1 2005 年研究生《代谢工程》试题及答案 1．为什么说进行代谢控制分析可以揭示细胞代谢的动态变化规律？(15%) 答：代谢控制分析以生化反应体系的敏感性分析为基础，研究分析代谢控制在各途径之 间的分配规律，是一种以系统的观点对细胞内代谢调控进行定量分析的理论和实验方法。代 谢控制分析以系统观点对细胞内代谢调控进行定量分析，认为代谢控制是细胞内代谢的系统 属性，可以用酶动力学性质进行定量表示，代谢途径中酶促反应步骤对代谢的控制作用随系 统内外条件的改变而变化，用理论计算或试验确定的控制系数能够加深对代谢的控制结构特 性的理解。代谢控制分析的基本研究对象是由单步反应组成的复杂的代谢网络，其中单步反 应步骤是组成系统的基本结构单元。由于代谢系统中所有反应步骤都直接或者间接地对代谢 流和代谢物浓度产生影响。因此，对其中任一反应施加轻微的扰动，由此产生的代谢流或代 谢物浓度的变化，可以作为该反应步骤对代谢系统控制的度量。代谢控制分析从系统论的角 度考察代谢现象，把每个酶促反应作为代谢系统最基本的组成部分，同时将基因表达、酶活 水平、代谢物浓度、抑制机制、效应物、抑制剂、激活剂以及环境条件等的影响归结为对反 应的扰动，再根据代谢系统的结构特点进行系统综合分析。它的一个重要特点就是结合具体 的酶反应动力学性质来分析说明代谢网络特性，如利用与代谢网络中某一步反应具有相同参 数的酶促反应的速度方程求导获得弹性系数，或者通过体内实验测定弹性系数；根据连通原 理确定代谢网络中的控制系数，从而研究复杂代谢网络的动态变化规律。同时，利用代谢控 制分析的连通原理还能进一步推广用来描述代谢物的扰动通过代谢网络的传播的机理。因 此，进行代谢控制分析可以揭示细胞代谢的动态变化规律。 2．已知谷氨酸棒杆菌中色氨酸的生物合成途径和代谢调节机制如下图所示。试述色氨 酸工程菌株的代谢设计策略(25%)。 答：色氨酸属于芳香族氨基酸，在生物体内存在严格的调控机制。谷氨酸棒杆菌中色氨 酸的生物合成途径和代谢调节机制如图所示。在谷氨酸棒杆菌中，葡萄糖经 EMP 途径和 HMP 途径分别生成磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)和 4-磷酸赤藓糖(EP)，两者在 DAHP 合成酶(DS) 的催化下生成 3-脱氧-D-阿拉伯庚酮糖酸-7-磷酸(DAHP)。DAHP 经三步酶促反应生成莽草 酸，莽草酸经三步酶促反应生成分支酸。由分支酸产生两个分支：一方面，在邻氨基苯甲酸 合成酶(AS)催化下合成邻氨基苯甲酸，邻氨基苯甲酸在邻氨基苯甲酸磷酸核糖移换酶(PRT)、 色氨酸合成酶(TS)的催化下合成色氨酸；另一方面，分支酸在分支酸变位酶(CM)的催化下 生成预苯酸(PPA)。由预苯酸又产生两个分支：在预苯酸脱氢酶(PD)的作用下生成对羟基苯 丙酮酸，再生成酪氨酸；在预苯酸脱水酶(PT)的作用下生成苯丙酮酸，最后合成苯丙氨酸。 在分支酸处，倾向于优先合成邻氨基苯甲酸；在预苯酸处，倾向于优先合成对羟基苯丙酮酸。 （1）加速限速反应 为了积累更多的色氨酸，必须更多地增加前体物，其中包括减少 PEP 和 EP 的支路代谢， 解除苯丙氨酸和酪氨酸对 DS 的反馈调节，增加分支酸的浓度等方法。为了积累更多的 PEP， 防止丙酮酸生成更多的草酰乙酸，可以选育磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶和丙酮酸激酶活力低的 菌株或者选育硫辛酸和硫胺素(分别为丙酮酸脱羧酶系和丙酮酸羧化酶系的辅酶)双重缺陷 突变株。将编码限速酶的基因通过基因扩增，增加拷贝数并在宿主中表达以实现目的产物产 率的提高。首先，必须确定代谢途径中的限速反应及其关键酶。然后，将编码限速酶的基因 通过酶切等手段，制得特定片段，连接在高拷贝数的载体上再导入宿主中去表达。编码色氨 酸生物合成途径中的限速酶的基因有 DS 酶基因、trpE、trpD、trpC、trpB、trpA 等。trpE、 trpD、trpC、trpB、trpA 这五种结构基因集中在 DNA 的某一范围内，被同一个调节基因所
1 2005 年研究生《代谢工程》试题及答案 1．为什么说进行代谢控制分析可以揭示细胞代谢的动态变化规律？(15%) 答：代谢控制分析以生化反应体系的敏感性分析为基础，研究分析代谢控制在各途径之 间的分配规律，是一种以系统的观点对细胞内代谢调控进行定量分析的理论和实验方法。代 谢控制分析以系统观点对细胞内代谢调控进行定量分析，认为代谢控制是细胞内代谢的系统 属性，可以用酶动力学性质进行定量表示，代谢途径中酶促反应步骤对代谢的控制作用随系 统内外条件的改变而变化，用理论计算或试验确定的控制系数能够加深对代谢的控制结构特 性的理解。代谢控制分析的基本研究对象是由单步反应组成的复杂的代谢网络，其中单步反 应步骤是组成系统的基本结构单元。由于代谢系统中所有反应步骤都直接或者间接地对代谢 流和代谢物浓度产生影响。因此，对其中任一反应施加轻微的扰动，由此产生的代谢流或代 谢物浓度的变化，可以作为该反应步骤对代谢系统控制的度量。代谢控制分析从系统论的角 度考察代谢现象，把每个酶促反应作为代谢系统最基本的组成部分，同时将基因表达、酶活 水平、代谢物浓度、抑制机制、效应物、抑制剂、激活剂以及环境条件等的影响归结为对反 应的扰动，再根据代谢系统的结构特点进行系统综合分析。它的一个重要特点就是结合具体 的酶反应动力学性质来分析说明代谢网络特性，如利用与代谢网络中某一步反应具有相同参 数的酶促反应的速度方程求导获得弹性系数，或者通过体内实验测定弹性系数；根据连通原 理确定代谢网络中的控制系数，从而研究复杂代谢网络的动态变化规律。同时，利用代谢控 制分析的连通原理还能进一步推广用来描述代谢物的扰动通过代谢网络的传播的机理。因 此，进行代谢控制分析可以揭示细胞代谢的动态变化规律。 2．已知谷氨酸棒杆菌中色氨酸的生物合成途径和代谢调节机制如下图所示。试述色氨 酸工程菌株的代谢设计策略(25%)。 答：色氨酸属于芳香族氨基酸，在生物体内存在严格的调控机制。谷氨酸棒杆菌中色氨 酸的生物合成途径和代谢调节机制如图所示。在谷氨酸棒杆菌中，葡萄糖经 EMP 途径和 HMP 途径分别生成磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)和 4-磷酸赤藓糖(EP)，两者在 DAHP 合成酶(DS) 的催化下生成 3-脱氧-D-阿拉伯庚酮糖酸-7-磷酸(DAHP)。DAHP 经三步酶促反应生成莽草 酸，莽草酸经三步酶促反应生成分支酸。由分支酸产生两个分支：一方面，在邻氨基苯甲酸 合成酶(AS)催化下合成邻氨基苯甲酸，邻氨基苯甲酸在邻氨基苯甲酸磷酸核糖移换酶(PRT)、 色氨酸合成酶(TS)的催化下合成色氨酸；另一方面，分支酸在分支酸变位酶(CM)的催化下 生成预苯酸(PPA)。由预苯酸又产生两个分支：在预苯酸脱氢酶(PD)的作用下生成对羟基苯 丙酮酸，再生成酪氨酸；在预苯酸脱水酶(PT)的作用下生成苯丙酮酸，最后合成苯丙氨酸。 在分支酸处，倾向于优先合成邻氨基苯甲酸；在预苯酸处，倾向于优先合成对羟基苯丙酮酸。 （1）加速限速反应 为了积累更多的色氨酸，必须更多地增加前体物，其中包括减少 PEP 和 EP 的支路代谢， 解除苯丙氨酸和酪氨酸对 DS 的反馈调节，增加分支酸的浓度等方法。为了积累更多的 PEP， 防止丙酮酸生成更多的草酰乙酸，可以选育磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶和丙酮酸激酶活力低的 菌株或者选育硫辛酸和硫胺素(分别为丙酮酸脱羧酶系和丙酮酸羧化酶系的辅酶)双重缺陷 突变株。将编码限速酶的基因通过基因扩增，增加拷贝数并在宿主中表达以实现目的产物产 率的提高。首先，必须确定代谢途径中的限速反应及其关键酶。然后，将编码限速酶的基因 通过酶切等手段，制得特定片段，连接在高拷贝数的载体上再导入宿主中去表达。编码色氨 酸生物合成途径中的限速酶的基因有 DS 酶基因、trpE、trpD、trpC、trpB、trpA 等。trpE、 trpD、trpC、trpB、trpA 这五种结构基因集中在 DNA 的某一范围内，被同一个调节基因所
2 控制，形成色氨酸操纵子。将与色氨酸合成有关的基因克隆到质粒 pDTS9901 上，然后导入 色氨酸生产菌 BPS-13 中,在 500ml 培养基中 30℃通风培养，可产色氨酸 35.2g/L（亲株产 20.1g/L）。 谷氨酸棒杆菌中色氨酸生物合成途径及其代谢调节机制 研究发现，如果使大肠杆菌中色氨酸操纵子中的弱化子缺失，则 trp 基因表达量可提高 六倍，而且无论是在阻遏细胞内还是在永久性突变的细胞内都是这样（即无论 trpR+或 trpR-）。 因此，如果给色氨酸生产菌定向带上色氨酸弱化子缺失标记，必然会提高色氨酸的产量。 （2）改变分支代谢途径流向 提高代谢分支点某一分支代谢途径的酶活力，使其在与另外的分支代谢途径的竞争中占 据优势，可以提高目的代谢产物的产量。芳香族氨基酸生物合成中，色氨酸、酪氨酸和苯丙 氨酸三条支路上的任何一条支路的酶活性被加强，其与另两条支路的竞争将占据优势。通过 同时加强色氨酸支路代谢流和弱化苯丙氨酸、酪氨酸代谢流，可以实现色氨酸支路的最大代 谢通量。例如，将合成色氨酸的多酶基因与 DS 基因克隆到谷氨酸棒杆菌（Corynebacterium glutamicum）中，构建出色氨酸工程菌，它促使了 Trp 支路第一个产物氨茴酸 Ant 的生成， 并通过突变解除 Trp 对该质粒所编码的 Ant 合成酶和 Ant 磷酸核糖基转移酶的反馈抑制，结 果色氨酸产量达 43g/L。若再将苯丙氨酸合成相关的酶基因如 pheA 基因敲除，则可使色氨 酸产生菌产酸达 50g/L。另外，切断由分支酸到预苯酸、VK、CoQ 的代谢支路，可节约碳 源，使中间产物分支酸更多地转向合成色氨酸，而且还可以解除苯丙氨酸、酪氨酸对合成途 径中 DS 的反馈调节，从而有利于色氨酸积累。具体可采用构建预苯酸缺陷、苯丙氨酸缺陷、 酪氨酸缺陷、VK 缺陷、CoQ 缺陷等代谢改造措施。据报道，有人以谷氨酸棒杆菌为出发菌 株，经代谢改造得到的 KY9456 (Phe-+Tyr- )菌株可积累 L-色氨酸 0.15g/L。这个产量是很低 的，由此也可看出只构建缺陷型是不够的，还必须解除由色氨酸引起的反馈调节。 （3）构建 AS 酶缺陷的回复突变株，可增加色氨酸的积累。因为当 AS-的突变株发生回 复突变时，往往是恢复了酶的活性中心，而其调节中心并没有恢复，因此该酶的调节中心并
2 控制，形成色氨酸操纵子。将与色氨酸合成有关的基因克隆到质粒 pDTS9901 上，然后导入 色氨酸生产菌 BPS-13 中,在 500ml 培养基中 30℃通风培养，可产色氨酸 35.2g/L（亲株产 20.1g/L）。 谷氨酸棒杆菌中色氨酸生物合成途径及其代谢调节机制 研究发现，如果使大肠杆菌中色氨酸操纵子中的弱化子缺失，则 trp 基因表达量可提高 六倍，而且无论是在阻遏细胞内还是在永久性突变的细胞内都是这样（即无论 trpR+或 trpR-）。 因此，如果给色氨酸生产菌定向带上色氨酸弱化子缺失标记，必然会提高色氨酸的产量。 （2）改变分支代谢途径流向 提高代谢分支点某一分支代谢途径的酶活力，使其在与另外的分支代谢途径的竞争中占 据优势，可以提高目的代谢产物的产量。芳香族氨基酸生物合成中，色氨酸、酪氨酸和苯丙 氨酸三条支路上的任何一条支路的酶活性被加强，其与另两条支路的竞争将占据优势。通过 同时加强色氨酸支路代谢流和弱化苯丙氨酸、酪氨酸代谢流，可以实现色氨酸支路的最大代 谢通量。例如，将合成色氨酸的多酶基因与 DS 基因克隆到谷氨酸棒杆菌（Corynebacterium glutamicum）中，构建出色氨酸工程菌，它促使了 Trp 支路第一个产物氨茴酸 Ant 的生成， 并通过突变解除 Trp 对该质粒所编码的 Ant 合成酶和 Ant 磷酸核糖基转移酶的反馈抑制，结 果色氨酸产量达 43g/L。若再将苯丙氨酸合成相关的酶基因如 pheA 基因敲除，则可使色氨 酸产生菌产酸达 50g/L。另外，切断由分支酸到预苯酸、VK、CoQ 的代谢支路，可节约碳 源，使中间产物分支酸更多地转向合成色氨酸，而且还可以解除苯丙氨酸、酪氨酸对合成途 径中 DS 的反馈调节，从而有利于色氨酸积累。具体可采用构建预苯酸缺陷、苯丙氨酸缺陷、 酪氨酸缺陷、VK 缺陷、CoQ 缺陷等代谢改造措施。据报道，有人以谷氨酸棒杆菌为出发菌 株，经代谢改造得到的 KY9456 (Phe-+Tyr- )菌株可积累 L-色氨酸 0.15g/L。这个产量是很低 的，由此也可看出只构建缺陷型是不够的，还必须解除由色氨酸引起的反馈调节。 （3）构建 AS 酶缺陷的回复突变株，可增加色氨酸的积累。因为当 AS-的突变株发生回 复突变时，往往是恢复了酶的活性中心，而其调节中心并没有恢复，因此该酶的调节中心并
3 不能与色氨酸结合，所以解除了色氨酸的反馈抑制，而该酶的催化活性不变，因此导致色氨 酸的大量积累。同理，构建 DS 酶缺陷的回复突变株，可增加色氨酸的前体物 DAHP，因此 也有利于色氨酸的生物合成。 （4）加强 HMP 途径，有利于 PEP 和 EP 的生成，从而增加色氨酸合成的前体物，提 高色氨酸产生菌株的产酸率。 （5）切断进一步代谢途径，通过构建色氨酸酶(TN)缺失突变株，色氨酸脱羧酶缺失突 变株，色氨酰-tRNA 合成酶缺失突变株以及不分解利用色氨酸的突变株，可以减少色氨酸的 消耗，从而有利于色氨酸的积累。 3. 在酿酒酵母培养过程中葡萄糖-6-磷酸、磷酸烯醇式丙酮酸和 1，6-二磷酸果 糖节点被认为是主要节点。在酿酒酵母培养过程中添加 Mg 2+，得到如下结果（图）； 在培养液中添加 EDTA 和 NH+ 4，得到如下结果（图）。试判断葡萄糖-6-磷酸、磷酸烯 醇式丙酮酸和 1，6-二磷酸果糖节点的刚柔性(15%)。 答：通过在酿酒酵母培养过程中添加 Mg 2+，以改变相应的代谢流量，可以判断葡萄糖 -6-磷酸节点的性质。由于葡萄糖-6-磷酸经葡萄糖磷酸异构化生成果糖-6-磷酸的反应是一个 典型的可逆反应，因此在稳定态时，葡萄糖-6-磷酸与果糖-6-磷酸的流量接近平衡，这样就 可将葡萄糖-6-磷酸代替果糖-6-磷酸，看做为合成 1，6-二磷酸果糖的底物。由添加 Mg2+前 后相关途径的代谢流分配情况可以看出，添加 Mg2+能在很大程度上提高代谢途径中各个酶 的活性，并使整个代谢流量提高了 1 倍多。然而，分配进入 1，6-二磷酸果糖节点处的流量 比率却基本不变，而胞外 1，6-二磷酸果糖的流量比率也只从 7.3 增加到 16.1，不到产物理 论得率最高时流量的 1/3。以上情况说明，Mg2 +添加后对 1，6-二磷酸果糖代谢途径的流量 分配并没有发生重大变化。另一方面，从无机磷平衡的角度分析，整个代谢过程中还存在大 量的高能磷酸化合物，它们阻碍 ATP 的合成。结果表明，葡萄糖-6-磷酸并不是限制性的底 物，而 ATP 则可能是限速步骤因子，也就是说，葡萄糖-6-磷酸所处的节点是非刚性的。 Mg2+对酿酒酵母糖酵解代谢通量的影响 在发酵液中添加 EDTA，减缓 1，6-二磷酸果糖的分解速率和葡萄糖的摄取利用速率， 可知 1，6-二磷酸果糖与 ATP 的合成是否一致；在发酵液中添加 NH+ 4，以解除 ATP 等物质 对磷酸果糖激酶的抑制作用，通过增加 1，6-二磷酸果糖的量，从而刺激磷酸解酮酶的活性， 增加 ATP 的合成。故通过该实验可以验证 1，6-二磷酸果糖节点的刚性行为。上述两种情况
3 不能与色氨酸结合，所以解除了色氨酸的反馈抑制，而该酶的催化活性不变，因此导致色氨 酸的大量积累。同理，构建 DS 酶缺陷的回复突变株，可增加色氨酸的前体物 DAHP，因此 也有利于色氨酸的生物合成。 （4）加强 HMP 途径，有利于 PEP 和 EP 的生成，从而增加色氨酸合成的前体物，提 高色氨酸产生菌株的产酸率。 （5）切断进一步代谢途径，通过构建色氨酸酶(TN)缺失突变株，色氨酸脱羧酶缺失突 变株，色氨酰-tRNA 合成酶缺失突变株以及不分解利用色氨酸的突变株，可以减少色氨酸的 消耗，从而有利于色氨酸的积累。 3. 在酿酒酵母培养过程中葡萄糖-6-磷酸、磷酸烯醇式丙酮酸和 1，6-二磷酸果 糖节点被认为是主要节点。在酿酒酵母培养过程中添加 Mg 2+，得到如下结果（图）； 在培养液中添加 EDTA 和 NH+ 4，得到如下结果（图）。试判断葡萄糖-6-磷酸、磷酸烯 醇式丙酮酸和 1，6-二磷酸果糖节点的刚柔性(15%)。 答：通过在酿酒酵母培养过程中添加 Mg 2+，以改变相应的代谢流量，可以判断葡萄糖 -6-磷酸节点的性质。由于葡萄糖-6-磷酸经葡萄糖磷酸异构化生成果糖-6-磷酸的反应是一个 典型的可逆反应，因此在稳定态时，葡萄糖-6-磷酸与果糖-6-磷酸的流量接近平衡，这样就 可将葡萄糖-6-磷酸代替果糖-6-磷酸，看做为合成 1，6-二磷酸果糖的底物。由添加 Mg2+前 后相关途径的代谢流分配情况可以看出，添加 Mg2+能在很大程度上提高代谢途径中各个酶 的活性，并使整个代谢流量提高了 1 倍多。然而，分配进入 1，6-二磷酸果糖节点处的流量 比率却基本不变，而胞外 1，6-二磷酸果糖的流量比率也只从 7.3 增加到 16.1，不到产物理 论得率最高时流量的 1/3。以上情况说明，Mg2 +添加后对 1，6-二磷酸果糖代谢途径的流量 分配并没有发生重大变化。另一方面，从无机磷平衡的角度分析，整个代谢过程中还存在大 量的高能磷酸化合物，它们阻碍 ATP 的合成。结果表明，葡萄糖-6-磷酸并不是限制性的底 物，而 ATP 则可能是限速步骤因子，也就是说，葡萄糖-6-磷酸所处的节点是非刚性的。 Mg2+对酿酒酵母糖酵解代谢通量的影响 在发酵液中添加 EDTA，减缓 1，6-二磷酸果糖的分解速率和葡萄糖的摄取利用速率， 可知 1，6-二磷酸果糖与 ATP 的合成是否一致；在发酵液中添加 NH+ 4，以解除 ATP 等物质 对磷酸果糖激酶的抑制作用，通过增加 1，6-二磷酸果糖的量，从而刺激磷酸解酮酶的活性， 增加 ATP 的合成。故通过该实验可以验证 1，6-二磷酸果糖节点的刚性行为。上述两种情况
4 下的代谢流量分配结果表明，添加 EDTA 与添加 Mg2+相比，代谢途径的整体物质流量下降 了近 30%，但 1，6-二磷酸果糖节点处的流量分配基本没有发生改变；添加 NH4Cl 后的代谢 流量增加了近 30%，然而 1，6-二磷酸果糖节点处的流量分配也基本没有变化。故可以判断 1，6-二磷酸果糖所处的节点也不是刚性的。 酿酒酵母糖酵解代谢途径中 1，6-二磷酸果糖节点的柔刚性判断 在前面两组实验中，代谢流量的变化情形与含有刚性节点的依赖型网络的应答相一致， 这说明在 1，6-二磷酸果糖代谢途径中至少有一个刚性节点。既然葡萄糖-6-磷酸和 1，6-二 磷酸果糖所处的节点都不是刚性的，因此可推断磷酸烯醇式丙酮酸节点是惟一的刚性节点。 事实上，磷酸烯醇式丙酮酸在网络中的独特地位也决定了其节点的性质，它被丙酮酸激酶催 化生成丙酮酸和 ATP，而后者一方面是丙酮酸激酶的抑制剂，起到抑制磷酸烯醇式丙酮酸分 解的作用，另一方面又是果糖-6-磷酸转化为 1，6-二磷酸果糖的底物，在一定浓度范围内能 激活磷酸果糖激酶。从依赖型网络的刚性特征来看，也可以得出上述结论。 4. 代谢工程操作应包括哪些基本过程？(20%) 答：代谢工程操作至少应包括下列基本过程。 （1）代谢分析与代谢设计 代谢工程的研究对象是代谢途径，因此必须对代谢网络中的一些酶及产物进行研 究和分析。相对于随机突变而言，代谢工程的一个显著特点就是工作具有定向性，因 为它在修饰靶点选择、试验设计以及数据分析方面占有绝对优势。然而，从自然界分 离具有特殊性状的野生型微生物菌种以及利用传统诱变方法筛选遗传性状优良的菌 种，则是代谢设计和靶点选择的重要信息资源和理论依据。经过长达数十年的研究， 生物化学家已对相当数量生物细胞内的代谢途径进行了鉴定，并绘制出较完整的代谢 网络图，这就为代谢工程的实施奠定了基础。然而，正确的靶点设计还必须对现有的 代谢途径和代谢网络信息进行更深入的分析。首先，根据化学动力学和计量学原理测 定代谢网络中的代谢流分布（即代谢流分析），其中最重要的是细胞内碳和氮元素的 流向比例关系；其次，在代谢流分析的基础上调查其控制状态、机制和影响因素（即 代谢控制分析）；最后，根据代谢流分布和控制的分析结果，确定代谢设计的合理靶 点，通常包括拟修饰基因的靶点、拟导入途径的靶点或者拟阻断途径的靶点等。特别 需要强调的是，代谢分析与代谢设计对代谢工程的成败起着关键作用，任何精细的靶
4 下的代谢流量分配结果表明，添加 EDTA 与添加 Mg2+相比，代谢途径的整体物质流量下降 了近 30%，但 1，6-二磷酸果糖节点处的流量分配基本没有发生改变；添加 NH4Cl 后的代谢 流量增加了近 30%，然而 1，6-二磷酸果糖节点处的流量分配也基本没有变化。故可以判断 1，6-二磷酸果糖所处的节点也不是刚性的。 酿酒酵母糖酵解代谢途径中 1，6-二磷酸果糖节点的柔刚性判断 在前面两组实验中，代谢流量的变化情形与含有刚性节点的依赖型网络的应答相一致， 这说明在 1，6-二磷酸果糖代谢途径中至少有一个刚性节点。既然葡萄糖-6-磷酸和 1，6-二 磷酸果糖所处的节点都不是刚性的，因此可推断磷酸烯醇式丙酮酸节点是惟一的刚性节点。 事实上，磷酸烯醇式丙酮酸在网络中的独特地位也决定了其节点的性质，它被丙酮酸激酶催 化生成丙酮酸和 ATP，而后者一方面是丙酮酸激酶的抑制剂，起到抑制磷酸烯醇式丙酮酸分 解的作用，另一方面又是果糖-6-磷酸转化为 1，6-二磷酸果糖的底物，在一定浓度范围内能 激活磷酸果糖激酶。从依赖型网络的刚性特征来看，也可以得出上述结论。 4. 代谢工程操作应包括哪些基本过程？(20%) 答：代谢工程操作至少应包括下列基本过程。 （1）代谢分析与代谢设计 代谢工程的研究对象是代谢途径，因此必须对代谢网络中的一些酶及产物进行研 究和分析。相对于随机突变而言，代谢工程的一个显著特点就是工作具有定向性，因 为它在修饰靶点选择、试验设计以及数据分析方面占有绝对优势。然而，从自然界分 离具有特殊性状的野生型微生物菌种以及利用传统诱变方法筛选遗传性状优良的菌 种，则是代谢设计和靶点选择的重要信息资源和理论依据。经过长达数十年的研究， 生物化学家已对相当数量生物细胞内的代谢途径进行了鉴定，并绘制出较完整的代谢 网络图，这就为代谢工程的实施奠定了基础。然而，正确的靶点设计还必须对现有的 代谢途径和代谢网络信息进行更深入的分析。首先，根据化学动力学和计量学原理测 定代谢网络中的代谢流分布（即代谢流分析），其中最重要的是细胞内碳和氮元素的 流向比例关系；其次，在代谢流分析的基础上调查其控制状态、机制和影响因素（即 代谢控制分析）；最后，根据代谢流分布和控制的分析结果，确定代谢设计的合理靶 点，通常包括拟修饰基因的靶点、拟导入途径的靶点或者拟阻断途径的靶点等。特别 需要强调的是，代谢分析与代谢设计对代谢工程的成败起着关键作用，任何精细的靶
5 点选择都必须经得起细胞生理特性以及代谢网络热力学平衡的检验。 （2）基因操作 利用代谢工程战略修饰改造细胞代谢网络的核心是在分子水平上对靶基因或基 因簇进行遗传操作，其中最典型的形式包括基因或基因簇的克隆、表达、修饰、敲除、 调控、构建特殊的基因转移系统以及重组基因在目的细胞染色体 DNA 上的稳定整合。 后者通常被认为是代谢工程重要的特征操作技术，因为在以高效表达目的基因编码产 物为主要目标的基因工程和以生产突变体蛋白为特征的蛋白质工程中，重组 DNA 分 子一般独立于受体细胞染色体而进行自主复制。 在代谢工程的一些应用实例中，代谢流的控制和分析也可绕过基因操作，直接通 过发酵和细胞培养的工艺和过程参数控制提高细胞代谢流，并强制使代谢流流向所期 望的目标产物。在此过程中，改变反应体系内的溶氧、pH、温度、流加补料等因素， 在酶或相关蛋白因子水平上激活目的基因的转录（诱导作用）、调节酶的活性（阻遏、 变构、抑制或脱敏作用），进而达到改变和控制细胞代谢流的目的。必须指出的是， 虽然就提高目的产物的产量而言，上述非基因水平的工艺优化操作与典型的基因操作 在效果上也许没有显著的差异，但在新产物的合成尤其是遗传性状的改良等方面，基 因操作是不可代替的，因为只有引入外源的基因或基因簇，才能从根本上改造细胞的 代谢途径，甚至重新构建新的代谢旁路。 （3）效果分析 很多研究结果表明，一次性的代谢设计和基因操作往往并不能达到实际生产所要 求的产量、速率或浓度，因为大部分实验涉及到的只是与单一代谢途径有关的基因、 操纵子或基因簇的改变。然而通过对新途径进行全面的效果分析，根据由初步代谢操 作所构建出来的细胞所表现出的限制与缺陷，可以作为新一轮实验的改进目标。如此 反复进行遗传操作即可获得优良物种。目前，通过上述代谢工程循环获得成功的范例 已有很多，所积累的经验有助于鉴定和判断哪一类特定的遗传操作对细胞功能的有目 的的改变是相对有效的。 5. 已知在现存途径中改变目的产物的代谢流可以增加目的产物的积累，试述其 实现策略(25%)。 答：在现存途径中改变目的产物的代谢流可以增加目的产物的积累，一般来讲， 在处于正常生理状态下的细胞内，对于某一特定代谢产物的生物合成途径而言，其代 谢流变化规律是恒定的。要增加目的产物的积累，可以从以下几个方面入手： （1）增加代谢途径中限速酶编码基因的拷贝数 将编码限速酶的基因通过基因扩增，增加拷贝数，在宿主中表达以实现目的产物 产率的上升。首先，必须确定代谢途径中的限速反应及其关键酶。然后，将编码限速 酶的基因通过酶切等手段，制得特定片段，连接在高拷贝数的载体上，再导入宿主中 去表达。这一战略并没有改变代谢途径的组成和流向，而是增加关键酶基因在细胞内 的剂量，通过提高细胞内酶分子的浓度来促进限速步骤的生化反应，进而导致最终产 物的产量增加。但是，增加限速酶拷贝有时并不有效。通过控制整个调节途径中酶活 性于一定水平来增加所需要的代谢流量，而保持其它代谢流量不变，往往更加有效。 因为，代谢网络是一个整体，限速反应流量的改变也许会对整个代谢途径造成严重影 响，使得目的代谢产物产量可能更低。 （2）强化以启动子为主的关键基因的表达系统 通过强化以启动子为主的关键基因的表达系统，以实现目的产物产率的上升。在 此情况下，重组质粒在受体细胞中的拷贝数并未增加，强启动子只是高效率地促进结
5 点选择都必须经得起细胞生理特性以及代谢网络热力学平衡的检验。 （2）基因操作 利用代谢工程战略修饰改造细胞代谢网络的核心是在分子水平上对靶基因或基 因簇进行遗传操作，其中最典型的形式包括基因或基因簇的克隆、表达、修饰、敲除、 调控、构建特殊的基因转移系统以及重组基因在目的细胞染色体 DNA 上的稳定整合。 后者通常被认为是代谢工程重要的特征操作技术，因为在以高效表达目的基因编码产 物为主要目标的基因工程和以生产突变体蛋白为特征的蛋白质工程中，重组 DNA 分 子一般独立于受体细胞染色体而进行自主复制。 在代谢工程的一些应用实例中，代谢流的控制和分析也可绕过基因操作，直接通 过发酵和细胞培养的工艺和过程参数控制提高细胞代谢流，并强制使代谢流流向所期 望的目标产物。在此过程中，改变反应体系内的溶氧、pH、温度、流加补料等因素， 在酶或相关蛋白因子水平上激活目的基因的转录（诱导作用）、调节酶的活性（阻遏、 变构、抑制或脱敏作用），进而达到改变和控制细胞代谢流的目的。必须指出的是， 虽然就提高目的产物的产量而言，上述非基因水平的工艺优化操作与典型的基因操作 在效果上也许没有显著的差异，但在新产物的合成尤其是遗传性状的改良等方面，基 因操作是不可代替的，因为只有引入外源的基因或基因簇，才能从根本上改造细胞的 代谢途径，甚至重新构建新的代谢旁路。 （3）效果分析 很多研究结果表明，一次性的代谢设计和基因操作往往并不能达到实际生产所要 求的产量、速率或浓度，因为大部分实验涉及到的只是与单一代谢途径有关的基因、 操纵子或基因簇的改变。然而通过对新途径进行全面的效果分析，根据由初步代谢操 作所构建出来的细胞所表现出的限制与缺陷，可以作为新一轮实验的改进目标。如此 反复进行遗传操作即可获得优良物种。目前，通过上述代谢工程循环获得成功的范例 已有很多，所积累的经验有助于鉴定和判断哪一类特定的遗传操作对细胞功能的有目 的的改变是相对有效的。 5. 已知在现存途径中改变目的产物的代谢流可以增加目的产物的积累，试述其 实现策略(25%)。 答：在现存途径中改变目的产物的代谢流可以增加目的产物的积累，一般来讲， 在处于正常生理状态下的细胞内，对于某一特定代谢产物的生物合成途径而言，其代 谢流变化规律是恒定的。要增加目的产物的积累，可以从以下几个方面入手： （1）增加代谢途径中限速酶编码基因的拷贝数 将编码限速酶的基因通过基因扩增，增加拷贝数，在宿主中表达以实现目的产物 产率的上升。首先，必须确定代谢途径中的限速反应及其关键酶。然后，将编码限速 酶的基因通过酶切等手段，制得特定片段，连接在高拷贝数的载体上，再导入宿主中 去表达。这一战略并没有改变代谢途径的组成和流向，而是增加关键酶基因在细胞内 的剂量，通过提高细胞内酶分子的浓度来促进限速步骤的生化反应，进而导致最终产 物的产量增加。但是，增加限速酶拷贝有时并不有效。通过控制整个调节途径中酶活 性于一定水平来增加所需要的代谢流量，而保持其它代谢流量不变，往往更加有效。 因为，代谢网络是一个整体，限速反应流量的改变也许会对整个代谢途径造成严重影 响，使得目的代谢产物产量可能更低。 （2）强化以启动子为主的关键基因的表达系统 通过强化以启动子为主的关键基因的表达系统，以实现目的产物产率的上升。在 此情况下，重组质粒在受体细胞中的拷贝数并未增加，强启动子只是高效率地促进结
6 构基因的转录，以合成更多的 mRNA，并翻译出更多的关键酶分子。例如在混旋肉碱 的生物转化过程中，将来自大肠杆菌的 caiDE 基因克隆到 pSP72 质粒的 T7 启动子的 下游，构建出的工程菌株可合成超过野生型菌株数百倍的转化酶，从而大大加快了 D-肉碱转化为 L-肉碱的速度。 （3）提高目标途径激活因子的合成速率 激活因子是生物体内基因表达的开关，它的存在和参与往往能触发相关基因的正 常转录，因此，通过代谢工程方法提高目标途径激活因子的合成速率，从理论上讲能 促进目标途径关键酶基因的表达。例如在产多诺红霉素的波赛链霉菌中，作为抗生素 生物合成激活因子的 dnrI 基因产物，其过量表达有利于多诺红霉素的大量积累。同 样在灰色链霉菌中，由于基因表达顺式元件激活因子 StrR 的存在，可以大幅度提高 链霉素生物合成途径中链霉胍合成关键酶 StrBr 的表达。 （4）灭活目标途径抑制因子的编码基因 灭活目标途径抑制因子的编码基因的目的，就是去除代谢途径中具有反馈抑制或 反馈阻遏作用的某些因子或者这些因子作用的 DNA 靶位点（如操纵子），从而解除其 对代谢途径的反馈抑制或反馈阻遏作用，从而提高目标代谢流。 （5）阻断与目标途径相竞争的代谢途径 细胞内各相关途径的偶联是代谢网络的存在形式，任何目标途径必定会与多个相 关途径共享同一种底物分子和能量形式。因此，在不影响细胞基本状态的前提下，通 过阻断或者降低竞争途径的代谢流，使更多的底物和能量进入目标途径，无疑对目标 产物的提高非常有益。但是这种操作往往容易导致代谢网络综合平衡的破坏。 （6）改变分支代谢途径流向 提高代谢分支点某一分支代谢途径的酶活力，使其在与另外的分支代谢途径的竞 争中占据优势，就可以提高目的代谢产物产量。赖氨酸工程菌的构建是改变分支代谢 途径流向的一个典型例子。众所周知，高丝氨酸脱氢酶缺陷（Hom-）突变株由于缺乏 催化天冬氨酸半醛为高丝氨酸的高丝氨酸脱氢酶，因此丧失了合成高丝氨酸（Hom） 的能力，从而使分支代谢流流向赖氨酸分支，通过克隆这一支路上的相关酶基因（如 二氢吡啶-2，6-二羧酸合成酶基因），所得工程菌可以积累大量赖氨酸。相反，如果 将编码高丝氨酸脱氢酶（HD）的基因连接在多拷贝的载体质粒上并克隆，使该基因进 行扩增，则代谢流将明显转到合成蛋氨酸和苏氨酸的支路上。 （7）构建代谢旁路 高密度培养技术在发酵生产中是研究热点之一。为实现大肠杆菌工程菌株的高密 度培养，必须阻断或降低对细胞生长有抑制作用的有毒物质的产生。当大肠杆菌糖代 谢末端产物乙酸达到一定浓度后，便会明显造成细胞生长受到抑制。应用代谢工程的 方法，将枯草杆菌的乙酰乳酸合成酶基因克隆到大肠杆菌中，构建新的代谢支路，结 果可明显改变细胞糖代谢流，使乙酸处于较低水平，从而实现高密度培养目的。 （8）改变能量代谢途径 改变能量代谢途径或电子传递系统也可以有效改变代谢流。例如，将血红蛋白基 因导入大肠杆菌或链霉菌中，不仅在限氧条件下可以提高宿主细胞的生长速率，而且 也可以促进蛋白质和抗生素合成，这里表达的血红蛋白并不是直接作用于生物合成途 径，而是在限氧条件下提高了 ATP 的产生效率。将血红蛋白基因克隆到酿酒酵母中， 由于表达的血红蛋白的存在活跃了酵母细胞的呼吸链，间接影响到线粒体的乙醛歧化 途径。由于这一途径产生的乙醇占总量的三分之一，所以可明显提高乙醇产量
6 构基因的转录，以合成更多的 mRNA，并翻译出更多的关键酶分子。例如在混旋肉碱 的生物转化过程中，将来自大肠杆菌的 caiDE 基因克隆到 pSP72 质粒的 T7 启动子的 下游，构建出的工程菌株可合成超过野生型菌株数百倍的转化酶，从而大大加快了 D-肉碱转化为 L-肉碱的速度。 （3）提高目标途径激活因子的合成速率 激活因子是生物体内基因表达的开关，它的存在和参与往往能触发相关基因的正 常转录，因此，通过代谢工程方法提高目标途径激活因子的合成速率，从理论上讲能 促进目标途径关键酶基因的表达。例如在产多诺红霉素的波赛链霉菌中，作为抗生素 生物合成激活因子的 dnrI 基因产物，其过量表达有利于多诺红霉素的大量积累。同 样在灰色链霉菌中，由于基因表达顺式元件激活因子 StrR 的存在，可以大幅度提高 链霉素生物合成途径中链霉胍合成关键酶 StrBr 的表达。 （4）灭活目标途径抑制因子的编码基因 灭活目标途径抑制因子的编码基因的目的，就是去除代谢途径中具有反馈抑制或 反馈阻遏作用的某些因子或者这些因子作用的 DNA 靶位点（如操纵子），从而解除其 对代谢途径的反馈抑制或反馈阻遏作用，从而提高目标代谢流。 （5）阻断与目标途径相竞争的代谢途径 细胞内各相关途径的偶联是代谢网络的存在形式，任何目标途径必定会与多个相 关途径共享同一种底物分子和能量形式。因此，在不影响细胞基本状态的前提下，通 过阻断或者降低竞争途径的代谢流，使更多的底物和能量进入目标途径，无疑对目标 产物的提高非常有益。但是这种操作往往容易导致代谢网络综合平衡的破坏。 （6）改变分支代谢途径流向 提高代谢分支点某一分支代谢途径的酶活力，使其在与另外的分支代谢途径的竞 争中占据优势，就可以提高目的代谢产物产量。赖氨酸工程菌的构建是改变分支代谢 途径流向的一个典型例子。众所周知，高丝氨酸脱氢酶缺陷（Hom-）突变株由于缺乏 催化天冬氨酸半醛为高丝氨酸的高丝氨酸脱氢酶，因此丧失了合成高丝氨酸（Hom） 的能力，从而使分支代谢流流向赖氨酸分支，通过克隆这一支路上的相关酶基因（如 二氢吡啶-2，6-二羧酸合成酶基因），所得工程菌可以积累大量赖氨酸。相反，如果 将编码高丝氨酸脱氢酶（HD）的基因连接在多拷贝的载体质粒上并克隆，使该基因进 行扩增，则代谢流将明显转到合成蛋氨酸和苏氨酸的支路上。 （7）构建代谢旁路 高密度培养技术在发酵生产中是研究热点之一。为实现大肠杆菌工程菌株的高密 度培养，必须阻断或降低对细胞生长有抑制作用的有毒物质的产生。当大肠杆菌糖代 谢末端产物乙酸达到一定浓度后，便会明显造成细胞生长受到抑制。应用代谢工程的 方法，将枯草杆菌的乙酰乳酸合成酶基因克隆到大肠杆菌中，构建新的代谢支路，结 果可明显改变细胞糖代谢流，使乙酸处于较低水平，从而实现高密度培养目的。 （8）改变能量代谢途径 改变能量代谢途径或电子传递系统也可以有效改变代谢流。例如，将血红蛋白基 因导入大肠杆菌或链霉菌中，不仅在限氧条件下可以提高宿主细胞的生长速率，而且 也可以促进蛋白质和抗生素合成，这里表达的血红蛋白并不是直接作用于生物合成途 径，而是在限氧条件下提高了 ATP 的产生效率。将血红蛋白基因克隆到酿酒酵母中， 由于表达的血红蛋白的存在活跃了酵母细胞的呼吸链，间接影响到线粒体的乙醛歧化 途径。由于这一途径产生的乙醇占总量的三分之一，所以可明显提高乙醇产量