盐作为唯一氮源，并利用枸橼酸盐作为唯一碳源时，可在枸欖酸盐 培养基上生长，生成碳酸钠，并同时利用铵盐生成氢，使培养基呈碱性。 方法1：
2，3-丁烯二醇 丁二酮（二乙酰） 培养基：含葡萄糖、K2HPO4、蛋白胨各 5g，完全溶解于 1000ml 水中后，分装试管内， 间歇灭菌或 10 磅 10 分钟灭菌。 方法： 1．O’Meara’s 法 试剂：40g 氢氧化钾溶于 100ml 蒸馏水中，加入 0.3g 肌酐即成。 将被检细菌接种于葡萄糖蛋白胨水培养后，于 35～37℃培养 48 小时，于每毫升培养物 中加入 0.1ml，猛烈摇振混合。 2．Baritt’s 法 试剂：6％α-奈酚酒精溶液为甲液，40％氢氧化钾为乙液。 同上法接种培养细菌，于 2ml 培养液内加入甲液 1ml 和乙液 0.4 毫升，摇振混合。 试验时强阳性者约于 5 分钟后，可产生粉红色反应（长时间无反应，置室温过夜），次 日不变者为阴性。 三、甲基红（M．R．）试验 原理：某些细菌在糖代谢过程中生成丙酮酸，有的甚至进一步被分解为甲酸、乙酸、乳 酸等，而不是生成 V－P 试验中的二乙酰，从而使培养基的 pH 下降至 4.5 或以下（V－P 试 验的培养物 pH 常在 4.5 以上），故加入甲基红试剂呈红色。本试验常与 V－P 试验一起使用， 因为前者呈阳性的细菌，后者通常为阴性。 培养基：同 V－P 试验培养基。 甲基红指示剂：0.1g 甲基红溶于 300ml95％酒精中，再加入蒸馏水 200ml。 方法：接种细菌于培养液中， 37℃培养 2～7 天后，于培养物中加入几滴试剂，变红色 者为阳性反应。 四、淀粉水解试验 原理：细菌如产生淀粉酶可将淀粉分解为糖类，在培养基上滴加碘液，可在菌落周围出 现透明区。 淀粉琼脂培养基： pH7.6 的肉浸汤琼脂 90ml 无菌羊血清（只对不易生长的细菌才加） 5ml 无菌 3％淀粉溶液 10ml 将琼脂加热融化，冷却到 45℃，加入淀粉溶液及羊血清，混匀后，倾注平板。 方法：将细菌划线接种于上述平板上，在 37℃培养 24 小时。生长后取出，在菌落处滴 加革兰氏碘液少许，观察。 结果：培养基呈深蓝色，能水解淀粉的细菌及其菌落周围有透明的环。 五、枸橼酸盐利用试验 原理：当细菌利用铵盐作为唯一氮源，并利用枸橼酸盐作为唯一碳源时，可在枸橼酸盐 培养基上生长，生成碳酸钠，并同时利用铵盐生成氢，使培养基呈碱性。 方法 1：
Simmons氏培养基： 柠檬酸钠 g K2HPO 硫酸镁 0.2g 氯化钠 琼脂（洗过） NH.H2PO. g 1%溴麝香草酚蓝酒精溶液 10m 蒸馏水 加至1,000m 调整pH至6.8,15磅15分钟高压灭菌后制成斜面。 将上述培养基中的琼脂省去，制成液体培养基，同样可以应用。将被检细菌少量接种到 培养基中，37℃培养2~4日，培养基变蓝色者为阳性，不变者为阴性。 方法2： Christenten氏培养基 柠檬酸钠 5g KH2PO4 葡萄糖 0.2g 化钠 酚 胱氨酸 0.1g 琼脂 158g 酵母浸膏 0.5g 求馏水加至 1000m 有的配方尚加柠檬酸铁铵0.4 硫代硫酸钠0.08g PH不必调整。高压灭茵后做成短厚的斜面。接种时先划线后穿刺，瓣有于37℃观察七 天。阳性者培养基变红色，阴性者培养基仍为黄色。 大、明哚试验 原理：细菌分解蛋白陈中的色氨酸。生成明哚（靛基质），经与试剂中的对位一甲基氨 基苯甲醛作用，生成玫瑰吲哚 培养基。 邓亨氏蛋白胨溶液同（一）] 试剂：常用下述两种。 1.欧立希氏(Ebrlich's)吲引哚试剂 对位二甲基氨基苯甲醛(P-dimethyl aminobenzaldehyde) 1g 纯乙脑 95ml 浓盐酸 20m 先以乙醇溶解试剂，后加盐酸，要避光保存。 2.Kovacs试剂 对位二甲基氨基苯甲醛 戊醇（聚异戊醇） 浓盐酸 25ml
Simmons 氏培养基： 柠檬酸钠 lg K2HPO4 lg 硫酸镁 0.2g 氯化钠 5g 琼脂（洗过） 20g NH4H2PO4 1g 1％溴麝香草酚蓝酒精溶液 10ml 蒸馏水 加至 1，000ml 调整 pH 至 6.8，15 磅 15 分钟高压灭菌后制成斜面。 将上述培养基中的琼脂省去，制成液体培养基，同样可以应用。将被检细菌少量接种到 培养基中， 37℃培养 2～4 日，培养基变蓝色者为阳性，不变者为阴性。 方法 2： Christenten 氏培养基： 柠檬酸钠 5g KH2PO4 1g 葡萄糖 0.2g 氯化钠 5g 酚红 0.012g 半胱氨酸 0.1g 琼脂 15g 酵母浸膏 0.5g 蒸馏水加至 1000ml 有的配方尚加柠檬酸铁铵 0.4g，硫代硫酸钠 0.08g。 PH 不必调整。高压灭菌后做成短厚的斜面。接种时先划线后穿刺，孵育于 37℃观察七 天。阳性者培养基变红色，阴性者培养基仍为黄色。 六、吲哚试验 原理：细菌分解蛋白胨中的色氨酸，生成吲哚（靛基质），经与试剂中的对位二甲基氨 基苯甲醛作用，生成玫瑰吲哚。 培养基：邓亨氏蛋白胨溶液[同（一）] 试剂：常用下述两种。 1．欧立希氏（Ebrlich′s）吲哚试剂 对位二甲基氨基苯甲醛（P-dimethyl aminobenzaldehyde） 1g 纯乙醇 95ml 浓盐酸 20ml 先以乙醇溶解试剂，后加盐酸，要避光保存。 2．Kovacs 试剂 对位二甲基氨基苯甲醛 5g 戊醇（聚异戊醇） 75g 浓盐酸 25ml
+NH:+CHCOCOOH N《CH.), N(CH) 对 方法：以接种环接种待试细菌的新鲜斜面培养物于邓亨氏蛋白陈溶液中，37℃培养 24~48小时后（可延长4~5天）。于培养液中加入戊醇或二甲苯2~3ml,摇匀，静置片刻 后，沿试管壁加入试剂2毫升。在戊醇或二甲苯下面的液体变红色者为阳性反应。 也可将一指头大的脱脂棉，滴上两滴欧立希氏试剂，再在同处加滴两滴高硫酸钾 (KS,0,)饱和水溶液，置于含培养液的被检试管中，离液面约半寸，置烧杯内水浴煮沸为 止，脱脂棉上出现红色为阳性。此法略繁，但省试剂且准确，因为将试剂加到液体中，吲引 和粪臭素均呈阳性，而用此法，只是吲哚（它能挥发）呈阳性反应。 亦可以滤纸片浸湿1%的二甲基苯丙烯甲醛的10%浓HC1溶液，然后以接种环刮取一环 琼脂的纯培养物涂布于该滤纸上。 细菌涂印周围呈蓝色者为阳性，细菌涂印周围无色泽变化或淡黄色者为阴性。 厌氧菌用蛋白胨水 蛋白陈 20g 葡萄糖 10g 硫乙醇酸钠 1g NazHPO:(无水) 琼脂 g 蒸馏水 1000ml 加热溶解，调整pH至7.4~7.6，过滤，分装小试管，15磅高压15分钟。 七、硫化氢试验 原理：有些细菌能分解含硫氨基酸，产生硫化氧(HS),HS会使培养基中的醋酸铅或 培养基： 肉汤琼脂 100ml 10%硫代硫酸钠溶液（新配）2.5ml 10%醋酸铅溶液 三种成份分别高压灭茵，前二者混合后待凉至60℃，加入醋酸铅溶液，混合均匀，无 菌分装试管达5~6cm高，立即浸入冷水中，使冷凝成琼脂高层。 方法：用接种针蘸取纯培养物，沿管壁作穿刺，孵有于37℃1~2天后观察，必要时可 延长5~7天。培养基变黑色者为阳性
方法：以接种环接种待试细菌的新鲜斜面培养物于邓亨氏蛋白胨溶液中， 37℃培养 24～48 小时后（可延长 4～5 天）。于培养液中加入戊醇或二甲苯 2～3ml，摇匀，静置片刻 后，沿试管壁加入试剂 2 毫升。在戊醇或二甲苯下面的液体变红色者为阳性反应。 也可将一指头大的脱脂棉，滴上两滴欧立希氏试剂，再在同处加滴两滴高硫酸钾 （K2S2O4）饱和水溶液，置于含培养液的被检试管中，离液面约半寸，置烧杯内水浴煮沸为 止，脱脂棉上出现红色为阳性。此法略繁，但省试剂且准确，因为将试剂加到液体中，吲哚 和粪臭素均呈阳性，而用此法，只是吲哚（它能挥发）呈阳性反应。 亦可以滤纸片浸湿 1%的二甲基苯丙烯甲醛的 10％浓 HCl 溶液，然后以接种环刮取一环 琼脂的纯培养物涂布于该滤纸上。 细菌涂印周围呈蓝色者为阳性，细菌涂印周围无色泽变化或淡黄色者为阴性。 厌氧菌用蛋白胨水 蛋白胨 20g 葡萄糖 10g 硫乙醇酸钠 1g Na2HPO4（无水） 2g 琼脂 1g 蒸馏水 1000ml 加热溶解，调整 pH 至 7.4～7.6，过滤，分装小试管，15 磅高压 15 分钟。 七、硫化氢试验 原理：有些细菌能分解含硫氨基酸，产生硫化氢（H2S），H2S 会使培养基中的醋酸铅或 氯化铁形成黑色的硫化铅或硫化铁。 方法 1：醋酸铅琼脂法 培养基： 肉汤琼脂 100ml 10％硫代硫酸钠溶液（新配） 2.5ml 10％醋酸铅溶液 3ml 三种成份分别高压灭菌，前二者混合后待凉至 60℃，加入醋酸铅溶液，混合均匀，无 菌分装试管达 5～6cm 高，立即浸入冷水中，使冷凝成琼脂高层。 方法：用接种针蘸取纯培养物，沿管壁作穿刺，孵育于 37℃ 1～2 天后观察，必要时可 延长 5～7 天。培养基变黑色者为阳性
或将细菌培养于肉汤、肝浸汤琼脂斜面或血清葡萄糖琼脂斜面，在试管的棉花塞下方挂 约6.5×0.6cm2的浸蘸饱和醋酸铅溶液(10g酯酸铅溶于50毫升沸蒸馏水中即成)且己干 燥的滤纸条，于37℃培养，观察7天，纸条变黑者为阳性结果 方法2：三化铁明胶培养基法 培养基 硫胨(Thiopeptone) 25g 明胶 120g 牛肉膏 7.5g 氯化钠 5g 蒸馏水加至 1000ml 上述成份灭菌后趁热加入5ml灭菌的10%氯化铁溶液。立即以无菌操作分装试管，达 5~6cm高，迅速冷凝成高层。 方法：穿刺接种，培养于37℃观察7天，培养基变黑色者为阳性 八、硝酸盐还原试验 原理：有的细菌能把硝酸盐还原为亚硝酸盐，而亚硝酸盐能和对氨基苯磺酸作用生成为 重氮基苯磺酸，且对重氮基苯磺酸与α-萘胺作用能生成红色的化合物Nα-萘胺偶氮苯磺 酸，其反应式为： NO,+HO,S-《NH:+H-→H0,S-《>-N=N+H,O 对氨基苯磺酸 对重氨基苯磺酸 HOS-N=N+ -NH -HO,S-N-N- -NH: 》 a一萘胺 N-a一蔡胺偶氮苯磺酸 (一)适用于需氧菌的方法 培养基： 硝酸钾（不含NO2- 0.2g 蛋白鹏 5g 蒸馏水 1000ml 溶解，调节pH至7.4，分装试管。每管约5毫升，15磅高压灭菌15分钟。 试剂： 甲液对位氨基苯磺酸 08e 5N酷酸溶液 100ml 乙液 a一葵胺 0.5g 5N醋酸溶液 100ml 方法： 接种细菌后37℃培养4天，沿管壁加入甲液二滴与乙液二滴，当时视察。阳性者立刻 呈红色。 (二)厌氧菌硝酸盐培养基法 培养基： 硝酸钾（不含NO2-,化学纯）1g
或将细菌培养于肉汤、肝浸汤琼脂斜面或血清葡萄糖琼脂斜面，在试管的棉花塞下方挂 一约 6.5×0.6cm2 的浸蘸饱和醋酸铅溶液（10g 醋酸铅溶于 50 毫升沸蒸馏水中即成）且已干 燥的滤纸条，于 37℃培养，观察 7 天，纸条变黑者为阳性结果。 方法 2：三氯化铁明胶培养基法 培养基： 硫胨（Thiopeptone） 25g 明胶 120g 牛肉膏 7.5g 氯化钠 5g 蒸馏水加至 1000ml 上述成份灭菌后趁热加入 5ml 灭菌的 10％氯化铁溶液。立即以无菌操作分装试管，达 5～6cm 高，迅速冷凝成高层。 方法：穿刺接种，培养于 37℃观察 7 天，培养基变黑色者为阳性。 八、硝酸盐还原试验 原理：有的细菌能把硝酸盐还原为亚硝酸盐，而亚硝酸盐能和对氨基苯磺酸作用生成对 重氮基苯磺酸，且对重氮基苯磺酸与α-萘胺作用能生成红色的化合物 N-α-萘胺偶氮苯磺 酸，其反应式为： 对氨基苯磺酸 对重氮基苯磺酸 （一）适用于需氧菌的方法 培养基： 硝酸钾（不含 NO2-） 0.2g 蛋白胨 5g 蒸馏水 1000ml 溶解，调节 pH 至 7.4，分装试管。每管约 5 毫升，15 磅高压灭菌 15 分钟。 试剂： 甲液 对位氨基苯磺酸 0.8g 5N 醋酸溶液 100ml 乙液 α—萘胺 0.5g 5N 醋酸溶液 100ml 方法： 接种细菌后 37℃培养 4 天，沿管壁加入甲液二滴与乙液二滴，当时观察。阳性者立刻 呈红色。 （二）厌氧菌硝酸盐培养基法 培养基： 硝酸钾（不含 NO2-，化学纯） 1g
磷酸氢二钠 2g 葡萄糖 1g 琼脂 g 蛋白鹏 20g 蒸馏水 1000ml 加热溶解，调整pH至7.2，过滤，分装试管，15磅高压灭菌15分钟。 方法：接种后作厌氧培养，试验方法和结果观密同上法，但培养12日即可 石蕊牛乳试验 ：紫乳 中的主要成分为干酪素、乳糖及指示剂等。由于各种细菌对这些成分 的作用不同，引起培养基的变化也有不同，观察的主要变化为： 产酸：主要从乳糖产生酸，指示剂变酸色（石蕊为红色，溴甲酚紫为黄色）。 酸凝或加有产气：产酸，并有牛乳的凝固(H4.7以下)：如有气体形成，则凝块中有 裂隙，在魏氏梭菌则呈“暴烈发酵” 生 很少或无酸 牛乳凝固 陈化：部分或大部分牛奶变清亮。 产碱：细菌产生蛋白酶可将干酪素分解产生胺或氨，使培养基的p山进一步升高，呈深 紫色。 培养基：加石蕊的酒精饱和溶液于新鲜脱脂牛奶中，使达浅紫色，分装于小试管，用流 动蒸汽灭茵，每天1次，每次1小时，共3天。接种细菌后，培养及观察一周 石蕊酒精溶液的制备：8g石蕊在30ml40%乙醇中研磨，吸出上清液，再如此用乙醇操 作两次。加40%乙醇到总量为100ml,并煮沸1分钟。取用上清液，必要时可加几滴1N盐 酸使达艳紫色。现在多应用溴甲酚紫代替石蕊，即于100ml脱脂乳中加入1.2ml的1.6%溴 甲酚紫的乙醇溶液。 方法：将细菌接种于紫乳培养基中，37℃培养1一7天后观察结果，根据细菌的种类不 同，可呈现上述 种或几种现象。 十、凝固血清液化试验 原理：有些细南产生胞外酶，可使凝固的血清液化，借此鉴别细菌。 吕氏血1清培养基：1%箱萄糖肉汤(H7.6)100毫升，无菌羊（牛、猪）血清300ml 混合后，分装于无菌试管，每管约5~ml,在血清凝固器内摆成斜面，间灭菌。 必1 天，80℃1小时，于37C过夜：第二天，85℃1小时，于37℃过夜：第三天，900 1小时，于37℃过夜。 弃去有污染的管。 方法与结果：将纯培养物在斜面上作划线接种，于37℃培养1周，观察培养基有无液 化。 十一、肉湾消化试 原理：有些细菌能够产生蛋白酶，消化肉渣。 熟肉基：即于pH7.4~7.6的牛肉汤中，于分装试管前，加入半指高的肉渣。液面上加 少量凡士林或液体石蜡，15磅高压灭菌30分钟。 方法：用无菌毛细玻管或接种环接种细菌后，用蜡笔于培养基的肉渣层上缘划一横线作 标记，在37℃培养几天，观察管内肉渣的高度有无变化，即可判定肉渣是否已被部分消化。 十二、明胶液化试 原理：有些细菌能产生分泌于细胞外的明胶醇，分解明胶为氨基酸，使半固体的明胶培 养基成为液体。 培养基：明胶培养基（见附录培养基27）
磷酸氢二钠 2g 葡萄糖 1g 琼脂 1g 蛋白胨 20g 蒸馏水 1000ml 加热溶解，调整 pH 至 7.2，过滤，分装试管，15 磅高压灭菌 15 分钟。 方法：接种后作厌氧培养，试验方法和结果观察同上法，但培养 1～2 日即可。 九、石蕊牛乳试验 原理：紫乳培养基中的主要成分为干酪素、乳糖及指示剂等。由于各种细菌对这些成分 的作用不同，引起培养基的变化也有不同，观察的主要变化为： 产酸：主要从乳糖产生酸，指示剂变酸色（石蕊为红色，溴甲酚紫为黄色）。 酸凝或加有产气：产酸，并有牛乳的凝固（pH4.7 以下）；如有气体形成，则凝块中有 裂隙，在魏氏梭菌则呈“暴烈发酵”。 凝乳酶产生：很少或无酸产生，牛乳凝固。 胨化：部分或大部分牛奶变清亮。 产碱：细菌产生蛋白酶可将干酪素分解产生胺或氨，使培养基的 pH 进一步升高，呈深 紫色。 培养基：加石蕊的酒精饱和溶液于新鲜脱脂牛奶中，使达浅紫色，分装于小试管，用流 动蒸汽灭菌，每天 1 次，每次 1 小时，共 3 天。接种细菌后，培养及观察一周。 石蕊酒精溶液的制备：8g 石蕊在 30ml40％乙醇中研磨，吸出上清液，再如此用乙醇操 作两次。加 40％乙醇到总量为 100ml，并煮沸 1 分钟。取用上清液，必要时可加几滴 1N 盐 酸使达艳紫色。现在多应用溴甲酚紫代替石蕊，即于 100ml 脱脂乳中加入 1.2ml 的 1.6％溴 甲酚紫的乙醇溶液。 方法：将细菌接种于紫乳培养基中，37℃培养 1～7 天后观察结果，根据细菌的种类不 同，可呈现上述一种或几种现象。 十、凝固血清液化试验 原理：有些细菌产生胞外酶，可使凝固的血清液化，借此鉴别细菌。 吕氏血清培养基：1％葡萄糖肉汤（pH7.6）100 毫升，无菌羊（牛、猪）血清 300ml， 混合后，分装于无菌试管，每管约 5～7ml，在血清凝固器内摆成斜面，间歇灭菌。 第一天，80℃ l 小时，于 37℃过夜；第二天，85℃1 小时，于 37℃过夜；第三天，90℃ 1 小时，于 37℃过夜。 弃去有污染的管。 方法与结果：将纯培养物在斜面上作划线接种，于 37℃培养 1 周，观察培养基有无液 化。 十一、肉渣消化试验 原理：有些细菌能够产生蛋白酶，消化肉渣。 熟肉基：即于 pH7.4～7.6 的牛肉汤中，于分装试管前，加入半指高的肉渣。液面上加 少量凡士林或液体石蜡，15 磅高压灭菌 30 分钟。 方法：用无菌毛细玻管或接种环接种细菌后，用蜡笔于培养基的肉渣层上缘划一横线作 标记，在 37℃培养几天，观察管内肉渣的高度有无变化，即可判定肉渣是否已被部分消化。 十二、明胶液化试验 原理：有些细菌能产生分泌于细胞外的明胶酶，分解明胶为氨基酸，使半固体的明胶培 养基成为液体。 培养基：明胶培养基（见附录 培养基 27）
方法1、明胶琼脂平板法可于普通琼脂加入1%明胶倾注平板后，分为四个区，每个风 分别划线接种一种被检菌，经24~48小时培养后，于培养基表面注入氯化汞溶液（氯化汞 12g,蒸馏水80ml,浓盐酸16ml),如细菌液化明胶，则在菌落周围出现透明带 方法2、将被检菌穿刺接种于明胶培养基，于20℃培养7天，逐日观察明胶液化现象： 如室温高，培养基自行溶化时，可与冰箱内放置30分钟，然后取出观察结果，不再凝固时 为阳性。 十三、尿老微试粉 原到 些细菌能产生尿素酶。尿素酶可分解尿素，产生大量的氨，使培养基的pH值 升高，反应式为 NHz-C-NH2+2H2O- 尿本南→(NH4)2CO1 >2NH3+CO2+H2O 培养基：应用Christenrsen氏培养基 蛋白陈 lg 萄萄糖 氯化钠 0.2%酚红溶液 琼脂 20g 蒸馏水加至 1000ml 调整pH至6.9。需生长因子的细菌，可加入酵母浸膏0.1%。 21℃高压灭黄15分钟，冷知到55℃时加入十分之一的20%尿素液（经法村法除南 使尿素含量为2% （即每100ml中有20g),制成短斜面。接种细离时，同时作划线及穿刺 置37℃培养24小时后观察，培养基从黄色变红色时为阳性。接种量多，反应快的细菌，数 小时即可使培养基变红。阴性者应继续观察4天。 可以省去琼脂，将各物（包括20g尿素）溶解后，过滤除菌，无菌分装，培养2日，无 菌者应用。 原理：触酶又称过氧化氢酶，能将过氧化氢分解为水和氧气 2H0,→2H0+01 培养基：细菌应培养在不含血液的营养琼脂上，因为红血球含有接触酶。 方法：将约1m3%的HO顺注于生长物（菌落或菌）上，有气泡(0)发生者头 阳性。亦可于清洁小试管 入少量的H0 (30%) 再用清洁无菌的细玻捧（或火焰封 的毛细玻管或镍铬丝做成的接种环)燕细菌少许，插入于H,O2液面下，有气泡产生者为阳 性。不可用铂环取细菌，因为铂有时可使HO2产生气泡。 Dnil,Y,C,法：将细菌在平皿上划线，培养于37℃24小时。另取一支毛细玻璃馆 (外径1mm,长67mm左右).将其一端浸于3%的H,O,液中，使H,O,上升到毛细玻管内 高度约达20， 。将这一支带有比02的毛细管下端，轻轻接触菌落，毛细管内立即出现“洗 胯”者为强阳性，观察时间以10秒钟为限 十五、氧化酶试验(Kovac试验) 原理：氧化酶及细胞色素氧化酶。做氧化酶试验时，此醇并不直接与氧化酶试剂起反应， 而是首先使细胞色素C氧化，然后此氧化型细胞色素C再使对苯二胺氧化，产生颜色反应
方法 1、明胶琼脂平板法可于普通琼脂加入 1％明胶倾注平板后，分为四个区，每个区 分别划线接种一种被检菌，经 24～48 小时培养后，于培养基表面注入氯化汞溶液（氯化汞 12g，蒸馏水 80ml，浓盐酸 16ml），如细菌液化明胶，则在菌落周围出现透明带。 方法 2、将被检菌穿刺接种于明胶培养基，于 20℃培养 7 天，逐日观察明胶液化现象。 如室温高，培养基自行溶化时，可与冰箱内放置 30 分钟，然后取出观察结果，不再凝固时 为阳性。 十三、尿素酶试验 原理：某些细菌能产生尿素酶。尿素酶可分解尿素，产生大量的氨，使培养基的 pH 值 升高，反应式为： O Ⅱ NH2-C-NH2+2H2O ⎯尿素酶 ⎯⎯→ （NH4）2CO3——→ 2NH3+CO2+H2O 培养基：应用 Christenrsen 氏培养基 蛋白胨 1g 葡萄糖 1g 氯化钠 5g KH2PO4 2g 0.2％酚红溶液 6ml 琼脂 20g 蒸馏水加至 1000ml 调整 pH 至 6.9。需生长因子的细菌，可加入酵母浸膏 0.1％。 121℃高压灭菌 15 分钟，冷却到 55℃时加入十分之一的 20％尿素液（经滤过法除菌） 使尿素含量为 2％（即每 1000ml 中有 20g），制成短斜面。接种细菌时，同时作划线及穿刺， 置 37℃培养 24 小时后观察，培养基从黄色变红色时为阳性。接种量多，反应快的细菌，数 小时即可使培养基变红。阴性者应继续观察 4 天。 可以省去琼脂，将各物（包括 20g 尿素）溶解后，过滤除菌，无菌分装，培养 2 日，无 菌者应用。 十四、触酶试验 原理：触酶又称过氧化氢酶，能将过氧化氢分解为水和氧气： 2H2O2 ⎯细胞色素 ⎯ ⎯→ 2H2O+O2↑ 培养基：细菌应培养在不含血液的营养琼脂上，因为红血球含有接触酶。 方法：将约 1 ml3％的 H2O2 倾注于生长物（菌落或菌苔）上，有气泡（O2）发生者为 阳性。亦可于清洁小试管中加入少量的 H2O2（30％），再用清洁无菌的细玻捧（或火焰封口 的毛细玻管或镍铬丝做成的接种环）蘸细菌少许，插入于 H2O2 液面下，有气泡产生者为阳 性。不可用铂环取细菌，因为铂有时可使 H2O2 产生气泡。 Daniel，Y．C．法：将细菌在平皿上划线，培养于 37℃24 小时。另取一支毛细玻璃管 （外径 1mm，长 67mm 左右），将其一端浸于 3％的 H2O2 液中，使 H2O2 上升到毛细玻管内， 高度约达 20mm。将这一支带有 H2O2 的毛细管下端，轻轻接触菌落，毛细管内立即出现“沸 腾”者为强阳性，观察时间以 10 秒钟为限。 十五、氧化酶试验（Kovac 试验） 原理：氧化酶及细胞色素氧化酶。做氧化酶试验时，此酶并不直接与氧化酶试剂起反应， 而是首先使细胞色素 C 氧化，然后此氧化型细胞色素 C 再使对苯二胺氧化，产生颜色反应
1 2还原型细胞色素C+2H+20,一 >2氧化型细胞色素C十H0 CH,CH, CH,CH, 氧化型细临色素C N CH,CH, (四甲基苯二胺) 试剂，1%盐酸四甲基苯二胺水溶液，或1%盐酸二甲基对苯二胺水溶液，配制后盛于棕 色瓶中，置冰箱中可保存2周， 保存可用 6周 方法1如细菌在固体培养基上长出菌落，可将试剂直接滴在细菌的菌落上，菌落呈玫 瑰红色然后到深紫色者为氧化酶阳性。 方法2取白色洁净滤纸一角，熊取试验菌菌落少许，加试剂一滴，阳性者立即呈粉红 色，以后颜色逐渐加深。 十大、DNA酶试验 原理：DNA酶可使DNA链水解成为由几个单核苷酸组成的弃核苷酸链。长链DNA可 被酸沉淀，而水解后形成的寡核苷酸，则可溶于酸，于DNA琼脂平板上进行试验，可在菌 落周围形成透明环。 培养基：DNA酶试验培养基 营养琼脂(pH7.2) 100ml脱氧核糖核酸(DNA)0.2g 8%CaC水溶液 方法：将被检茵接种于0.2%DNA琼脂平板上做点状接种，于35~37℃培养18~24小 时后，用1N盐酸倾注平板。于菌落周围出现透明环为阳性。 十七、脂藤试验 原理：细菌产生的脂隳可分解脂肪为游离脂肪酸。加在培养基中的维多利亚蓝可与脂肪 结合成为无色化合物，如果脂肪被细菌产生的脂肪酶分解，则维多利亚蓝释出，呈现深蓝色 该试验主要用于厌氧菌的鉴定。 培养基：脂醇培养基 蛋白陈 10g 酵母浸膏 3g 氯化钠 琼脂 20gpH7.8 维多利亚蓝(1：1500水溶液) 100ml 玉米油 50ml 蒸馏水 000m1 方法：将被检细菌接种于脂酶培养基上，于35~37℃培养24小时。细菌如有脂酶，则 使培养基变为深蓝色 则培养基不变色（无色或粉 色)。 十八、氨基酸脱羧酶试验 原理：有的细茵具有脱羧酶，能使氨基酸脱羧(-COOH),生成胺和CO2,使培养基的 pH升高，最常用的氨基酸有赖氨酸、鸟氨酸和精氨酸
氧化酶 2 还原型细胞色素 C+2H++ 2 1 O2 ⎯细胞色素 ⎯ ⎯→ 2 氧化型细胞色素 C 十 H2O 试剂，1%盐酸四甲基苯二胺水溶液，或 1%盐酸二甲基对苯二胺水溶液，配制后盛于棕 色瓶中，置冰箱中可保存 2 周，若冰冻保存可用 4～6 周。 方法 1 如细菌在固体培养基上长出菌落，可将试剂直接滴在细菌的菌落上，菌落呈玫 瑰红色然后到深紫色者为氧化酶阳性。 方法 2 取白色洁净滤纸一角，蘸取试验菌菌落少许，加试剂一滴，阳性者立即呈粉红 色，以后颜色逐渐加深。 十六、DNA 酶试验 原理：DNA 酶可使 DNA 链水解成为由几个单核苷酸组成的寡核苷酸链。长链 DNA 可 被酸沉淀，而水解后形成的寡核苷酸，则可溶于酸，于 DNA 琼脂平板上进行试验，可在菌 落周围形成透明环。 培养基：DNA 酶试验培养基 营养琼脂（pH7.2） 100ml 脱氧核糖核酸（DNA） 0.2g 8％CaCl2 水溶液 1ml 方法：将被检菌接种于 0.2%DNA 琼脂平板上做点状接种，于 35～37℃培养 18～24 小 时后，用 1N 盐酸倾注平板。于菌落周围出现透明环为阳性。 十七、脂酶试验 原理：细菌产生的脂酶可分解脂肪为游离脂肪酸。加在培养基中的维多利亚蓝可与脂肪 结合成为无色化合物，如果脂肪被细菌产生的脂肪酶分解，则维多利亚蓝释出，呈现深蓝色。 该试验主要用于厌氧菌的鉴定。 培养基：脂酶培养基 蛋白胨 10g 酵母浸膏 3g 氯化钠 5g 琼脂 20g pH7.8 维多利亚蓝（1：1500 水溶液） 100ml 玉米油 50ml 蒸馏水 900ml 方法：将被检细菌接种于脂酶培养基上，于 35～37℃培养 24 小时。细菌如有脂酶，则 使培养基变为深蓝色，否则培养基不变色（无色或粉红色）。 十八、氨基酸脱羧酶试验 原理：有的细菌具有脱羧酶，能使氨基酸脱羧（-COOH），生成胺和 CO2，使培养基的 pH 升高，最常用的氨基酸有赖氨酸、鸟氨酸和精氨酸
基础培养基： 蛋白 5g 葡萄糖 1g 0.2%溴麝香草酚蓝溶液 12ml 蒸馏水 1000ml 调整pH到6.8，每100m1基础培养基，加入所需要测定的氨基酸0.5g,所加的氨基酸 应先溶解于NaOH溶液内。 L一d氨酸0.5g+15%Na0H溶液0.5m L一d鸟医酸0.5g+15%Na0H溶液0.6ml 加入氨基酸后，再调整pH至6.8，分装于灭菌小试管内，每管1ml,121℃高压灭菌10 分钟。 方法：从琼脂斜面上株取培养物少许接种，上面滴加一层无菌液体石蜡，于37℃培养4 天，每天观察结果。阳性者培养液先变为黄色，后变为蓝色。阴性者为黄色 十九、苯丙氨 酸脱氨膨试验 原理：细菌能将苯丙氨酸脱氨变成苯丙酮酸，酮酸能使三氯化铁指示剂变绿色。变形杆 菌及普罗菲登斯菌有苯丙氨酸脱氨酶的活力。 培养基： DL苯丙氨酸（或L苯丙氨酸1g) 2g 氯化钠 酵母浸音 3g 琼脂 12g NaHPO 1 蒸馏水 分装于小试管内，121℃高压灭菌10分钟，制成长斜面 试验方法：多量接种被检菌，37℃孵有18~24小时，生长好后，取出注入02毫升（或 4~5滴)10%的FcC水溶液于生长面上，变绿色者为阳性。 二十、氰化钾抑菌试验 原理：氯化钾可以物制某些细菌的呼吸酸系统，细朐色素、细胞色素氧化酶、讨氧化氨 酶和过氧化物酶，以铁卟啉作为辅基，氰化钾能和铁卟淋结合，使这些酶失去活性，使细菌 生长受到抑制 培养基 蛋白胨 10g NazHPOa 5.64g KH:PO. 025g 蒸馏水 1000m 此为基础液。调节pH至7.6,15磅灭菌15分钟，冷却，置冰箱。 于冷基础液中加以15ml0.5%氰化钾溶液(0.5gKCN溶于100ml冷却的灭菌蒸馏水中)， 分装于灭菌小试管，每管约1ml,立即用施有热石蜡的软木塞塞紧，可于冰箱中保存2周。 方法：将2024小时肉汤培养物， 一大环到KCN培养基中， 置37℃培养，连续观察2天，有细菌生长时为阳性反应。注意：KCN为剧毒药，宜在通气 橱内操作
基础培养基： 蛋白胨 5g 葡萄糖 1g 0.2%溴麝香草酚蓝溶液 12ml 蒸馏水 1000ml 调整 pH 到 6.8，每 100m1 基础培养基，加入所需要测定的氨基酸 0.5g，所加的氨基酸 应先溶解于 NaOH 溶液内。 L—d 赖氨酸 0.5g + 15％Na0H 溶液 0.5ml L—d 鸟氨酸 0.5g + 15%NaOH 溶液 0.6ml 加入氨基酸后，再调整 pH 至 6.8，分装于灭菌小试管内，每管 1ml，121℃高压灭菌 10 分钟。 方法：从琼脂斜面上挑取培养物少许接种，上面滴加一层无菌液体石蜡，于 37℃培养 4 天，每天观察结果。阳性者培养液先变为黄色，后变为蓝色。阴性者为黄色。 十九、苯丙氨酸脱氨酶试验 原理：细菌能将苯丙氨酸脱氨变成苯丙酮酸，酮酸能使三氯化铁指示剂变绿色。变形杆 菌及普罗菲登斯菌有苯丙氨酸脱氨酶的活力。 培养基： DL 苯丙氨酸（或 L 苯丙氨酸 1g） 2g 氯化钠 5g 酵母浸膏 3g 琼脂 12g Na2HPO4 1g 蒸馏水 1000ml 分装于小试管内，121℃高压灭菌 10 分钟，制成长斜面。 试验方法：多量接种被检菌， 37℃孵育 18～24 小时，生长好后，取出注入 0.2 毫升（或 4～5 滴）10％的 FeCl3 水溶液于生长面上，变绿色者为阳性。 二十、氰化钾抑菌试验 原理：氰化钾可以抑制某些细菌的呼吸酶系统，细胞色素、细胞色素氧化酶、过氧化氢 酶和过氧化物酶，以铁卟啉作为辅基，氰化钾能和铁卟淋结合，使这些酶失去活性，使细菌 生长受到抑制。 培养基： 蛋白胨 10g Na2HPO4 5.64g NaCl 5g KH2PO4 0.225g 蒸馏水 1000ml 此为基础液。调节 pH 至 7.6，15 磅灭菌 15 分钟，冷却，置冰箱。 于冷基础液中加以 15ml0.5％氰化钾溶液（0.5g KCN 溶于 100ml 冷却的灭菌蒸馏水中）， 分装于灭菌小试管，每管约 1ml，立即用蘸有热石蜡的软木塞塞紧，可于冰箱中保存 2 周。 方法：将 20～24 小时肉汤培养物，接种一大环到 KCN 培养基中，立即用软木塞塞紧， 置 37℃培养，连续观察 2 天，有细菌生长时为阳性反应。注意：KCN 为剧毒药，宜在通气 橱内操作