第二章微生物的生理60学时) [内容提要]细菌菌体形成，涉及物质摄取、生物合成、聚合作用及组装四个步骤。菌体以均 等二分裂方式无性繁殖。细菌群体的生长曲线可分迟缓期、对数期、稳定期及衰亡期四个阶 段。大多数细菌可在人工培养基上生长。根据细菌对氧气和温度的需求差异，可将其分为需 氧菌、厌氧菌、兼性厌氧菌以及嗜温菌、嗜冷菌、嗜热菌等。由于细菌代谢的不同，以生化 试验用于细菌鉴定。细菌生存有赖于自身的调节机制，特别是细菌应激调节因子及其趋化性。 细菌与其他生物一样，有独立的生命活动，涉及复杂的新陈代谢。细菌的生理涉及细菌 的组分、营养要求、能量代谢、生物生长合成繁殖及基因调控等。本章将以细菌群体的生长 繁殖为主线，介绍细菌个体形成的代谢过程、群体的生长繁殖、细菌自身的调节机制以及工 人培养条件下细菌对营养的需求。 第一节细菌细胞的代谢过程 细菌的新陈代谢包括菌细胞的生物合成、能量供给、运动以及多达2000种化学反应表现 的各种活性。形成菌细胞的代谢过程可按其功能分为物质摄取、生物合成、聚合作用及组装 四个步骤（图2-1）
22 第二章 微生物的生理(6.0 学时) [内容提要] 细菌菌体形成，涉及物质摄取、生物合成、聚合作用及组装四个步骤。菌体以均 等二分裂方式无性繁殖。细菌群体的生长曲线可分迟缓期、对数期、稳定期及衰亡期四个阶 段。大多数细菌可在人工培养基上生长。根据细菌对氧气和温度的需求差异，可将其分为需 氧菌、厌氧菌、兼性厌氧菌以及嗜温菌、嗜冷菌、嗜热菌等。由于细菌代谢的不同，以生化 试验用于细菌鉴定。细菌生存有赖于自身的调节机制，特别是细菌应激调节因子及其趋化性。 细菌与其他生物一样，有独立的生命活动，涉及复杂的新陈代谢。细菌的生理涉及细菌 的组分、营养要求、能量代谢、生物生长合成繁殖及基因调控等。本章将以细菌群体的生长 繁殖为主线，介绍细菌个体形成的代谢过程、群体的生长繁殖、细菌自身的调节机制以及工 人培养条件下细菌对营养的需求。 第一节 细菌细胞的代谢过程 细菌的新陈代谢包括菌细胞的生物合成、能量供给、运动以及多达 2000 种化学反应表现 的各种活性。形成菌细胞的代谢过程可按其功能分为物质摄取、生物合成、聚合作用及组装 四个步骤（图 2-1）。 进入
脂 脂防酸（约8种》 包含物 胎多 糖（约25种】 糖原 包 细飞包联 氢基酸（约20种 204 毛 还原能 蛋白质 碳源 绝量 胞浆 代瑞前 RNA 枝酸（约8种 H NH 世酸 生物合成 聚合作用 组装 图2-1细菌细胞的代谢过程示意图（据Ryan等） 细菌为原核单细胞生物，其新陈代谢与动物细胞有如下主要区别： 第一，细菌生长和繁殖速度极快，超过动物细胞10至100倍。 第二，细菌利用各种化合物作为能源的能力远远强于动物细胞。 第三，细菌对营养的需求比动物细胞更为多种多样，因为它们有多种代谢旁路。 第四，细菌可利用非常流水线式生产的方式全成大分子物质 第五，细菌能产生诸如肽聚糖、脂多糖、磷壁酸等特殊物质。 一、物质摄取(fueling 细菌的物质吸收过程主要通过单纯扩散、促进扩散、主动输送及基团转位等方式进出细 菌细胞（图2-2），涉及细胞的能量提供和十余种前体代谢物质以及细胞膜和外膜蛋白的参与。 (一)单纯扩散(simple diffusion) H0,0,C0 亦称被动扩散。细胞膜两 侧的物质靠浓度差（浓度梯度） 进行分子扩散，不需要能量，当 细胞内外溶质浓度达到平衡，扩 散便停止。某些气体(02，C02)入 水、乙醇及甘油等水溶性小分子 结合 面药 磷酸背 以及某些离子(Na*)等以此方 图22细南物质摄取的各种方式（据Rym) Pe:酸HP含组氢酸的酸找体蛋自
23 PO4 3- 碳源 SO4 2- NH3 PO4 3- 碳源 SO4 2- NH3 摄取 细胞包膜 还原能 能量 代谢前体 生物合成 脂肪酸（约 8 种） 糖（约 25 种） 氨基酸（约 20 种） 核酸（约 8 种） 聚合作用 脂 脂多糖 糖原 肽聚糖 蛋白质 RNA DNA 组装 包含物 包膜 鞭毛 菌毛 胞浆液 核糖体 核苷酸 图 2-1 细菌细胞的代谢过程示意图（据 Ryan 等） 细菌为原核单细胞生物，其新陈代谢与动物细胞有如下主要区别： 第一，细菌生长和繁殖速度极快，超过动物细胞 10 至 100 倍。 第二，细菌利用各种化合物作为能源的能力远远强于动物细胞。 第三，细菌对营养的需求比动物细胞更为多种多样，因为它们有多种代谢旁路。 第四，细菌可利用非常流水线式生产的方式全成大分子物质。 第五，细菌能产生诸如肽聚糖、脂多糖、磷壁酸等特殊物质。 一、物质摄取（fueling） 细菌的物质吸收过程主要通过单纯扩散、促进扩散、主动输送及基团转位等方式进出细 菌细胞（图 2-2），涉及细胞的能量提供和十余种前体代谢物质以及细胞膜和外膜蛋白的参与。 （一）单纯 扩散（simple diffusion） 亦称被动扩散。细胞膜两 侧的物质靠浓度差（浓度梯度） 进行分子扩散，不需要能量，当 细胞内外溶质浓度达到平衡，扩 散便停止。某些气体（O2、CO2）、 水、乙醇及甘油等水溶性小分子 以及某些离子（Na+）等以此方 图 2-2 细菌物质摄取的各种方式（据 Ryan） Pc：磷酸 HPr：含组氨酸的磷酸载体蛋白 H2O，O2，CO2 甘油 乳糖 半乳糖 葡萄糖 半乳糖 结合蛋白 H2O，O2，CO2 甘油 乳糖 半乳糖 6 磷酸葡萄糖 甘油转运 蛋白 乳糖透性酶 半乳糖 转运蛋白 酶Ⅱ
式运输。 (二)促进扩散(facilitated diffusion) 基些物质如糖或氨基酸与某些位于细胞膜的特异性载体蛋白(carrier protein)相结合， 而后将其转运至细胞内，这一过程具有特异性和选择性，也不需要能量。甘油进入大肠杆菌 等肠道菌的细胞内，厌氧菌吸收营养物质及排出代谢产物，均是通过这一方式。载体蛋白在 革兰氏阴性菌属于OMP,可能是通过构象改变而完成促进扩散的。 (三)主动输送(active transport) 是细菌吸收营养物质的一种主要方式，与促进扩散一样，需要特异性的载体蛋白，能将 特异性溶质逆浓度梯度“泵”入细胞，因此需要能量。 革兰氏阴性菌有两种主动输送的方式：休克敏感式(shock-.sensitive)及休克不敏感式 (shock-.insensitive)。在作渗透休克处理时，前者载体蛋白释放出所结合的可溶性分子如半乳 糖，通过细菌外膜的微孔进入细胞，该过程伴随ATP的水解。休克不敏感伴随H的跨膜，其 能量由获能的细胞膜的电子运输而获得，有特异性载体蛋白（透性酶）参与，乳糖的输送即 用此方式。 (四)基团转位(group translocation) 物质在运输的同时受到化学修饰，从而能源源不断输入细胞，此种方式在缺氢环境中最 为常见。其过程涉及从可溶物向分子的化学变化，需要特异性载体蛋白参与，需要能量。有 磷酸转移酶系统(phosphotransferase system)参与的葡萄糖磷酸化是个例证。 (五)金属离子的吸收 影响细菌生长的金属离子在动物体内极少以游离状态存在，以铁为例，它与铁结合蛋白 结合，如血清中的转铁蛋白及乳中的乳铁蛋白。细菌通过分泌载铁体攫取这些蛋白结合的 e3+,形成含铁鳌合物，而后通过特异的主动输送，F©3+进入菌体细胞。 载铁体(siderophore)是细菌在低铁条件下所产生的一类有 机化合物，分子量一般不超过1000，与F*有极强的亲合力。其合 成受铁调控，输送铁的功能与细菌外膜的受体有关。目前将载铁体 分为两种类型，一种为异羟肟盐类(hydroxamate),具有单个或两 个异羟肟酸功能团，气菌素(aerobactin)是其代表（图2-3），能抵 抗血清的灭活作用。另一种为酚盐类(phenolate),由2,3二羟基苯 CH-CH2-0B- 甲酸(2,3-DHS)与氨基酸偶联而成，肠菌素(enterobactin)是其代 图2-3大肠杆菌的气菌素 表，能被血清灭活。大肠杆菌具有这两种载铁体
24 式运输。 （二）促进扩散（facilitated diffusion） 某些物质如糖或氨基酸与某些位于细胞膜的特异性载体蛋白（carrier protein）相结合， 而后将其转运至细胞内，这一过程具有特异性和选择性，也不需要能量。甘油进入大肠杆菌 等肠道菌的细胞内，厌氧菌吸收营养物质及排出代谢产物，均是通过这一方式。载体蛋白在 革兰氏阴性菌属于 OMP，可能是通过构象改变而完成促进扩散的。 （三）主动输送（active transport） 是细菌吸收营养物质的一种主要方式，与促进扩散一样，需要特异性的载体蛋白，能将 特异性溶质逆浓度梯度“泵”入细胞，因此需要能量。 革兰氏阴性菌有两种主动输送的方式：休克敏感式（shock-sensitive）及休克不敏感式 （shock-insensitive）。在作渗透休克处理时，前者载体蛋白释放出所结合的可溶性分子如半乳 糖，通过细菌外膜的微孔进入细胞，该过程伴随 ATP 的水解。休克不敏感伴随 H+的跨膜，其 能量由获能的细胞膜的电子运输而获得，有特异性载体蛋白（透性酶）参与，乳糖的输送即 用此方式。 （四）基团转位（group translocation） 物质在运输的同时受到化学修饰，从而能源源不断输入细胞，此种方式在缺氧环境中最 为常见。其过程涉及从可溶物向分子的化学变化，需要特异性载体蛋白参与，需要能量。有 磷酸转移酶系统（phosphotransferase system）参与的葡萄糖磷酸化是个例证。 （五）金属离子的吸收 影响细菌生长的金属离子在动物体内极少以游离状态存在，以铁为例，它与铁结合蛋白 结合，如血清中的转铁蛋白及乳中的乳铁蛋白。细菌通过分泌载铁体攫取这些蛋白结合的 Fe3+，形成含铁螯合物，而后通过特异的主动输送，Fe3+进入菌体细胞。 载铁体（siderophore） 是细菌在低铁条件下所产生的一类有 机化合物，分子量一般不超过 1000，与 Fe3+有极强的亲合力。其合 成受铁调控，输送铁的功能与细菌外膜的受体有关。目前将载铁体 分为两种类型，一种为异羟肟盐类（hydroxamate），具有单个或两 个异羟肟酸功能团，气菌素（aerobactin）是其代表（图 2-3），能抵 抗血清的灭活作用。另一种为酚盐类（phenolate），由 2,3-二羟基苯 甲酸（2,3-DHS）与氨基酸偶联而成，肠菌素（enterobactin）是其代 表，能被血清灭活。大肠杆菌具有这两种载铁体。 O Fe3+ | O C=O | NH | Cyclo(CO—CH—CH2—O)3 — 图 2-3 大肠杆菌的气菌素
二、生物合成(biosynthesis) 吸收的各种前体代谢物通过代谢途径的网络，合成多种氨基酸、核苷酸、糖、脂肪酸及 其他合成大分子所需物质（图21）。此过程还需要碳的前体、还原的烟酰胺腺嘌吟二核苷酸 磷酸盐(NADPH)、ATP、氨基氨以及硫。不同种类细菌对营养的需要有所不同，又有其不 同的合成途径，据此可作为细菌实验室鉴定的重要指标， 三、聚合作用(polymerization) 细菌DNA的聚合作用称为复 制。其DNA复制从基因组的特定 起始部位开始，而后沿环状的染色 体DNA的复制叉(replication fork) 图24大肠杆菌染色体的复制义（据Madigan等） 部位，从5端到3'端双向进行（图2-4）。以半保留(semiconservative)方式复制，其DNA 双链解离，其中一条链作为母板合成互补链。另一条链则沿相反方向复制，最后由酶连接成 完成DNA链（图2-5）。细菌DNA复制的频率因细菌细胞的生长率而异，DNA链的延伸率 (elongation rate)则相对稳定。 某些抗生素以不同途径干扰细菌DNA的复制，例 复制起始部包 如新生霉素等抑制细菌DNA复制过程中所需的促旋 酶的活性。 (一)转录 1.细菌的转录特点：在某些方面与真核生物不同。 ①细菌可由同一个RNA聚合酶催化合成细菌的 mRNA、RNA及rRNA。该酶还可像真核生物那样利 用活化的ATP、GITP、CTP及UTP,并可作为母板合 成DNA互补链。②细菌mRNA不需要通过核膜转运 到胞浆，因此不需要聚A帽状结构，也不要特异的转 运方式，而且在mRNA合成早期直接与核糖体蛋白结 合形成多聚体。 2.RNA聚合酶：该酶是一个复杂的大分子，由a2 BB1G亚单位组成。o亚单位可与特异的DNA序列 即启动子(promoter)结合。细菌RNA聚合酶一般具 国25大超开他D到度过际金
25 二、生物合成（biosynthesis） 吸收的各种前体代谢物通过代谢途径的网络，合成多种氨基酸、核苷酸、糖、脂肪酸及 其他合成大分子所需物质（图 2-1）。此过程还需要碳的前体、还原的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸 磷酸盐（NADPH）、ATP、氨基氮以及硫。不同种类细菌对营养的需要有所不同，又有其不 同的合成途径，据此可作为细菌实验室鉴定的重要指标。 三、聚合作用（polymerization） 细菌 DNA 的聚合作用称为复 制。其 DNA 复制从基因组的特定 起始部位开始，而后沿环状的染色 体 DNA 的复制叉（replication fork） 部位，从 5’端到 3’端双向进行（图 2-4）。以半保留（semiconservative）方式复制，其 DNA 双链解离，其中一条链作为母板合成互补链。另一条链则沿相反方向复制，最后由酶连接成 完成 DNA 链（图 2-5）。细菌 DNA 复制的频率因细菌细胞的生长率而异，DNA 链的延伸率 （elongation rate）则相对稳定。 某些抗生素以不同途径干扰细菌 DNA 的复制，例 如新生霉素等抑制细菌 DNA 复制过程中所需的促旋 酶的活性。 （一）转录 1. 细菌的转录特点：在某些方面与真核生物不同。 ①细菌可由同一个 RNA 聚合酶催化合成细菌的 mRNA、tRNA 及 rRNA。该酶还可像真核生物那样利 用活化的 ATP、GTP、CTP 及 UTP，并可作为母板合 成 DNA 互补链。②细菌 mRNA 不需要通过核膜转运 到胞浆，因此不需要聚 A 帽状结构，也不要特异的转 运方式，而且在 mRNA 合成早期直接与核糖体蛋白结 合形成多聚体。 2. RNA 聚合酶：该酶是一个复杂的大分子，由α2 ββ1σ亚单位组成。σ亚单位可与特异的 DNA 序列 即启动子（promoter）结合。细菌 RNA 聚合酶一般具 图 2-4 大肠杆菌染色体的复制叉（据 Madigan 等） 复制叉 新合成的 DNA 复制起始部位 图2-5 大肠杆菌染色体 DNA 的复制过程示意图 （据 Madigan 等）
有一个以上的σ亚单位，可识别不同的启动子，从而激活相关的基因。RNA聚合酶是利福平 类药物的靶分子，其可阻断转录的起始。 3.RNA的加工修饰：像真核细胞一样，RNA大分子的前体被核酸酶等加工、修饰，而后 产生稳定的RNA分子如RNA、rRNA等。 (二)翻译 也称转译，是蛋白质合成过程。20种氨基酸激活后与相应的tRNA结合，形成的氨基酰 RNA通过某些可溶性蛋白因子与核糖体结合。在此过程中，氨基酸根据mRNA上的密码子 序列聚合成多肽。tRNA释放出氨基酸后，自身也从核糖体上脱落，并进入下一轮氨基酰循环。 多种抗生素以细菌翻译过程有抑制作用，氯霉素、林可莓素和红霉素等抑制核糖体大亚 基，四环素、链霉素和壮观霉素等抑制小亚基，还有一些作用于核链孢酸(fusidicacid)等可 溶性蛋白因子，后者参与多肽的合成。 以上过程在原核细胞和真核细胞基本一致，但存在一些差别。细菌核糖体较小，结构也较简单。细菌 的mRNA不需要经过加工和转运，为大的顺反子，包含多个基因，可指导多个多肽链的合成。细菌RNA 聚合酶合成mRNA的速率为55个核苷酸/秒(37℃)，核糖体合成多肽链的速率为18个氨基酸/秒。因此 细菌中mRNA的翻译与DNA的转录不仅同时进行，而且两者速率也相等（每秒55个核苷酸/侮个密码子 3个核苷酸=每秒18个氨基酸)，这意味着核糖体在mRNA链上移动速率与RNA聚合酶合成mRNA的速 率相等。 细菌的上述翻译特性决定了细菌高效合成过程。细菌胞质内充满多聚核糖体。每个核糖体几乎都最大 限度地发挥作用。细菌生长越快，需要合成蛋白质用的核糖体就越多。在丰富培养基上生长的大肠杆菌 一半以上菌体由核糖体和其它翻译组分构成。 四、组装(assembly) 细菌细胞结构的组装有两种方式：自我组装(self-assembly,又名自我凝聚)，及指导组 装(guided assembly,又名特异机制)。自我组装可在体外试管内完成，鞭毛及核糖体即采用 此种方式。细菌表面膜结构则只能依赖指导组装来完成，过程尚不完全清楚，涉及蛋白质的 分泌，跨膜运输及载体分子如细菌萜醇等。 杆菌肽或万古霉素可干扰细菌细胞成份组装所需的载体的功能，多粘菌素可影响细胞膜 的组装。 第二节细菌的生长繁殖 细菌生长繁殖分别体现在个体和群体两方面。 26
26 有一个以上的σ亚单位，可识别不同的启动子，从而激活相关的基因。RNA 聚合酶是利福平 类药物的靶分子，其可阻断转录的起始。 3. RNA 的加工修饰：像真核细胞一样，RNA 大分子的前体被核酸酶等加工、修饰，而后 产生稳定的 RNA 分子如 tRNA、rRNA 等。 （二）翻译 也称转译，是蛋白质合成过程。20 种氨基酸激活后与相应的 tRNA 结合，形成的氨基酰 -tRNA 通过某些可溶性蛋白因子与核糖体结合。在此过程中，氨基酸根据 mRNA 上的密码子 序列聚合成多肽。tRNA 释放出氨基酸后，自身也从核糖体上脱落，并进入下一轮氨基酰循环。 多种抗生素以细菌翻译过程有抑制作用，氯霉素、林可霉素和红霉素等抑制核糖体大亚 基，四环素、链霉素和壮观霉素等抑制小亚基，还有一些作用于核链孢酸（fusidic acid）等可 溶性蛋白因子，后者参与多肽的合成。 以上过程在原核细胞和真核细胞基本一致，但存在一些差别。细菌核糖体较小，结构也较简单。细菌 的 mRNA 不需要经过加工和转运，为大的顺反子，包含多个基因，可指导多个多肽链的合成。细菌 RNA 聚合酶合成 mRNA 的速率为 55 个核苷酸/秒（37℃），核糖体合成多肽链的速率为 18 个氨基酸/秒。因此 细菌中 mRNA 的翻译与 DNA 的转录不仅同时进行，而且两者速率也相等（每秒 55 个核苷酸/每个密码子 3 个核苷酸=每秒 18 个氨基酸），这意味着核糖体在 mRNA 链上移动速率与 RNA 聚合酶合成 mRNA 的速 率相等。 细菌的上述翻译特性决定了细菌高效合成过程。细菌胞质内充满多聚核糖体。每个核糖体几乎都最大 限度地发挥作用。细菌生长越快，需要合成蛋白质用的核糖体就越多。在丰富培养基上生长的大肠杆菌， 一半以上菌体由核糖体和其它翻译组分构成。 四、组装（assembly） 细菌细胞结构的组装有两种方式：自我组装（self-assembly，又名自我凝聚），及指导组 装（guided assembly，又名特异机制）。自我组装可在体外试管内完成，鞭毛及核糖体即采用 此种方式。细菌表面膜结构则只能依赖指导组装来完成，过程尚不完全清楚，涉及蛋白质的 分泌，跨膜运输及载体分子如细菌萜醇等。 杆菌肽或万古霉素可干扰细菌细胞成份组装所需的载体的功能，多粘菌素可影响细胞膜 的组装。 第二节 细菌的生长繁殖 细菌生长繁殖分别体现在个体和群体两方面
一、细菌个体的生长繁殖 细菌以均等二分裂(binary fission)方式进行无性繁殖。已知大肠杆菌菌体的分裂过程涉 及30多个基因的调控。一个菌体分裂为两个菌体所需的时间称为世代时间(generation time)。 细菌种类不同其分裂的世代时间有所差异，大肠杆菌及许多其他病原菌在适宜的条件下，分 裂一次仅需20min,而分枝杆菌等繁殖较慢，需18-24h才分裂一次。 某些抗生素可抑制细菌聚合作用及组装，如使用非致死浓度的这些抗生素，可影响细胞 的分裂，导致菌体形态异常，如使用抗生素的样本中的大肠杆菌，往往呈长丝状。 二、细菌群体的生长繁殖 如将细菌接种在液体培养基并置于适宜的温度中，定时取样检查活菌数，可发现其生长 过程具有规律性。以时间为横坐标，以活菌数的对数为纵坐标，可得出一条生长曲线(growth cuve)。曲线显示了细菌生长繁殖的4个期（图2-6）。 (-)迟缓期((lag phase) 9 是细菌植入到新环境后的一个适应阶段。此时 菌体增大，代谢活跃，合成并积累所需酶系统。RNA 含量明显增多，但DNA的量无变化，此时细菌数 对数胡 并不增加。这一过程一般约需14h (二)对数期((logarithmic phase) 细菌此时生长迅速，以恒定速度进行分裂繁 殖，活菌数以几何级数增长，达到顶峰，生长曲线 接近一条斜的直线。一般而言，该期的病原菌致病 图2-6细菌的生长曲线 力最强，其形态、染色特性及生理活性均较典型， 对抗菌药物等的作用较为敏感。大肠杆菌的对数期可持续6~I0h。 （(三)稳定期(stationary phase) 此时因营养的消耗、代谢产物的蓄积等，细菌繁殖速度下降，死亡数逐步上升，新繁殖 的活菌数与死菌数大致持平。该期细菌的形态及生理性状常有改变，革兰氏阳性菌此时可染 成阴性。毒素等代谢产物大多此时产生。大肠杆菌的稳定期持续约8h。 (四)衰亡期(decline phase) 细菌开始大量死亡，死菌数超过活菌数。如不移植到新的培养基，最终可全部死亡。此 期细菌的菌体变形或自溶，染色不典型，难以进行鉴定。 27
27 一、细菌个体的生长繁殖 细菌以均等二分裂（binary fission）方式进行无性繁殖。已知大肠杆菌菌体的分裂过程涉 及 30 多个基因的调控。一个菌体分裂为两个菌体所需的时间称为世代时间（generation time）。 细菌种类不同其分裂的世代时间有所差异，大肠杆菌及许多其他病原菌在适宜的条件下，分 裂一次仅需 20 min，而分枝杆菌等繁殖较慢，需 18~24 h 才分裂一次。 某些抗生素可抑制细菌聚合作用及组装，如使用非致死浓度的这些抗生素，可影响细胞 的分裂，导致菌体形态异常，如使用抗生素的样本中的大肠杆菌，往往呈长丝状。 二、细菌群体的生长繁殖 如将细菌接种在液体培养基并置于适宜的温度中，定时取样检查活菌数，可发现其生长 过程具有规律性。以时间为横坐标，以活菌数的对数为纵坐标，可得出一条生长曲线（growth curve）。曲线显示了细菌生长繁殖的 4 个期（图 2-6）。 （一）迟缓期（lag phase） 是细菌植入到新环境后的一个适应阶段。此时 菌体增大，代谢活跃，合成并积累所需酶系统。RNA 含量明显增多，但 DNA 的量无变化，此时细菌数 并不增加。这一过程一般约需 1~4 h。 （二）对数期（logarithmic phase） 细菌此时生长迅速，以恒定速度进行分裂繁 殖，活菌数以几何级数增长，达到顶峰，生长曲线 接近一条斜的直线。一般而言，该期的病原菌致病 力最强，其形态、染色特性及生理活性均较典型， 对抗菌药物等的作用较为敏感。大肠杆菌的对数期可持续 6~10 h。 （三）稳定期（stationary phase） 此时因营养的消耗、代谢产物的蓄积等，细菌繁殖速度下降，死亡数逐步上升，新繁殖 的活菌数与死菌数大致持平。该期细菌的形态及生理性状常有改变，革兰氏阳性菌此时可染 成阴性。毒素等代谢产物大多此时产生。大肠杆菌的稳定期持续约 8 h。 （四）衰亡期（decline phase） 细菌开始大量死亡，死菌数超过活菌数。如不移植到新的培养基，最终可全部死亡。此 期细菌的菌体变形或自溶，染色不典型，难以进行鉴定。 9 8 7 稳定期 衰亡期 6 5 对数期 4 3 2 1 迟缓期 0 4 8 12 16 20 24 28 32 26 h 图 2-6 细菌的生长曲线
细菌的生长曲线是在体外人工培养条件下观察到的，在动物体内因受诸多因素的制约 未必能出现此种典型的曲线，但对细菌的生长规律的研究及实践有重要的参考价值。 第三节细菌的人工培养 用人工方法，提供细菌在自然环境或动物体内生长繁殖需要的基本条件，达到细菌培养、 鉴定及进一步利用的目的。人工培养细菌，除需提供充足的营养物质外，尚需有合适的酸碱 度、适宜的温度及必要的气体环境。在营养丰富、生长繁殖条件适宜时，细菌生长繁殖最为 迅速。 一、细菌的营养需要 细菌种类紫多，营养需要千差万别，但其基本营养要求不外水分、无机盐类、含碳化合 物和含氮化合物，个别细菌还需要生长因子等特殊物质。 (一)水分 水虽不属于严格的营养物质，但细菌生长繁殖需要大量的水分。水除是细菌的主要组成 成分之一外，同时又是一种良好的溶剂，许多物质溶解于水中才能被细菌吸收，细菌的渗透、 分泌和排泄以及水解和许多生化反应等作用都以水为媒介。另外，水的比热大，利于热的吸 收和散发，可有效地调节细胞与所处环境的温度。 (二)无机盐类 无机盐类可提供细菌生长所需的一些元素，根据对其需要量可分为常量元素和微量元素。 一般情况下，这些元素在所供给的水、营养物质中含有，不需特殊提供。但有些细菌，如嗜 盐菌对Na和CI有特殊需要 （三)含碳化合物 细菌合成碳水化合物，进一步合成多糖、脂类、蛋白质、核酸等组成成分需要碳素营养， 自养菌是以CO2或碳酸盐为碳源，异养菌则以有机含碳化合物为碳源，也需要少量的C02 可由分解代谢所产生的C02满足其需要。有些异养菌在培养开始时，需先加一些CO以促进 其生长。异养菌最常利用的碳源是糖类，另外还有有机酸、醇类、脂类以及氨基酸等。糖类 以单糖（己糖）主要是葡萄糖和果糖，几乎所有异养菌均可利用：双糖中的蔗糖、乳糖、麦芽 糖等某些细菌可利用：多糖中的淀粉，病原菌往往可能利用，而纤维素、果胶等只能为某些 自然界的细菌所利用。细菌能利用什么种类的糖类物质或含碳物质并产生什么样的产物，这 可作为细菌鉴定的依据。 在培养细菌时，因细菌可利用氨基酸中的碳素，往往不需添加任何糖类。 28
28 细菌的生长曲线是在体外人工培养条件下观察到的，在动物体内因受诸多因素的制约， 未必能出现此种典型的曲线，但对细菌的生长规律的研究及实践有重要的参考价值。 第三节 细菌的人工培养 用人工方法，提供细菌在自然环境或动物体内生长繁殖需要的基本条件，达到细菌培养、 鉴定及进一步利用的目的。人工培养细菌，除需提供充足的营养物质外，尚需有合适的酸碱 度、适宜的温度及必要的气体环境。在营养丰富、生长繁殖条件适宜时，细菌生长繁殖最为 迅速。 一、细菌的营养需要 细菌种类繁多，营养需要千差万别，但其基本营养要求不外水分、无机盐类、含碳化合 物和含氮化合物，个别细菌还需要生长因子等特殊物质。 （一）水分 水虽不属于严格的营养物质，但细菌生长繁殖需要大量的水分。水除是细菌的主要组成 成分之一外，同时又是一种良好的溶剂，许多物质溶解于水中才能被细菌吸收，细菌的渗透、 分泌和排泄以及水解和许多生化反应等作用都以水为媒介。另外，水的比热大，利于热的吸 收和散发，可有效地调节细胞与所处环境的温度。 （二）无机盐类 无机盐类可提供细菌生长所需的一些元素，根据对其需要量可分为常量元素和微量元素。 一般情况下，这些元素在所供给的水、营养物质中含有，不需特殊提供。但有些细菌，如嗜 盐菌对 Na＋和 Cl－有特殊需要 （三）含碳化合物 细菌合成碳水化合物，进一步合成多糖、脂类、蛋白质、核酸等组成成分需要碳素营养， 自养菌是以 CO2 或碳酸盐为碳源，异养菌则以有机含碳化合物为碳源，也需要少量的 CO2， 可由分解代谢所产生的 CO2 满足其需要。有些异养菌在培养开始时，需先加一些 CO2 以促进 其生长。异养菌最常利用的碳源是糖类，另外还有有机酸、醇类、脂类以及氨基酸等。糖类 以单糖(己糖)主要是葡萄糖和果糖，几乎所有异养菌均可利用；双糖中的蔗糖、乳糖、麦芽 糖等某些细菌可利用；多糖中的淀粉，病原菌往往可能利用，而纤维素、果胶等只能为某些 自然界的细菌所利用。细菌能利用什么种类的糖类物质或含碳物质并产生什么样的产物，这 可作为细菌鉴定的依据。 在培养细菌时，因细菌可利用氨基酸中的碳素，往往不需添加任何糖类
(四)含氨化合物 有机的、无机的含氮氨化合物均可作为细菌氮源，但细菌种类不同而对氮源要求有所差异。 有些细菌（如固氮菌）可利用空气中的分子状态的氮，而大多数细菌能利用无机的铵盐、硝 酸盐以及有机的氨基酸。许多病原菌不能利用无机含氨化合物，需要供给有机含氮化合物才 能生长。高分子的蛋白陈和蛋白质，细菌不能直接利用，必须经由细菌分泌的蛋白水解酶降 解为肽或氨基酸后才能利用。 由于细菌种类不同，利用无机含氮化合物的能力不同，可作为细菌鉴定的依据。 (五)生长因子 除上述营养物外，有些细菌还需特殊的物质才能生长或促进其生长，这类物质称为生长 因子(growth factor)。生长因子多为维生素或维生素类似物，主要是B族维生素，还有对氨基 苯甲酸和谷氨酰胺等，主要作为辅酶或辅基的成分而起作用。此外，还有一些化合物为某些 细菌生长所必需，如嗜血杆菌生长需要血液中的X因子和V因子。X因子与氯化高铁血红蛋 白相同，V因子是辅酶INAD)或辅酶ⅡNADP)。生长因子通常由酵母浸出物、血液、腹水 或血清供给。对生长因子需要的不同，也可作为细菌鉴定的依据。 二、细菌生长繁殖的条件 细菌要正常的生长繁殖，必须具备符合其生理特性的一定环境条件。 (一)营养物质 根据细菌的营养需要，要满足其生长所必需的水分、无机盐、含碳化合物、含氮化合物 以及生长因子等。所提供的营养物质应不含对细菌生长有害、有毒的成分。 (二)温度 不同细菌对温度有不同适应范围，各种细菌又有各自的可生长温度范围及最适温度。根 据细菌对温度的适应范围，可将细菌分为三类：嗜冷菌(psychrophile),生长范围-5℃~30C, 最适生长10℃-20C:嗜温菌(mesophile),生长范围10C~45℃，最适20℃~40℃：嗜热菌 (termophile),生长范围25℃~95℃，最适50℃-60℃。病原菌已适应动物的体温，因此均为 嗜温菌。某些嗜冷菌对鱼类等变温动物有致病性。 (三)酸碱度 pH影响微生物的生长，每种细菌均有一个可适应的pH范围及最适生长pH。虽然大多数 细菌在pH6~8之间可以生长，但多数病原菌的最适pH为72~7.6，个别偏酸，如鼻疽假单胞 菌(Pseudomonas mallei)为pH6.46.6:或偏碱，如肠球菌(Enterococcus)为pH9.6。在细 9
29 （四）含氮化合物 有机的、无机的含氮化合物均可作为细菌氮源，但细菌种类不同而对氮源要求有所差异。 有些细菌（如固氮菌）可利用空气中的分子状态的氮，而大多数细菌能利用无机的铵盐、硝 酸盐以及有机的氨基酸。许多病原菌不能利用无机含氮化合物，需要供给有机含氮化合物才 能生长。高分子的蛋白胨和蛋白质，细菌不能直接利用，必须经由细菌分泌的蛋白水解酶降 解为肽或氨基酸后才能利用。 由于细菌种类不同，利用无机含氮化合物的能力不同，可作为细菌鉴定的依据。 （五）生长因子 除上述营养物外，有些细菌还需特殊的物质才能生长或促进其生长，这类物质称为生长 因子(growth factor)。生长因子多为维生素或维生素类似物，主要是 B 族维生素，还有对氨基 苯甲酸和谷氨酰胺等，主要作为辅酶或辅基的成分而起作用。此外，还有一些化合物为某些 细菌生长所必需，如嗜血杆菌生长需要血液中的 X 因子和 V 因子。X 因子与氯化高铁血红蛋 白相同，V 因子是辅酶 I(NAD)或辅酶 II(NADP)。生长因子通常由酵母浸出物、血液、腹水 或血清供给。对生长因子需要的不同，也可作为细菌鉴定的依据。 二、细菌生长繁殖的条件 细菌要正常的生长繁殖，必须具备符合其生理特性的一定环境条件。 （一）营养物质 根据细菌的营养需要，要满足其生长所必需的水分、无机盐、含碳化合物、含氮化合物 以及生长因子等。所提供的营养物质应不含对细菌生长有害、有毒的成分。 （二）温度 不同细菌对温度有不同适应范围，各种细菌又有各自的可生长温度范围及最适温度。根 据细菌对温度的适应范围，可将细菌分为三类：嗜冷菌（psychrophile），生长范围-5℃~30℃， 最适生长 10℃~20℃；嗜温菌（mesophile），生长范围 10℃~45℃，最适 20℃~40℃；嗜热菌 （termophile），生长范围 25℃~95℃，最适 50℃~60℃。病原菌已适应动物的体温，因此均为 嗜温菌。某些嗜冷菌对鱼类等变温动物有致病性。 （三）酸碱度 pH 影响微生物的生长，每种细菌均有一个可适应的 pH 范围及最适生长 pH。虽然大多数 细菌在 pH 6~8 之间可以生长，但多数病原菌的最适 pH 为 7.2~7.6，个别偏酸，如鼻疽假单胞 菌（Pseudomonas mallei）为 pH 6.4~6.6；或偏碱，如肠球菌（Enterococcus）为 pH 9.6。在细
菌生长过程中，能使培养基变酸或变碱而影响其生长，所以在培养基中往往需要加入一定的 缓冲剂。 (四)氯气 根据细菌对氧的要求，可将其分为需氧菌、厌氧菌及兼性厌氧菌。需氧菌(aerobe)行需 氧呼吸，必须在有一定浓度的游离氧的条件下才能生长繁殖，其中只需低分子氧浓度(2%~ l0%)者特称微需氧菌(microaerophilic bacteria)。厌氧菌(anaerobe)行厌氧呼吸，必须在无游 离氧或其浓度极低的条件下才能存活。其原因是，细菌在代谢过程中产生对菌体有毒性的过 氧化氢(HO2)、超氧阴离子(O2)和羟自由基(OH·)等，厌氧茵部分或全部缺乏降解这 些产物的酶，如过氧化氢酶、过氧化物酶、超氧化物歧化酶等，因O2或HO2的毒性作用死 亡。兼性厌氧菌(facultative anaerobe)既可行需氧呼吸，又可行厌氧呼吸，通常在有氧条件 比无氧环境生长更好。 (五)渗透压 细菌生长有一定的可生长渗透压范围和最适渗透压，大多数细菌生长最适渗透压为等渗 环境，也有些细菌（如嗜盐菌）适宜高渗环境。细菌一般较其他生物细胞对渗透压的改变有 较大的适应能力。 三、培养基(culture medium) 培养基是人工配制的基质，含有细菌生长繁殖必需的营养物质。培养基制成后，通常都 要经灭菌处理。按营养组成的差异，可将培养基分为基础培养基(basal medium)及营养培养 基(nutrient medium)。前者含多数细菌生长繁殖所需的基本营养成分，常用新鲜牛肉浸膏， 加入适量的蛋白胨、NaC1、磷酸盐，调节pH至7.2~7.6即成。在基础培养基中，添加葡萄糖、 血液或血清等，即为营养培养基，最常用的是血琼脂平板 按状态的差异，可将培养基分为固体培养基、半固体培养基及液体培养三类。液体培养 基(liquid medium)即不加凝固剂的基础培养基或营养培养基，用于扩增纯培养的菌体、确 定细菌生长曲线等。在液体培养基中加入1%2%的琼脂，即成为遇热融化、冷却后凝固的固 体培养基(solid medium),用于细菌的分离、纯化、生物活性检测等。如将加入液体培养基 的琼脂减半，用0.5%左右，即成为半固体培养基(semi-solid medium),可作穿刺试验，观察 名
30 菌生长过程中，能使培养基变酸或变碱而影响其生长，所以在培养基中往往需要加入一定的 缓冲剂。 （四）氧气 根据细菌对氧的要求，可将其分为需氧菌、厌氧菌及兼性厌氧菌。需氧菌（aerobe）行需 氧呼吸，必须在有一定浓度的游离氧的条件下才能生长繁殖，其中只需低分子氧浓度(2%～ 10%)者特称微需氧菌(microaerophilic bacteria)。厌氧菌（anaerobe）行厌氧呼吸，必须在无游 离氧或其浓度极低的条件下才能存活。其原因是，细菌在代谢过程中产生对菌体有毒性的过 氧化氢（H2O2）、超氧阴离子（O2 －）和羟自由基（OH·）等，厌氧菌部分或全部缺乏降解这 些产物的酶，如过氧化氢酶、过氧化物酶、超氧化物歧化酶等，因 O2 －或 H2O2 的毒性作用死 亡。兼性厌氧菌（facultative anaerobe）既可行需氧呼吸，又可行厌氧呼吸，通常在有氧条件 比无氧环境生长更好。 （五）渗透压 细菌生长有一定的可生长渗透压范围和最适渗透压，大多数细菌生长最适渗透压为等渗 环境，也有些细菌（如嗜盐菌）适宜高渗环境。细菌一般较其他生物细胞对渗透压的改变有 较大的适应能力。 三、培养基（culture medium） 培养基是人工配制的基质，含有细菌生长繁殖必需的营养物质。培养基制成后，通常都 要经灭菌处理。按营养组成的差异，可将培养基分为基础培养基（basal medium）及营养培养 基（nutrient medium）。前者含多数细菌生长繁殖所需的基本营养成分，常用新鲜牛肉浸膏， 加入适量的蛋白胨、NaCl、磷酸盐，调节 pH 至 7.2~7.6 即成。在基础培养基中，添加葡萄糖、 血液或血清等，即为营养培养基，最常用的是血琼脂平板。 按状态的差异，可将培养基分为固体培养基、半固体培养基及液体培养三类。液体培养 基（liquid medium）即不加凝固剂的基础培养基或营养培养基，用于扩增纯培养的菌体、确 定细菌生长曲线等。在液体培养基中加入 1%~2%的琼脂，即成为遇热融化、冷却后凝固的固 体培养基（solid medium），用于细菌的分离、纯化、生物活性检测等。如将加入液体培养基 的琼脂减半，用 0.5%左右，即成为半固体培养基（semi-solid medium），可作穿刺试验，观察
细菌的动力及短期保藏菌种等。 按功能的差异，可将培养基分为鉴别培养基、选择培养基及厌氧培养基。在培养基中加 入特定作用底物及产生显色反应的指示剂，即可凭肉眼根据颜色识别，这就是鉴别培养基 (differential medium)。在培养基中加入某种化学物质，对不同细菌分别产生抑制或促进作用， 从而可从混杂多种细菌的样本分离出所需细菌，此即为选择培养基(selective medium)。最常 用的有麦康凯(MacConkey)培养基，内含胆酸盐，能抑制革兰氏阳性菌的生长，有利于大 肠杆菌及沙门氏菌的生长。在实际使用中，鉴别与选择两种功能往往结合在一种培养基之中。 厌氧培养基(anaerobic medium)是为培养厌氧菌而设计的，是在培养基中加入还原剂如巯基 乙酸钠等，或用石蜡或凡士林封住培养基表面，隔绝空气，有的还需放入无氧气培养箱维持 无氧环境。庖肉培养基(cooked meat medium)是常用的厌氧培养基，其中含不饱和脂肪酸和 谷胱甘肽的肉渣起到还原剂的作用。 第四节病毒的增殖(2学时) 病毒由于缺乏自身增殖所需的完整酶系统，增殖只能在活细胞内进行，是以病毒基因组 为膜板，在酶的作用下，分别合成其基因及蛋白质，再组装成完整的病毒颗粒。该过程不是 简单的核酸复制，也不同于细胞性生物的分裂，应称之为增殖。 病毒的一步生长曲线(one-step growth curve:)感染比(multiplicity of infection,MOI)是指 在一个系统中感染病毒的细胞数与细胞总数之比。在培养的细胞中，接种高MO1的病毒，使 所有细胞几乎同时受到病毒感染，如分析该培养系统中的单个细胞，就可以代表病毒在整个 体系中所有细胞的生长情况。应用这一方法，可获得病毒一步生长曲线试验结果，观察到病 毒具有增殖周期(multiplication cycle)。一个完整的增殖周期包括吸附、侵入与脱壳、生物合成、 组装与释放等步骤。因病毒不同其增殖周期长短不一，如小RNA病毒为2个多小时，疱疹病 毒为10小时左右，腺病毒14~25小时。 隐蔽期(eclipse period):从侵入细胞的病毒颗粒完全消失开始，到新的子代病毒颗粒出现 为止，这阶段称为隐蔽期（晦暗期或隐晦期）。隐蔽期的长短随病毒种类而不同，一般持续2 12小时。痘病毒为10小时，脊髓灰质炎病毒为2~4小时。此期是病毒增殖的最主要阶段， 31
31 细菌的动力及短期保藏菌种等。 按功能的差异，可将培养基分为鉴别培养基、选择培养基及厌氧培养基。在培养基中加 入特定作用底物及产生显色反应的指示剂，即可凭肉眼根据颜色识别，这就是鉴别培养基 （differential medium）。在培养基中加入某种化学物质，对不同细菌分别产生抑制或促进作用， 从而可从混杂多种细菌的样本分离出所需细菌，此即为选择培养基（selective medium）。最常 用的有麦康凯（MacConkey）培养基，内含胆酸盐，能抑制革兰氏阳性菌的生长，有利于大 肠杆菌及沙门氏菌的生长。在实际使用中，鉴别与选择两种功能往往结合在一种培养基之中。 厌氧培养基（anaerobic medium）是为培养厌氧菌而设计的，是在培养基中加入还原剂如巯基 乙酸钠等，或用石蜡或凡士林封住培养基表面，隔绝空气，有的还需放入无氧气培养箱维持 无氧环境。庖肉培养基（cooked meat medium）是常用的厌氧培养基，其中含不饱和脂肪酸和 谷胱甘肽的肉渣起到还原剂的作用。 第四节 病毒的增殖（2 学时） 病毒由于缺乏自身增殖所需的完整酶系统，增殖只能在活细胞内进行，是以病毒基因组 为膜板，在酶的作用下，分别合成其基因及蛋白质，再组装成完整的病毒颗粒。该过程不是 简单的核酸复制，也不同于细胞性生物的分裂，应称之为增殖。 病毒的一步生长曲线(one-step growth curve)：感染比(multiplicity of infection，MOI)是指 在一个系统中感染病毒的细胞数与细胞总数之比。在培养的细胞中，接种高 MOI 的病毒，使 所有细胞几乎同时受到病毒感染，如分析该培养系统中的单个细胞，就可以代表病毒在整个 体系中所有细胞的生长情况。应用这一方法，可获得病毒一步生长曲线试验结果，观察到病 毒具有增殖周期(multiplication cycle)。一个完整的增殖周期包括吸附、侵入与脱壳、生物合成、 组装与释放等步骤。因病毒不同其增殖周期长短不一，如小 RNA 病毒为 2 个多小时，疱疹病 毒为 10 小时左右，腺病毒 14～25 小时。 隐蔽期(eclipse period)：从侵入细胞的病毒颗粒完全消失开始，到新的子代病毒颗粒出现 为止，这阶段称为隐蔽期(晦暗期或隐晦期)。隐蔽期的长短随病毒种类而不同，一般持续 2～ 12 小时。痘病毒为 10 小时，脊髓灰质炎病毒为 2～4 小时。此期是病毒增殖的最主要阶段