第十章吸光光度法 教学目的:掌握光度法的基本原理,了解光度分析条件的控制,分光光度法的应 用范围。 教学重点:Beer定律;光度分析的应用。 教学难点:光吸收原理;光度分析的准确度。 吸光光度法:基于物质对光的选择性吸收而建立起来的分析方法,包括比色法和 分光光度法 分光光度法的优点:灵敏、准确、快速、选择性好、适于微量组分的测定。 10.1吸光光度法的特点 吸光光度法的特点 1.光的基本性质 紫外光:200-400m可见光:400-750nm红外:0.75-50um 单色光:单一波长的光。复合光:由不同波长的光组成的光 互补色光:按一定比例混合,能够组成白光的两种光互称为互补色光。 溶液呈现的颜色是它吸收光的互补色 两互补色按一定比例混合后,可得到白色 、光吸收的基本定律 1.朗伯一比尔定律 1790年, Lambert用实验指出,当光通过透明介质时,光的减弱程度与光通 过介质的光程成正比。1852年,Beer研究证明了,光的吸收程度与透明介质中 光所遇到的吸光质点的数目成正比,在溶液中即与吸光质点的浓度成正比 吸光度:4=1g1=Kb透光率:T= A 2.摩尔吸收系数和桑德尔灵敏度 (1)摩尔吸收(光)系数 A=Kbc b: cm C: mo1/L A=ebcs:摩尔吸收系数,只与波长有关。单位:L.cm.mol 物理意义:一定λ下,b=1cm,c=1mol/L时的吸光度。 实际工作中不能用c=1mol/L的溶液测吸光度(A=0.2-0.7)。c能反映方
9－1 第十章 吸光光度法 教学目的：掌握光度法的基本原理，了解光度分析条件的控制，分光光度法的应 用范围。 教学重点：Beer 定律；光度分析的应用。 教学难点：光吸收原理；光度分析的准确度。 吸光光度法：基于物质对光的选择性吸收而建立起来的分析方法，包括比色法和 分光光度法。 分光光度法的优点：灵敏、准确、快速、选择性好、适于微量组分的测定。 10.1 吸光光度法的特点 一、 吸光光度法的特点 1．光的基本性质 紫外光：200-400nm 可见光：400-750nm 红外：0.75-50m 单色光：单一波长的光。 复合光：由不同波长的光组成的光。 互补色光：按一定比例混合，能够组成白光的两种光互称为互补色光。 溶液呈现的颜色是它吸收光的互补色。 两互补色按一定比例混合后，可得到白色。 二、光吸收的基本定律 1．朗伯－比尔定律 1790 年，Lambert 用实验指出，当光通过透明介质时，光的减弱程度与光通 过介质的光程成正比。1852 年，Beer 研究证明了，光的吸收程度与透明介质中 光所遇到的吸光质点的数目成正比，在溶液中即与吸光质点的浓度成正比。 吸光度： 0 lg I A Kbc I = = 透光率： 0 I T I = 0 1 lg lg I A I T = = 2．摩尔吸收系数和桑德尔灵敏度 （1）摩尔吸收（光）系数 A＝Kbc b：cm c：mol/L A=bc :摩尔吸收系数，只与波长有关。单位：L.cm-1 .mol-1 物理意义：一定下，b＝1cm，c＝1 mol/L 时的吸光度。 实际工作中不能用 c＝1 mol/L 的溶液测吸光度(A＝0.2-0.7)。能反映方
法的灵敏度,光度法测定ε:10′,一般ε:105已很灵敏。 2.吸光度的加和性 共存的多种吸光物质对同一波长光吸收的光度值分别为A,A,A,则总吸 光度为: A=A1+A2+.+An(据此可进行多组分的测定) 3、偏离朗伯一比尔定律的原因 (1).非单色光 A=bc=lg 0, 1=10-4be lot A,=Ebc=1g02, 1 2=10-B be lo2 A=l5+11m+102若6=e2,则A=bc,若6≠,A与c不成线性关系 JotI o I1+l2 (2).化学因素 介质不均匀或由于溶液本身的化学反应引起的偏离。溶液本身离解、缔合、络合 10.3显色反应和显色条件的选择 、显色反应要求 显色反应:将待测组分转化成有色化合物的的反应。M+L=ML 1.要求:(1)选择性好;(2)灵敏度高,ε>10·;(3)有色化合物ML要稳定,不 分解 (4)ML的组成要一定(只M无Mn);(5)M与L颜色差别大,吸收峰波 长差:△λ>90nm 2.显色剂:满足以上要求。有机显色剂 二、显色条件的选择 1.溶液的酸度:M+L=ML(显色剂L存在酸效应a() a.影响显色剂的溶度 b.影响M的存在状态 c.影响ML的组成和稳定性,如Fe3一磺基水杨酸pH组成颜色 2-3 紫红 4-81:2棕褐 8-101:3黄色 2.显色剂用量:显色剂过多有时会引起副反应,加入量要严格控制,可通过实验 确定
9－2 法的灵敏度，光度法测定：104，一般:105已很灵敏。 2．吸光度的加和性 共存的多种吸光物质对同一波长光吸收的光度值分别为 A1，A2，…An，则总吸 光度为： A=A1+A2+…+An （据此可进行多组分的测定） 3、偏离朗伯－比尔定律的原因 (1)．非单色光 1 2 1 2 01 02 1 1 01 2 2 2 02 1 2 01 02 01 02 1 2 01 02 lg , 10 lg , 10 A lg lg A A c 10 10 bc bc bc bc I I A bc I I A bc I I I I I I I I I I I I − − − − = = = = = = 1 2 1 2 ＋ ＋ ＝ ＝ 若 ＝ ，则 ＝ bc,若 ， 与 不成线性关系 ＋ ＋ (2)．化学因素 介质不均匀或由于溶液本身的化学反应引起的偏离。溶液本身离解、缔合、络合 10.3 显色反应和显色条件的选择 一、显色反应要求 显色反应：将待测组分转化成有色化合物的的反应。M＋L＝ML 1.要求：（1）选择性好；（2）灵敏度高，>104；（3）有色化合物 ML 要稳定，不 分解； （4）ML 的组成要一定（只 ML 无 MLn）；（5）ML 与 L 颜色差别大,吸收峰波 长差：>90nm. 2．显色剂：满足以上要求。有机显色剂 二、显色条件的选择 1.溶液的酸度：M＋L＝ML（显色剂 L 存在酸效应L（H）） a．影响显色剂的溶度 b．影响 M 的存在状态 c．影响 ML 的组成和稳定性，如 Fe3＋－磺基水杨酸 pH 组成 颜色 2-3 1：1 紫红 4-8 1：2 棕褐 8-10 1：3 黄色 2.显色剂用量：显色剂过多有时会引起副反应，加入量要严格控制，可通过实验 确定
3.温度:通过实验确定温度范围,通常在室温下进行。 4.溶剂:一般螯合物在有机溶剂中溶解度大,提高显色反应的灵敏度。如 Cu(SCN)42在水中大部分离解,几乎无色;在丙酮中呈蓝色 5.显色时间:通过实验找出适宜的显色时间。 9.干扰组分:共存组分与显色剂生成有色络合物,正干扰;生成无色络合物, 负干扰 干扰的消除 (1)控制一定酸度,使干扰组分不生色。 (2)掩蔽剂,与干扰组分生成无色物。 (3)选择适当的波长 (4)选择适当的参比液 (5)分离干扰组分 10.4测量条件的选择 测量波长的选择 (1)最大吸收原则”:选择被测物质的最大吸收波长的光作为入射光。(无干扰) (2)吸收最大,干扰最小”在最大波长处有其他物质干扰时。 、参比溶液的选择 1.M、L均无色,可用蒸馏水作参比 2.L无色,M有色,可用不加显色剂的被测试液作参比溶液 3.L有色,M无色,可选择不加试样溶液的试剂空白作参比溶液。 4.L、M均有色,可将一份试液加入适当掩蔽剂,将被测组分掩蔽起来,使之 不再与显色剂作用,而显色剂及其他试剂均按试液测定方法加入,以此作为 参比溶液。 5.改变加入试剂的顺序,使被测组分不发生显色反应,可以此溶液作为参比溶 液消除于扰。 吸光度范围的选择 吸光度范围的选择:A02-0.8(T为95%15%)(相对误差较小) 10.5目视比色法和光度计的基本部件 、目视比色法:比较透过光的强度
9－3 3.温度：通过实验确定温度范围，通常在室温下进行。 4．溶剂：一般螯合物在有机溶剂中溶解度大，提高显色反应的灵敏度。如 Cu(SCN)4 2－在水中大部分离解，几乎无色；在丙酮中呈蓝色。 5.显色时间：通过实验找出适宜的显色时间。 9．干扰组分：共存组分与显色剂生成有色络合物，正干扰；生成无色络合物， 负干扰。 干扰的消除： （1） 控制一定酸度，使干扰组分不生色。 （2） 掩蔽剂，与干扰组分生成无色物。 （3） 选择适当的波长。 （4） 选择适当的参比液 （5） 分离干扰组分 10.4 测量条件的选择 一、测量波长的选择 (1)“最大吸收原则”：选择被测物质的最大吸收波长的光作为入射光。(无干扰) (2)”吸收最大，干扰最小”：在最大波长处有其他物质干扰时。 二、参比溶液的选择 1．M、L 均无色，可用蒸馏水作参比。 2. L 无色，M 有色，可用不加显色剂的被测试液作参比溶液。 3. L 有色，M 无色，可选择不加试样溶液的试剂空白作参比溶液。 4．L、M 均有色，可将一份试液加入适当掩蔽剂，将被测组分掩蔽起来，使之 不再与显色剂作用，而显色剂及其他试剂均按试液测定方法加入，以此作为 参比溶液。 5． 改变加入试剂的顺序，使被测组分不发生显色反应，可以此溶液作为参比溶 液消除于扰。 三、 吸光度范围的选择 吸光度范围的选择：A:0.2-0.8（T 为 95%-15%）(相对误差较小) 10.5 目视比色法和光度计的基本部件 一、目视比色法：比较透过光的强度
标准色阶:在相同条件下显色,目视比较。 特点:灵敏度高,准确度低,不同人看,结果不同,不符合朗伯一比尔定律 也可用目视比色法,因为比较的是透过光。 、分光光度法 1.分光光度法的原理和特点 (1).光电比色法:比较溶液对某一波长光的吸收情况。比目视比色法的准确度和 选择性好。 (2).吸光光度法:与光电比色法的原理相同,只是二者获得单色光的方法不同, 前者使用滤光片,后者使用光栅、棱镜,因而比光电比色法的准确度和选择性 好。 2.光度计的基本部件:光源一单色器一比色皿(吸收池)一检测器一显示器 (1)光源钨丝灯:可见、红外400-1000m氢灯或氘灯:紫外190-350nm (2)单色器 a.滤光片:有机玻璃片或薄膜,利用颜色互补原理 b.棱镜:根据物质的折射率与光的波长有关。玻璃棱镜:可见,石英棱镜: 紫外、可见 C.光栅:在玻璃片或金属片上刻划均匀的线,1200条/m,衍射、干涉 原理 (3)吸收池:玻璃:可见,石英:紫外、可见 (4)检测器:光电转换器件(光电管、光电倍增光,光电二极管阵列)。利用光 电效应,光照产生光电流,测定光电流的大小。 (5)显示器:检流计:72型。数字显示:722型。数字打印:UV-240。 10.6吸光光度法的应用 、示差分光光度法 1.原理(高浓度示差分光光度法) 选用比c浓度稍小的c为参比,调透光率100%,相当于标尺扩大10倍。 4=26→4m=A4=A-4=Eb(c-0)=ab△C=Ebm,定量基础:△4=cb(:-)=EbNc a.先做△A~△c标准曲线;b测待测溶液的△A;c从标准曲线查出相应的AC; dcx=Co+△C
9－4 标准色阶：在相同条件下显色，目视比较。 特点：灵敏度高，准确度低，不同人看，结果不同，不符合朗伯－比尔定律 也可用目视比色法，因为比较的是透过光。 二、分光光度法 1．分光光度法的原理和特点 (1).光电比色法：比较溶液对某一波长光的吸收情况。比目视比色法的准确度和 选择性好。 (2).吸光光度法：与光电比色法的原理相同，只是二者获得单色光的方法不同， 前者使用滤光片，后者使用光栅、棱镜，因而比光电比色法的准确度和选择性 好。 2.光度计的基本部件：光源－单色器－比色皿（吸收池）－检测器－显示器 （1）光源 钨丝灯：可见、红外 400－1000nm 氢灯或氘灯：紫外 190－350nm （2）单色器 a．滤光片：有机玻璃片或薄膜，利用颜色互补原理。 b．棱镜：根据物质的折射率与光的波长有关。玻璃棱镜:可见,石英棱镜: 紫外、可见 c．光栅：在玻璃片或金属片上刻划均匀的线，1200 条/mm, 衍射、干涉 原理 （3）吸收池：玻璃:可见, 石英:紫外、可见 （4）检测器：光电转换器件（光电管、光电倍增光，光电二极管阵列）。利用光 电效应，光照产生光电流，测定光电流的大小。 （5）显示器：检流计：72 型。数字显示：722 型。数字打印：UV－240。 10.6 吸光光度法的应用 一、示差分光光度法 1．原理(高浓度示差分光光度法) 选用比cx浓度稍小的c0为参比,调透光率100%,相当于标尺扩大10倍。 0 0 0 ( ) ( ) 0 0 , x x x x x A c b A A A A b c c b c bc A b c c b c A c b = = = − = − == = = − = = 相对 相对 定量基础： a.先做A~c 标准曲线；b.测待测溶液的A；c.从标准曲线查出相应的c； d.cx=c0+ c
设普通光度法和示差光度法的测量误差为x%普通光度法结果:c±cx%,示差 光度法结果:c1±(c,-c)x% 二、多组分分析 1.原理:当没有合适的参比溶液时可选择双波长吸光光度法;广泛运用于环境 试样和生物试样的分析 2.应用:(1)单组分的测定:(2)两组分共存时的分别测定 作业:p2331,2,3,4,5,6
9－5 设普通光度法和示差光度法的测量误差为 x%普通光度法结果： c c x x x %，示差 光度法结果： c c c x x x − ( 0 ) % 二、多组分分析 1．原理：当没有合适的参比溶液时可选择双波长吸光光度法；广泛运用于环境 试样和生物试样的分析 2． 应用：（1）单组分的测定；（2）两组分共存时的分别测定。 作业：p233 1，2，3，4，5，6