5L 发酵罐发酵 L-乳酸（综合性试验） 实验指导书 5L 发酵罐发酵 L-乳酸实验涉及微生物学，生物工程原理，有机酸工艺学，发酵工厂设 备，工业发酵分析等多门课程内容。希望同学们复习这些相关知识，了解从生产菌种到发酵 法制备大宗化工原料的全过程。 一、 实验目的 1、 学习掌握利用发酵法生产 L-乳酸的原理和工艺操作。 2、 熟练掌握 5L 发酵罐的结构和使用方法。 3、 掌握 L-乳酸、残糖和菌体浓度的测定方法。 二、 实验原理 乳酸分子式为：CH3CH2OCOOH，分子量 90.08，因为乳酸分子内含有一个不对称的 C 原子，从而具有 D-型和 L-型两种构型。L-乳酸为右旋，D-乳酸是左旋的，当 L(+)-乳酸和 D （-）-乳酸等比例混合时，即成为消旋的 DL-乳酸。 乳酸生产有三种方法：化学合成法，酶法和微生物发酵法。发酵法制备乳酸是以淀粉、葡萄 糖、等糖类或牛乳为原料，接种微生物经发酵而生成乳酸。乳酸发酵机理主要有:Ⅰ.同型乳 酸发酵，Ⅱ.异型乳酸发酵，Ⅲ.双歧杆菌发酵。 本实验用菌为嗜热乳酸杆菌(T-1)，发酵方式为同型乳酸发酵。发酵机理如下： 葡萄糖经 EMP 途径降解为丙酮酸，丙酮酸在乳酸脱氢酶的催化下还原为乳酸。发酵 方式如下： 经过这种途径， 1 mol 葡萄糖可以生成 2 mol 乳酸，理论转化率为 100 ％。但由于 发酵过程中微生物有其他生理活动存在，实际转化率不可能达到 100 ％。一般认为转化率 在 80 ％以上者，即认为是同型乳酸发酵。工业上较好的转化率可达 96 ％。 三、实验用品 1、 实验器材 全自动式5L发酵罐 上海理工大学高机实业总公司） 手提式压力蒸汽灭菌锅 北京市将台医疗设备厂镇海联营厂 752紫外可见分光光度计 上海精密科学仪器有限公司 MY－879型生化培养箱 天津轻工业学院 DGG型电热鼓风干燥机 天津天宇机电有限公司
5L 发酵罐发酵 L-乳酸（综合性试验） 实验指导书 5L 发酵罐发酵 L-乳酸实验涉及微生物学，生物工程原理，有机酸工艺学，发酵工厂设 备，工业发酵分析等多门课程内容。希望同学们复习这些相关知识，了解从生产菌种到发酵 法制备大宗化工原料的全过程。 一、 实验目的 1、 学习掌握利用发酵法生产 L-乳酸的原理和工艺操作。 2、 熟练掌握 5L 发酵罐的结构和使用方法。 3、 掌握 L-乳酸、残糖和菌体浓度的测定方法。 二、 实验原理 乳酸分子式为：CH3CH2OCOOH，分子量 90.08，因为乳酸分子内含有一个不对称的 C 原子，从而具有 D-型和 L-型两种构型。L-乳酸为右旋，D-乳酸是左旋的，当 L(+)-乳酸和 D （-）-乳酸等比例混合时，即成为消旋的 DL-乳酸。 乳酸生产有三种方法：化学合成法，酶法和微生物发酵法。发酵法制备乳酸是以淀粉、葡萄 糖、等糖类或牛乳为原料，接种微生物经发酵而生成乳酸。乳酸发酵机理主要有:Ⅰ.同型乳 酸发酵，Ⅱ.异型乳酸发酵，Ⅲ.双歧杆菌发酵。 本实验用菌为嗜热乳酸杆菌(T-1)，发酵方式为同型乳酸发酵。发酵机理如下： 葡萄糖经 EMP 途径降解为丙酮酸，丙酮酸在乳酸脱氢酶的催化下还原为乳酸。发酵 方式如下： 经过这种途径， 1 mol 葡萄糖可以生成 2 mol 乳酸，理论转化率为 100 ％。但由于 发酵过程中微生物有其他生理活动存在，实际转化率不可能达到 100 ％。一般认为转化率 在 80 ％以上者，即认为是同型乳酸发酵。工业上较好的转化率可达 96 ％。 三、实验用品 1、 实验器材 全自动式5L发酵罐 上海理工大学高机实业总公司） 手提式压力蒸汽灭菌锅 北京市将台医疗设备厂镇海联营厂 752紫外可见分光光度计 上海精密科学仪器有限公司 MY－879型生化培养箱 天津轻工业学院 DGG型电热鼓风干燥机 天津天宇机电有限公司
YP1200型电子天平 上海精密科学仪器有限公司 GH801型超净工作台 天津净化仪器厂 TGL－16G台式高速离心机 上海医用分析仪器厂 SBA－40C型生物分析传感器 山东省科学院生物研究所 HZQ－Q恒温振荡器 东联电子技术开发有限公司 蒸汽发生器DZF-3 上海航星机械有限公司 其他：量桶、烧杯、离心管、移液管、酒精等、接种环、PH试纸 玻璃棒等 2、试剂 （1）种子培养基（g/L）：葡萄糖（玉米糖化液）30、酵母膏 5、 蛋白胨 5、CaCO3 10 （2）发酵培养基（g/L）：葡萄糖（玉米糖化液）100，酵母膏 5、 蛋白胨 5、豆浓 3 （3）8mol/lNaOH 溶液 （4） 消泡剂 四、实验程序 （1）分析方法 1．葡萄糖和 L-乳酸的测定 发酵液中葡萄糖和乳酸的测定采用 SBA-40C 型生物传感分析仪测定。方法：首先将发 酵液离心，吸取上清液，稀释 250 倍，进样测定。 2．菌体浓度的测定 发酵液经高速离心后，用 0.1moL/L 盐酸溶液洗涤沉淀除去残余 CaCO3，离心两次后， 弃上清液，将菌体悬浮于 10mL 蒸馏水中，用分光光度计测定 A580 值。 （2）操作方法 1．玉米糖化液的制备 把 500g 玉米粉加入到 2000ml 水中，每 100g 玉米加入 1mlα-淀粉酶，先加入 75%，搅拌 均匀，在 85～90℃保温 1 小时，加热煮沸，待温度再降至 90℃时，加入另外的 25%的 α-淀 粉酶，降温到 50～60℃，加 5ml 糖化酶保温 6～8 小时，得到玉米粉水解糖液。 2．种子培养 取新鲜斜面菌种一环，接入种子培养基中，于转速 150r/min 摇床中，50℃培养 16-18h。 3．5L 发酵罐发酵 ①空消：空罐灭菌。 ②实消：将发酵培养基 2.7L 从进样口倒入 5L 发酵罐中，盖上盖子。检查发酵罐安装完好后， 盖上灭菌罩，105℃灭菌 15 分钟。 ③校正：校正 pH 电极、溶氧电极（校正方法参考 5L 罐使用说明书） ④接种与发酵：在接种圈的火焰保护下，将种子培养液 300mL 倒入发酵罐中，控制发酵温 度 50℃，pH 为 6.0, 溶氧:0～20h 通风 60L/h，发酵罐搅拌 100r/min，20～72h 停止通风和 搅拌。以 NaOH 为中和剂。 ⑤测量：每隔 4h 取样，测菌体浓度、葡萄糖和 L-乳酸浓度。 (3)注意事项： ①使用 SBA～40C 生物传感分析仪要严格按照使用说明进行，进样针使用完毕后要用蒸馏 水清洗，以防进样针堵塞。 ②使用蒸汽发生器灭菌时注意蒸汽发生器压力不要太高，以免发生危险
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五、实验数据处理 发酵培养时，按照一定的时间间隔取样测定并记录，结果如下表。 时刻 时间 ／h 葡萄糖浓度 /(g/L) 菌体浓度 A600 L-乳酸浓度 /(g/L) 签名 12：00 0 16：00 4 20：00 8 24：00 12 4：00 16 8：00 20 12：00 24 16：00 28 20：00 32 24：00 36 4：00 40 8：00 44 12：00 48 16：00 52 20：00 56 24：00 60 4：00 64 8：00 68 12：00 72 六、 结果与讨论 (1) 按照上表给出的相应数据，以时间为横坐标，表中数据为纵坐标绘图，分析各量的变 化规律。 (2) 糖酸转化率(%)：生成 L-乳酸的克数与消耗葡萄糖克数之比的百分数。 参考文献： [1] 周德庆.《微生物学教程》，高等教育出版社，2002 年第 2 版 [2] 肖冬光等.《微生物工程原理》，中国轻工业出版社，2004 年 07 月第 1 版 [3] 梁世中等.《生物工程设备》，中国轻工业出版杜，2002 年 01 月第 1 版 [4] 朱懿德.《工业发酵分析》，中国轻工业出版杜，1991 年 10 月 [5] 金其荣等.《有机酸发酵工艺学》 ，中国轻工业出版杜，1997 年 5 月
五、实验数据处理 发酵培养时，按照一定的时间间隔取样测定并记录，结果如下表。 时刻 时间 ／h 葡萄糖浓度 /(g/L) 菌体浓度 A600 L-乳酸浓度 /(g/L) 签名 12：00 0 16：00 4 20：00 8 24：00 12 4：00 16 8：00 20 12：00 24 16：00 28 20：00 32 24：00 36 4：00 40 8：00 44 12：00 48 16：00 52 20：00 56 24：00 60 4：00 64 8：00 68 12：00 72 六、 结果与讨论 (1) 按照上表给出的相应数据，以时间为横坐标，表中数据为纵坐标绘图，分析各量的变 化规律。 (2) 糖酸转化率(%)：生成 L-乳酸的克数与消耗葡萄糖克数之比的百分数。 参考文献： [1] 周德庆.《微生物学教程》，高等教育出版社，2002 年第 2 版 [2] 肖冬光等.《微生物工程原理》，中国轻工业出版社，2004 年 07 月第 1 版 [3] 梁世中等.《生物工程设备》，中国轻工业出版杜，2002 年 01 月第 1 版 [4] 朱懿德.《工业发酵分析》，中国轻工业出版杜，1991 年 10 月 [5] 金其荣等.《有机酸发酵工艺学》 ，中国轻工业出版杜，1997 年 5 月