实验八凝集试验 目的要求 1.熟悉平板凝集反应和试管凝集反应的操作技术，通过对凝集结果的观察和记录，了 解凝集的判定和对被检牲畜试验结果的判定。 2.了解间接血凝反应试验过程和操作方法。 操作步摩 、平板凝集反应（以布氏杆菌为例） (一)取洁净玻片一块，用玻璃铅笔划成五行小格，并标明待检血清的号码。 (三)按表81滴加待检血清、抗原（将牛、羊、猪三型布氏杆菌悬浮于甘油浓盐水中， 加入煌绿及结晶紫制成)和生理盐水（检查绵羊、山羊血清时，用12%浓盐水）。血清用前 需放室温，使其温度达20℃左右。 表81布氏杆菌的平板凝集反应 成分 试验组 对照 1 2 3 4 盐 0.03 被检血消 00s 0.02 0.01 抗原 0.03 0.03 0.03 0.03 0.03 (三)用火柴棒自血清量最少格起，依次往前搅拌，使血清与抗原混匀，每份血清用一 根火柴棒。 (四)混合完毕后，将玻片置于凝集反应箱上均匀加温，或放于离火焰稍高处，微微加 温至30℃左右，3一5分钟内记录反应结果， (五)按下列标准记录反应强度 ++++:出现大的凝华块、液体完全透明 +:液体混浊，有小的颗粒状物，即25%凝集。 一：液体均匀混浊，无凝集物。 牛、马和骆驼的血清在0.02ml处或以上疑集，而绵羊、山羊和猪的血清在0.04处或 以上凝集，判为阳性反应：牛、马和骆驼的血清在0.04ml处凝集，绵羊、山羊和猪的血清 在0.08ml处凝集时判为可疑反应 大规模检疫时，允许只用两个血清量作试验，牛、马、骆驼用0.04和0.02ml,猪、山 羊和绵羊、狗用0.08和0.04ml。如用两个血清量作试验，任何一个血清量出现凝集时，均 需用四个血清量重检。 (六)每次试验须用标准阳性血清和阴性血清作对照。 二、试管凝集反应 一)每份血清用4支试管(1×8cm),另取对照管3支。如待检血清多时，只设一份 对照组。 (二)按表8-2，用0.5%石炭酸生理盐水，将被检血清稀释成四个稀释度。第五管中 不加血清，设抗原对照。第六管中加1：25稀释的布氏杆菌阳性血清0.5毫升作阳性对照。 第七管中加1：25稀释的布氏杆菌阴性血清0.5毫升作阴性对照
实验八 凝集试验 目的要求 1. 熟悉平板凝集反应和试管凝集反应的操作技术，通过对凝集结果的观察和记录，了 解凝集的判定和对被检牲畜试验结果的判定。 2.了解间接血凝反应试验过程和操作方法。 操作步骤 一、平板凝集反应（以布氏杆菌为例） （一）取洁净玻片一块，用玻璃铅笔划成五行小格，并标明待检血清的号码。 （三）按表 8-1 滴加待检血清、抗原（将牛、羊、猪三型布氏杆菌悬浮于甘油浓盐水中， 加入煌绿及结晶紫制成）和生理盐水（检查绵羊、山羊血清时，用 12％浓盐水）。血清用前 需放室温，使其温度达 20℃左右。 表 8-1 布氏杆菌的平板凝集反应 成 分 试 验 组 对 照 1 2 3 4 盐 水 被检血清 抗 原 — 0.08 0.03 — 0.04 0.03 — 0.02 0.03 — 0.01 0.03 0.03 — 0.03 （三）用火柴棒自血清量最少格起,依次往前搅拌，使血清与抗原混匀，每份血清用一 根火柴棒。 （四）混合完毕后，将玻片置于凝集反应箱上均匀加温，或放于离火焰稍高处，微微加 温至 30℃左右，3～5 分钟内记录反应结果。 （五）按下列标准记录反应强度 ++++：出现大的凝集块、液体完全透明。 +++：有明显凝集块、液体几乎完全透明，即 75%凝集。 ++：有可见凝集片，液体不甚透明，即 50％凝集。 +：液体混浊，有小的颗粒状物，即 25％凝集。 －：液体均匀混浊，无凝集物。 牛、马和骆驼的血清在 0.02ml 处或以上凝集，而绵羊、山羊和猪的血清在 0.04ml 处或 以上凝集，判为阳性反应；牛、马和骆驼的血清在 0.04ml 处凝集，绵羊、山羊和猪的血清 在 0.08ml 处凝集时判为可疑反应。 大规模检疫时，允许只用两个血清量作试验，牛、马、骆驼用 0.04 和 0.02ml，猪、山 羊和绵羊、狗用 0.08 和 0.04ml。如用两个血清量作试验，任何一个血清量出现凝集时，均 需用四个血清量重检。 （六）每次试验须用标准阳性血清和阴性血清作对照。 二、试管凝集反应 （一）每份血清用 4 支试管（1×8cm），另取对照管 3 支。如待检血清多时，只设一份 对照组。 （二）按表 8-2，用 0.5％石炭酸生理盐水，将被检血清稀释成四个稀释度。第五管中 不加血清，设抗原对照。第六管中加 1：25 稀释的布氏杆菌阳性血清 0.5 毫升作阳性对照。 第七管中加 1：25 稀释的布氏杆菌阴性血清 0.5 毫升作阴性对照
(三)各管中加入用0.5%石炭酸生理盐水稀释20倍的布氏杆菌抗原0.5ml(每ml含 菌8亿)。 四)各管加抗原后，将各管充分混匀，放37℃温箱中感作410小时，取出后放室 温18~24小时，然后观察并记录结果。 (五)检查猪、羊、狗时血清稀释度为1：25,1：50,1：100,1：200：绵羊、山羊血清 用10%浓盐水稀释。牛、马和驼骆血清稀释度为1：50,1：100,1：200,1：400，大规模检疫 可只用两个稀释度，即狗、猪、羊为1：25,1：50：牛、马、骆驼为1：50和1：100。 判定结果时用“十 表 反应强度 :液体完全透明，菌体完全被凝集呈伞状沉于管底，振荡时，沉淀物呈片状、块 状或颗粒状（即100%的菌体被凝集）。 ++:液体略混浊，菌体大部分被凝集于管底，振荡时呈片状或颗粒状(5%南体被凝 集)。 中：液体不透明，管底有明显凝集片，振荡时有块状或小片絮状物(50%菌体被凝集)》。 +:液体不透明，仅管底有少许凝集 ,其余无显著的凝集块(25%菌体被凝集) 一：液体混浊，管底无凝集，菌体不被凝集，但由于菌体自然下沉，在管底中央可见圆 点状沉淀，振荡后立即散开呈均匀混浊。 表82布氏杆菌试管凝集反应 最终血清稀 皆号 1 2 34 5 67 泰释度125 对 150 1:1001:200 (纤) 抗原对照用作对 0.5%石炭酸生理盐水 0.5 0.5y 0.6人 0.5、 0.5 被检血清 0.5 0.5 0.5 抗原(120) 0.50.5 0.50.5 0.50.50.5 弃去1.5 弃去0.5 (六)当每份待检血清仅用2个稀释度进行试验时，无论任何 个稀释度发生凝集现象 该血清都应该用四个稀释度重检。 (七)判定血清凝集价：出现“+”以上凝集现象的最高血清稀释度为凝集价。牛、马 和骆驼血清凝集价1：100以上为阳性，1：50为可疑。猪、绵羊、山羊和狗的血清凝集价为 :50以上为阳性，1·25可。 三、间接血球凝集试验（以结核病为例 )致敏红血球的制备 1无菌采取绵羊血于阿氏液中，于4℃冰箱保存备用（保存期3周）。用时用生理盐水洗 涤3次。 2.用H7.4PBS稀释旧结核黄素15-60倍，每6毫升稀释的结核黄素加沉淀血清0.1 毫升。混合后置37℃水浴2小时，每15分钟振摇1次 ,以防血球沉降。 3.用生理盐水洗涤致敏红血球3次后稀释成0.25%血球悬液。 (二)间接凝集反应： 1.取被检血清1毫升加等量洗涤后的沉积红血球，室温作用10分钟后，离心除去红血 球，以吸收非特异性凝集素。56℃灭活30分钟
（三）各管中加入用 0.5％石炭酸生理盐水稀释 20 倍的布氏杆菌抗原 0.5ml（每 ml 含 菌 8 亿）。 （四）各管加抗原后，将各管充分混匀，放 37℃温箱中感作 4～10 小时，取出后放室 温 18～24 小时，然后观察并记录结果。 （五）检查猪、羊、狗时血清稀释度为 1:25，1:50，1:100，1:200；绵羊、山羊血清 用 10％浓盐水稀释。牛、马和驼骆血清稀释度为 1:50，1:100，1:200，1:400，大规模检疫 可只用两个稀释度，即狗、猪、羊为 1:25，1:50；牛、马、骆驼为 1:50 和 1:100。 判定结果时用“十”表示反应强度： ++++：液体完全透明，菌体完全被凝集呈伞状沉于管底，振荡时，沉淀物呈片状、块 状或颗粒状（即 100％的菌体被凝集）。 +++：液体略混浊，菌体大部分被凝集于管底，振荡时呈片状或颗粒状（75％菌体被凝 集）。 ++：液体不透明，管底有明显凝集片，振荡时有块状或小片絮状物（50％菌体被凝集）。 +： 液体不透明，仅管底有少许凝集，其余无显著的凝集块（25％菌体被凝集）。 －：液体混浊，管底无凝集，菌体不被凝集，但由于菌体自然下沉，在管底中央可见圆 点状沉淀，振荡后立即散开呈均匀混浊。 （六）当每份待检血清仅用 2 个稀释度进行试验时，无论任何一个稀释度发生凝集现象， 该血清都应该用四个稀释度重检。 （七）判定血清凝集价：出现“++”以上凝集现象的最高血清稀释度为凝集价。牛、马 和骆驼血清凝集价 1:100 以上为阳性，1:50 为可疑。猪、绵羊、山羊和狗的血清凝集价为 1:50 以上为阳性，1:25 可疑。 三、间接血球凝集试验（以结核病为例） （一）致敏红血球的制备 1.无菌采取绵羊血于阿氏液中，于 4℃冰箱保存备用（保存期 3 周）。用时用生理盐水洗 涤 3 次。 2．用 pH7.4PBS 稀释旧结核菌素 15～60 倍，每 6 毫升稀释的结核菌素加沉淀血清 0.1 毫升。混合后置 37℃水浴 2 小时，每 15 分钟振摇 1 次，以防血球沉降。 3．用生理盐水洗涤致敏红血球 3 次后稀释成 0.25％血球悬液。 （二）间接凝集反应： 1. 取被检血清 1 毫升加等量洗涤后的沉积红血球，室温作用 10 分钟后，离心除去红血 球，以吸收非特异性凝集素。56℃灭活 30 分钟。 表8-2 0.5％石炭酸生理盐水
2.按表83分别加入各种成分。 表83结核病间接红血球凝集试验 成分 2 3456789 10 抗原血活 对照对照 生理盐水 051 05050510510505105105105 05 025 (m) +05 051+05 05→0505051→0505 025 致血 0.1 010.101010.10.10.10101 01 未 血球0 振荡混合.于230放置过夜 弃05 3,按管底血球沉降图形判定凝集程度。血球凝集于管底呈伞状，轻轻振荡后血球呈颗 粒状或絮片状者为+：血球集中沉淀于管底呈小园点，轻摇后呈均匀混浊者为一：介于二 者之间的判为+和+。 本法诊断结核病有特异性，可诊断活动性结核。如多次检查凝集价显著升高者（升高4 倍以上)，可判为活动性结核
2. 按表 8-3 分别加入各种成分。 3．按管底血球沉降图形判定凝集程度。血球凝集于管底呈伞状，轻轻振荡后血球呈颗 粒状或絮片状者为+++；血球集中沉淀于管底呈小园点，轻摇后呈均匀混浊者为－；介于二 者之间的判为++和+。 本法诊断结核病有特异性，可诊断活动性结核。如多次检查凝集价显著升高者（升高 4 倍以上），可判为活动性结核