2003—2004 年度生物工程专业 《代谢控制发酵》考试试卷及答案（2004 年 6 月） 班级——————姓名————————得分—————— 一、 名词解释（20 分）： 1. Catabolit repression (2 分) 分解代谢物阻遏 ：在培养基中有多种营养物质时，微生物先选择利用易分解利用的营 养物质，而这种营养物质的分解，对分解利用其它营养物物质所需酶的合成起阻遏作用。 其实质是细胞内 cAMP 少了。 2．Pasteur effect (2 分) 巴斯德效应：微生物细胞的有氧呼吸抑制了发酵作用。酵母发酵酒精时，由于供氧使 TCA 循环加快，ATP 增加，细胞内能荷增大，反馈抑制和阻遏 EMP 途径中关键酶 FPK 酶，使酒 精产量下降。 3.Energy charge (2 分) 能荷：是细胞内能量状态的一个认为假设参数，指细胞内含有的核苷酸中相当于 ATP 的数 量百分比。 能荷＝{[ATP]＋1/2[ADP]}/{ [ATP] ＋[ADP]＋[AMP]×100% 4.Concerted feedback inhibition 协同反馈抑制： 在代谢途径中，会产生两个以上的代谢产物，任何一种代谢产物的积累都 不会对代谢途径的第一步反应得酶起抑制作用，只有当代谢产物同时过量积累时，才会对代 谢途径的第一步反应得酶起抑制作用。 5.Cooperte (synergistic)feedback inhibition 增效性反馈抑制：在代谢途径中，每种代谢产物只能单独地、部分地抑制第一步反应的酶。 当它们均过量积累时，对反应第一步酶起强烈的抑制作用。此时，抑制作用大于两种代谢产 物单独抑制作用之和。 6.Metabolic interlock 代谢互锁：在代谢途径中，前端反应的酶受到与其看似无关的代谢产物的抑制（阻遏）作用。 7.Analogue-resistent mutant 抗代谢结构类似物突变株：对于代谢产物的结构类似物的抗性突变株。代谢产物对代谢途径 有抑制（阻遏作用），使其酶不能合成，而代谢结构类似物存在时，与代谢产物结构类似， 起相同作用，使反应的酶无法合成，但结构类似物并不减少（因为它不参与蛋白质代谢）。 其抗性菌株就是在代谢结构类似物存在的情况下，仍能合成代谢产物，使产物大量积累。 8.Antigen carrier lipid (ACL)
2003—2004 年度生物工程专业 《代谢控制发酵》考试试卷及答案（2004 年 6 月） 班级——————姓名————————得分—————— 一、 名词解释（20 分）： 1. Catabolit repression (2 分) 分解代谢物阻遏 ：在培养基中有多种营养物质时，微生物先选择利用易分解利用的营 养物质，而这种营养物质的分解，对分解利用其它营养物物质所需酶的合成起阻遏作用。 其实质是细胞内 cAMP 少了。 2．Pasteur effect (2 分) 巴斯德效应：微生物细胞的有氧呼吸抑制了发酵作用。酵母发酵酒精时，由于供氧使 TCA 循环加快，ATP 增加，细胞内能荷增大，反馈抑制和阻遏 EMP 途径中关键酶 FPK 酶，使酒 精产量下降。 3.Energy charge (2 分) 能荷：是细胞内能量状态的一个认为假设参数，指细胞内含有的核苷酸中相当于 ATP 的数 量百分比。 能荷＝{[ATP]＋1/2[ADP]}/{ [ATP] ＋[ADP]＋[AMP]×100% 4.Concerted feedback inhibition 协同反馈抑制： 在代谢途径中，会产生两个以上的代谢产物，任何一种代谢产物的积累都 不会对代谢途径的第一步反应得酶起抑制作用，只有当代谢产物同时过量积累时，才会对代 谢途径的第一步反应得酶起抑制作用。 5.Cooperte (synergistic)feedback inhibition 增效性反馈抑制：在代谢途径中，每种代谢产物只能单独地、部分地抑制第一步反应的酶。 当它们均过量积累时，对反应第一步酶起强烈的抑制作用。此时，抑制作用大于两种代谢产 物单独抑制作用之和。 6.Metabolic interlock 代谢互锁：在代谢途径中，前端反应的酶受到与其看似无关的代谢产物的抑制（阻遏）作用。 7.Analogue-resistent mutant 抗代谢结构类似物突变株：对于代谢产物的结构类似物的抗性突变株。代谢产物对代谢途径 有抑制（阻遏作用），使其酶不能合成，而代谢结构类似物存在时，与代谢产物结构类似， 起相同作用，使反应的酶无法合成，但结构类似物并不减少（因为它不参与蛋白质代谢）。 其抗性菌株就是在代谢结构类似物存在的情况下，仍能合成代谢产物，使产物大量积累。 8.Antigen carrier lipid (ACL)
抗原载体脂(antigen carrier lipid) 简称 ACL。它是细菌萜醇，其结构式为：含有 11 个异 戊二烯单位的醇。ACL 存在于细胞膜上，它的长长的非极性烃链插在脂肪质双分子层的非 极性区，而分子的极性末端（磷酸根一端）则是游离状态，作为细胞质水相中的多糖装配单 位的受体，并且象手臂一样把它共价结合着，已在细菌胞膜内侧形成的多糖单位转运到膜的 外面，组成肽聚糖脂多糖等细胞表层的聚糖复合物。 9.Preferenced synthsis 2、优先合成与平衡合成 A B C D E F G 优先合成：代谢途径中，产生 E,G 两种代谢产物。酶 a 的活性大于酶 b。所以优先合成 E。E 积累后，酶 a 活性受抑制，C 流向 G，G 积累后又抑制了酶 c。 二、 填空（10 分）每空白点 2.5 分。 在下列营养条件下填写 E.coli 的乳酸操纵子的表达方式： 1、 当无葡萄糖、细胞 cAMP 水平高、又无乳糖时， 不表达 。 2、 当无葡萄糖、细胞 cAMP 水平高、有乳糖时， 大量表达 。 3、 当有葡萄糖、细胞 cAMP 水平高、又无乳糖时， 不表达 。 4、 当有葡萄糖、细胞 cAMP 水平高、有乳糖时， 少量表达 。 三、 画图并简述（30 分） 1、原核生物细胞和真核生物细胞代谢调节的部位。（6 分） 图 2—1 原核微生物细胞的代谢调节部位（模式图） 1-可溶性营养物质或代谢产物的跨膜传送 2-代谢途径的酶催化作用 3-酶和载体蛋白的合成 图 2—2 真核微生物细胞的代谢调节部位 1-可溶性营养物质或代谢产物的跨膜传送 2-代谢途径的酶的催化 3-核中进行的转录 a b c
抗原载体脂(antigen carrier lipid) 简称 ACL。它是细菌萜醇，其结构式为：含有 11 个异 戊二烯单位的醇。ACL 存在于细胞膜上，它的长长的非极性烃链插在脂肪质双分子层的非 极性区，而分子的极性末端（磷酸根一端）则是游离状态，作为细胞质水相中的多糖装配单 位的受体，并且象手臂一样把它共价结合着，已在细菌胞膜内侧形成的多糖单位转运到膜的 外面，组成肽聚糖脂多糖等细胞表层的聚糖复合物。 9.Preferenced synthsis 2、优先合成与平衡合成 A B C D E F G 优先合成：代谢途径中，产生 E,G 两种代谢产物。酶 a 的活性大于酶 b。所以优先合成 E。E 积累后，酶 a 活性受抑制，C 流向 G，G 积累后又抑制了酶 c。 二、 填空（10 分）每空白点 2.5 分。 在下列营养条件下填写 E.coli 的乳酸操纵子的表达方式： 1、 当无葡萄糖、细胞 cAMP 水平高、又无乳糖时， 不表达 。 2、 当无葡萄糖、细胞 cAMP 水平高、有乳糖时， 大量表达 。 3、 当有葡萄糖、细胞 cAMP 水平高、又无乳糖时， 不表达 。 4、 当有葡萄糖、细胞 cAMP 水平高、有乳糖时， 少量表达 。 三、 画图并简述（30 分） 1、原核生物细胞和真核生物细胞代谢调节的部位。（6 分） 图 2—1 原核微生物细胞的代谢调节部位（模式图） 1-可溶性营养物质或代谢产物的跨膜传送 2-代谢途径的酶催化作用 3-酶和载体蛋白的合成 图 2—2 真核微生物细胞的代谢调节部位 1-可溶性营养物质或代谢产物的跨膜传送 2-代谢途径的酶的催化 3-核中进行的转录 a b c
4-细胞质中进行的翻译 5-细胞内溶质的跨膜传送 2、阿拉伯糖对 E.coli 利用阿拉伯糖的酶系合成的诱导机制（10 分） 图 2-12 阿拉伯糖对 ara 操纵子 araC 位点的调控作用 当大肠杆菌细胞以阿拉伯糖作为生长所需碳源和能源时，它们产生三种将阿拉伯糖转化 为木酮糖的酶。 L-Ara L-Ru L-Ru-5-○P D-Xu-5-○P 1——L-阿拉伯糖异构酶 2——核酮糖酸酶 3——5-○P 核酮糖差向异构酶 它们分别是三个基因（B.A.D）编码的产物。这三个基因在 E.coli 中是属于阿拉伯糖操 纵子中的一个基因簇，称为 araB.A.D，另外两个基因 araE 和 araF 位于基因簇 araB.A.D 远离 的地方，负责阿拉伯糖的跨膜运输的，araE 编码一种膜蛋白，araF 编码一种位于细胞壁与 细胞膜之间的阿拉伯糖结合蛋白。 与 araB.A.D 相邻的是一个复合的启动子区和一个调节基因 araC，这个调节基因的性质 和我们前边介绍 Lac.operon 中的调节基因性质全然不同。 araC 的蛋白同时显示正、负调节因子的功能。 3、普通酶和变构酶反应动力学性质的不同。（6 分） 1 2 3
4-细胞质中进行的翻译 5-细胞内溶质的跨膜传送 2、阿拉伯糖对 E.coli 利用阿拉伯糖的酶系合成的诱导机制（10 分） 图 2-12 阿拉伯糖对 ara 操纵子 araC 位点的调控作用 当大肠杆菌细胞以阿拉伯糖作为生长所需碳源和能源时，它们产生三种将阿拉伯糖转化 为木酮糖的酶。 L-Ara L-Ru L-Ru-5-○P D-Xu-5-○P 1——L-阿拉伯糖异构酶 2——核酮糖酸酶 3——5-○P 核酮糖差向异构酶 它们分别是三个基因（B.A.D）编码的产物。这三个基因在 E.coli 中是属于阿拉伯糖操 纵子中的一个基因簇，称为 araB.A.D，另外两个基因 araE 和 araF 位于基因簇 araB.A.D 远离 的地方，负责阿拉伯糖的跨膜运输的，araE 编码一种膜蛋白，araF 编码一种位于细胞壁与 细胞膜之间的阿拉伯糖结合蛋白。 与 araB.A.D 相邻的是一个复合的启动子区和一个调节基因 araC，这个调节基因的性质 和我们前边介绍 Lac.operon 中的调节基因性质全然不同。 araC 的蛋白同时显示正、负调节因子的功能。 3、普通酶和变构酶反应动力学性质的不同。（6 分） 1 2 3
图 2-32 变构酶的典型动力学曲线 ATCase 的反应动力学曲线如下： ○1 Asp 和 CTP 对 ATCase 酶的激活和抑制作用从 S 形曲线上可知，都有一个阈值，即 Asp 浓度超过某个阈值时才显示抑制作用。 ○2 随 Asp 浓度的增加，ATC 酶与底物的亲和力协同性增大。 ○3 半饱和（饱和速度的一半）所需底物浓度因 CTP 的存在而增加。 ○4 CTP 能抑制 ATC 酶活性，但不能全部抑制，增加 Asp 浓度可以恢复酶的全部活力， 这说明 CTP 与底物是分别与酶结合，而不是竞争同一个活性中心。 ○5 底物浓度饱和而达到最大反应速度 Vmax 时，不受抑制剂的影响，即当显著提高底物 浓度时，看不到抑制作用。 5、 简述细菌二元调节系统（信号传导）如何调控基因表达？（8 分） ○1 位于细胞质膜上的传感蛋白（sensor protein）该蛋白质具有激酶活性，又称传感 激酶
图 2-32 变构酶的典型动力学曲线 ATCase 的反应动力学曲线如下： ○1 Asp 和 CTP 对 ATCase 酶的激活和抑制作用从 S 形曲线上可知，都有一个阈值，即 Asp 浓度超过某个阈值时才显示抑制作用。 ○2 随 Asp 浓度的增加，ATC 酶与底物的亲和力协同性增大。 ○3 半饱和（饱和速度的一半）所需底物浓度因 CTP 的存在而增加。 ○4 CTP 能抑制 ATC 酶活性，但不能全部抑制，增加 Asp 浓度可以恢复酶的全部活力， 这说明 CTP 与底物是分别与酶结合，而不是竞争同一个活性中心。 ○5 底物浓度饱和而达到最大反应速度 Vmax 时，不受抑制剂的影响，即当显著提高底物 浓度时，看不到抑制作用。 5、 简述细菌二元调节系统（信号传导）如何调控基因表达？（8 分） ○1 位于细胞质膜上的传感蛋白（sensor protein）该蛋白质具有激酶活性，又称传感 激酶
○2 应答调节蛋白（response regulator protein）位于细胞质中。传感激酶在与膜外环 境的信号反应过程中本身磷酸化，磷酰基因被转移到应答调节蛋白上。磷酸化的应答调 节蛋白即成为阻遏蛋白，该阻遏蛋白再通过操纵子的阻遏作用进行调节控制结构基因的 转录。 四、 请论述和回答（40 分） 1、 如果你分离到一株啤酒酵母，其生长速率是已知生产菌株的二倍，因此你将其用于生产 酒精的试验，但结果表明，该酵母菌株发酵葡萄糖的产物是酒精和其他产物的混合物， 并且酒精的产量只有现有生产菌株的 50%。请你根据本课程所学过的知识、并结合微生 物学、微生物遗传学等有关知识，简要写出你将打算如何改进你新分离酵母菌株，使其 优于现有的生产菌株的方案？（10 分） 答：呼吸抑制发酵 在低糖 0.2%酵母比生长速率 0.1/h 时，还是进行呼吸和生长的，而使其生长速率大大 提高，因此可以筛选呼吸缺陷型突变株。 分离获得的啤酒酵母 活化 接一环，30℃培养 24h，5mL 酵母完全培养 基 YEPD 30℃，16h，5mL 酵母完全培养基 YEPD，对数生长期 1mL 适当稀释 100 个菌落/平板 0.1mLYEPD 溴化乙吖啶黄 20～30μg/mL 处理，致死率达 99%，突 变频率为 10-3 左右 YEPD 平板上挑选小酵母菌落 含有三苯基四氮唑盐（TTC） 和 YEPD 平板上 挑选白色小菌落（正常的和呼吸强的酵母菌，因有细胞色素酶可还 原 TTC 使菌落变红，而呼吸缺陷型突变株，不能还原 TTC 使菌落不变色为白色） 含甘油培养基平板上（不长），YEPD 平板（长出菌落） 再进行酒精发酵 挑 选高产菌株 2、 论述代谢控制发酵的基本思想（路）。（10 分） 答：(1)黑曲霉生物合成柠檬酸机制
○2 应答调节蛋白（response regulator protein）位于细胞质中。传感激酶在与膜外环 境的信号反应过程中本身磷酸化，磷酰基因被转移到应答调节蛋白上。磷酸化的应答调 节蛋白即成为阻遏蛋白，该阻遏蛋白再通过操纵子的阻遏作用进行调节控制结构基因的 转录。 四、 请论述和回答（40 分） 1、 如果你分离到一株啤酒酵母，其生长速率是已知生产菌株的二倍，因此你将其用于生产 酒精的试验，但结果表明，该酵母菌株发酵葡萄糖的产物是酒精和其他产物的混合物， 并且酒精的产量只有现有生产菌株的 50%。请你根据本课程所学过的知识、并结合微生 物学、微生物遗传学等有关知识，简要写出你将打算如何改进你新分离酵母菌株，使其 优于现有的生产菌株的方案？（10 分） 答：呼吸抑制发酵 在低糖 0.2%酵母比生长速率 0.1/h 时，还是进行呼吸和生长的，而使其生长速率大大 提高，因此可以筛选呼吸缺陷型突变株。 分离获得的啤酒酵母 活化 接一环，30℃培养 24h，5mL 酵母完全培养 基 YEPD 30℃，16h，5mL 酵母完全培养基 YEPD，对数生长期 1mL 适当稀释 100 个菌落/平板 0.1mLYEPD 溴化乙吖啶黄 20～30μg/mL 处理，致死率达 99%，突 变频率为 10-3 左右 YEPD 平板上挑选小酵母菌落 含有三苯基四氮唑盐（TTC） 和 YEPD 平板上 挑选白色小菌落（正常的和呼吸强的酵母菌，因有细胞色素酶可还 原 TTC 使菌落变红，而呼吸缺陷型突变株，不能还原 TTC 使菌落不变色为白色） 含甘油培养基平板上（不长），YEPD 平板（长出菌落） 再进行酒精发酵 挑 选高产菌株 2、 论述代谢控制发酵的基本思想（路）。（10 分） 答：(1)黑曲霉生物合成柠檬酸机制
图 3-11 黑曲霉自蔗糖生物合成柠檬酸代谢调节图 （2）代谢控制育种 ○1 耐高糖、耐高浓度葡萄糖、a-脱氧葡萄糖 R。 ○2 耐高柠檬酸且不利用柠檬酸。 ○3 抗 Mn、Zn、Fe 等金属离子的突变株。 ○4 抗 SHAMr 突变株，增加倒呼吸链解除高浓度的 ATP 的 PFK 反馈抑制。 ○5 在葡萄糖为唯一碳源上孢子长得少的 HMP 代谢流减弱。 ○6 挑选形成菌球体系多而小的突变株。 ○7 耐高温突变株。 （3）发酵条件 ○1 温度 35—370 C ○2 严格控制培养基中的 Mn、Zn、Fe，我国的菌株是金属离子抗性突变株，无需控制。 ○3 控制低 P。 ○4 氮源、蛋白质量控制在 0.45%,适量补充(NH4)2SO4 ○5 控制前期长菌 pH4.0 左右,后期产酸 pH2.0 以下。 ○6 溶解氧要高（溶氧分压 90%满足率）
图 3-11 黑曲霉自蔗糖生物合成柠檬酸代谢调节图 （2）代谢控制育种 ○1 耐高糖、耐高浓度葡萄糖、a-脱氧葡萄糖 R。 ○2 耐高柠檬酸且不利用柠檬酸。 ○3 抗 Mn、Zn、Fe 等金属离子的突变株。 ○4 抗 SHAMr 突变株，增加倒呼吸链解除高浓度的 ATP 的 PFK 反馈抑制。 ○5 在葡萄糖为唯一碳源上孢子长得少的 HMP 代谢流减弱。 ○6 挑选形成菌球体系多而小的突变株。 ○7 耐高温突变株。 （3）发酵条件 ○1 温度 35—370 C ○2 严格控制培养基中的 Mn、Zn、Fe，我国的菌株是金属离子抗性突变株，无需控制。 ○3 控制低 P。 ○4 氮源、蛋白质量控制在 0.45%,适量补充(NH4)2SO4 ○5 控制前期长菌 pH4.0 左右,后期产酸 pH2.0 以下。 ○6 溶解氧要高（溶氧分压 90%满足率）
3、 试设计筛选高产 L-赖氨酸的科研方案（包括出发菌株的选择、生物合成途径的调节机制、 遗传标记的筛选、发酵条件的控制等）。（20 分） 答：1.切断或减弱支路代谢 （1） 切断支路代谢，Hom-或 Met- +Thr-。（北微所 AS1.299-HomAs1563,1568,2.5%; 上微 所黄色短杆菌 2305- HomH-2,3%;日本黄色短杆菌 No2247- HomH1013,4.2%） （2） 变换优先合成 降低 HD 酶活性○1 增强代谢流转向合成 Lys○2 Hom 减少，Thr 合成减少，解降 Thr+Lys 的 协同反馈抑制。 例：日本.黄色短杆菌 No2247 获得一批 Thrs ,Mets 突变株，其中一株所产 25g/L （2.5%），此突变株 HD 仅为野生菌株的 1/30。这样低的 HD 酶比活性下，不添加 Thr 和 Met 也能生长，但若单独过量添加一种 Thr 和 Met，反而由于过剩的 Thr 或 Met 能以致或阻遏本 来活力已经很低的 HD，使 Thr 和 Met 合成不足而抑制生长，即呈现 Thrs 或 Mets 2.解除反馈调节 选育抗结构类似物突变株 Lys 的结构类似物： S-2 氨基乙基-L-半胱氨酸（简称 AEC），α-氯己内酰胺（CCL）, α-氟己内酰胺（FCL）, 苯酯基 Lys（CBL）,甲基赖氨酸（ML），α-氨基月桂基内酰胺（ALL）,青霉素，杆菌素等。 Thr 的结构类似物： α-氨基-β-羟基戊酸（AHr）,邻甲基苏氨酸（OMT）等 Leu 结构类似物： α-噻唑丙氨酸（α-TA）等 (1)解除 AK 酶的反馈调节 ThrHxr 、Allr 、AECr、LysHxr 、AHVr 、MLr 、CCLr、CBLr 等。 (2)解除 PS 酶的代谢调节解除代谢互锁 ○1 Leu-Naa - Leul ○2 S-Leur 2-Tar LeuHxr ○3 苯醌 s、喹啉 s 是 Leu 合成酶（或某酶）抑制剂 3.增加前体 Asp 反馈抑制（调节）并不意味着完全阻止合成反应，通过受控制反应物的底物积累能拮抗 性地克服这种抑制，关键酶 AK 所催化的底物 Asp，AK 酶的反应速度与底物 Asp 浓度间的关 系曲线呈 S 型，随着 Asp 的增多，AK 酶和 Asp 亲和力协同性的增大，根据变构酶 S 型动力 学性质，存在底物对反应速度发生影响的阈值，Asp 既是反应底物，又是反应的激活剂，必 须控制在阈值以上。当浓度饱和而达到最大反应速度时，就不在受反馈抑制，因此为了高产 Lys 应设法增加前体物 Asp 浓度以抵消抑制物的影响。 （1）选育丙氨酸（Ala-）缺陷 （2）选育 Asp 结构类似物抗性，AspHxr （3）设法增强 PC 酶活性 ○1 采用 200-500μg 生物素/mL 激活 PC 酶 ○2 选择在琥珀酸为唯一碳源生长快速的突变株。FPs ○3 选择丙酮酸激酶缺陷 FPs ○4 柠檬酸合成酶活性降低 ○5 用乙酰 CoA 激活 PC 酶（因为乙酰 CoA 与 Asp 之间存在平衡合成） ○6 采用低糖（4-5%）添加方法可激活 PC 酶 （4）设法增加（强化）Glu 的反馈控制，使 Glu 优先合成 NTG
3、 试设计筛选高产 L-赖氨酸的科研方案（包括出发菌株的选择、生物合成途径的调节机制、 遗传标记的筛选、发酵条件的控制等）。（20 分） 答：1.切断或减弱支路代谢 （1） 切断支路代谢，Hom-或 Met- +Thr-。（北微所 AS1.299-HomAs1563,1568,2.5%; 上微 所黄色短杆菌 2305- HomH-2,3%;日本黄色短杆菌 No2247- HomH1013,4.2%） （2） 变换优先合成 降低 HD 酶活性○1 增强代谢流转向合成 Lys○2 Hom 减少，Thr 合成减少，解降 Thr+Lys 的 协同反馈抑制。 例：日本.黄色短杆菌 No2247 获得一批 Thrs ,Mets 突变株，其中一株所产 25g/L （2.5%），此突变株 HD 仅为野生菌株的 1/30。这样低的 HD 酶比活性下，不添加 Thr 和 Met 也能生长，但若单独过量添加一种 Thr 和 Met，反而由于过剩的 Thr 或 Met 能以致或阻遏本 来活力已经很低的 HD，使 Thr 和 Met 合成不足而抑制生长，即呈现 Thrs 或 Mets 2.解除反馈调节 选育抗结构类似物突变株 Lys 的结构类似物： S-2 氨基乙基-L-半胱氨酸（简称 AEC），α-氯己内酰胺（CCL）, α-氟己内酰胺（FCL）, 苯酯基 Lys（CBL）,甲基赖氨酸（ML），α-氨基月桂基内酰胺（ALL）,青霉素，杆菌素等。 Thr 的结构类似物： α-氨基-β-羟基戊酸（AHr）,邻甲基苏氨酸（OMT）等 Leu 结构类似物： α-噻唑丙氨酸（α-TA）等 (1)解除 AK 酶的反馈调节 ThrHxr 、Allr 、AECr、LysHxr 、AHVr 、MLr 、CCLr、CBLr 等。 (2)解除 PS 酶的代谢调节解除代谢互锁 ○1 Leu-Naa - Leul ○2 S-Leur 2-Tar LeuHxr ○3 苯醌 s、喹啉 s 是 Leu 合成酶（或某酶）抑制剂 3.增加前体 Asp 反馈抑制（调节）并不意味着完全阻止合成反应，通过受控制反应物的底物积累能拮抗 性地克服这种抑制，关键酶 AK 所催化的底物 Asp，AK 酶的反应速度与底物 Asp 浓度间的关 系曲线呈 S 型，随着 Asp 的增多，AK 酶和 Asp 亲和力协同性的增大，根据变构酶 S 型动力 学性质，存在底物对反应速度发生影响的阈值，Asp 既是反应底物，又是反应的激活剂，必 须控制在阈值以上。当浓度饱和而达到最大反应速度时，就不在受反馈抑制，因此为了高产 Lys 应设法增加前体物 Asp 浓度以抵消抑制物的影响。 （1）选育丙氨酸（Ala-）缺陷 （2）选育 Asp 结构类似物抗性，AspHxr （3）设法增强 PC 酶活性 ○1 采用 200-500μg 生物素/mL 激活 PC 酶 ○2 选择在琥珀酸为唯一碳源生长快速的突变株。FPs ○3 选择丙酮酸激酶缺陷 FPs ○4 柠檬酸合成酶活性降低 ○5 用乙酰 CoA 激活 PC 酶（因为乙酰 CoA 与 Asp 之间存在平衡合成） ○6 采用低糖（4-5%）添加方法可激活 PC 酶 （4）设法增加（强化）Glu 的反馈控制，使 Glu 优先合成 NTG
4.选育温度敏感突变株 选育温度敏感突变株也应是 Lys 发酵代谢控制育种的有效途径。其突变位置发生在亮氨 酸合成酶系，高丝氨酸脱氢酶或丙酮酸-L-氨基酸转氨酶编码的基因中，均有利于积累 Lys。 缺陷型。日本户扳修等人，以乳糖发酵短杆菌 AJll082(AECR +CCLR +A1a- )为出发菌株，30℃下 250μg /mLMNNG 诱变处理 30 分钟，分离选育 30℃下生长良好，而在 34℃不能生长的温度 敏感突变株——乳糖发酵短杆菌 AJll093(AECR +CCLR +A1a- +tems )。同法从已获得谷氨酸棒杆 菌 AJ109043 株(AECR +A1a- )诱变选育 AJl099(AECR +A1a- +tems )，这两株菌都是 34℃以上高温 培养时表现为Leu-，添加2.5mg /mLLeu可恢复正常生长，使用此两株温度敏感突变株29-30℃ 培养，发酵 24-48 小时期间将温度提高到 34℃以上，抑制菌体多余生长，并解除了 Leu 对 PS 酶的反馈阻遏，解除代谢互锁，结果两株菌分别积累赖氨酸 45g/L 和 39g/L，对糖转化率 分别为 45％和 39％。 5.Lys 生产菌株的定向选育标记 以谷氨酸棒杆菌、黄色短杆菌、北京棒杆菌、钝齿棒杆菌等 Glu 生产菌株为出发菌， 通过诱变定向选育获得遗传标记应为： Hom- + A1a- +AECR +CCLR + CBLR +AspHxR +Leu- +TAR +Thr- +Met- +tems 例如：乳糖发酵短杆菌 AJ11274Lys 菌株选育过程如下 乳糖发酵短杆菌 AJ1511 野生型 产 Lys 0 AJ3445 AECR 产 Lys 11.6g/L AJ3424 AECR + A1a- 产 Lys 33g/L AJ3796 AECR + A1a- +CCLR 产 Lys 39g/L AJ3991 AECR + A1a- +CCLR +MLR 产 Lys 43g/L AJ11274 AECR + A1a- +CCLR +MLR +FPs 产 Lys 48g/L （四）细胞融合选育高产 Lys 菌株 Lys 产生 菌 AJ11082 （低葡萄糖消耗速率） AECr、CLLr、MLr、FPs、 L-AlaLogphase cell B Glu 产生菌 AJ11638 DECr（德夸香素） KMr（酮丙二酸 r） Logphase cell A 蛋白胨 1%、酵母 1% NaCl0.5%、蔗糖 0.5% PH7.0、31.5℃ 0.3μg/mL Penicilian （31℃，90 分钟） Centrifugation 收集菌体，高渗 洗涤后，悬浮于高渗溶液中 300μg/mL Lysozyme （31.5℃静止 21h）
4.选育温度敏感突变株 选育温度敏感突变株也应是 Lys 发酵代谢控制育种的有效途径。其突变位置发生在亮氨 酸合成酶系，高丝氨酸脱氢酶或丙酮酸-L-氨基酸转氨酶编码的基因中，均有利于积累 Lys。 缺陷型。日本户扳修等人，以乳糖发酵短杆菌 AJll082(AECR +CCLR +A1a- )为出发菌株，30℃下 250μg /mLMNNG 诱变处理 30 分钟，分离选育 30℃下生长良好，而在 34℃不能生长的温度 敏感突变株——乳糖发酵短杆菌 AJll093(AECR +CCLR +A1a- +tems )。同法从已获得谷氨酸棒杆 菌 AJ109043 株(AECR +A1a- )诱变选育 AJl099(AECR +A1a- +tems )，这两株菌都是 34℃以上高温 培养时表现为Leu-，添加2.5mg /mLLeu可恢复正常生长，使用此两株温度敏感突变株29-30℃ 培养，发酵 24-48 小时期间将温度提高到 34℃以上，抑制菌体多余生长，并解除了 Leu 对 PS 酶的反馈阻遏，解除代谢互锁，结果两株菌分别积累赖氨酸 45g/L 和 39g/L，对糖转化率 分别为 45％和 39％。 5.Lys 生产菌株的定向选育标记 以谷氨酸棒杆菌、黄色短杆菌、北京棒杆菌、钝齿棒杆菌等 Glu 生产菌株为出发菌， 通过诱变定向选育获得遗传标记应为： Hom- + A1a- +AECR +CCLR + CBLR +AspHxR +Leu- +TAR +Thr- +Met- +tems 例如：乳糖发酵短杆菌 AJ11274Lys 菌株选育过程如下 乳糖发酵短杆菌 AJ1511 野生型 产 Lys 0 AJ3445 AECR 产 Lys 11.6g/L AJ3424 AECR + A1a- 产 Lys 33g/L AJ3796 AECR + A1a- +CCLR 产 Lys 39g/L AJ3991 AECR + A1a- +CCLR +MLR 产 Lys 43g/L AJ11274 AECR + A1a- +CCLR +MLR +FPs 产 Lys 48g/L （四）细胞融合选育高产 Lys 菌株 Lys 产生 菌 AJ11082 （低葡萄糖消耗速率） AECr、CLLr、MLr、FPs、 L-AlaLogphase cell B Glu 产生菌 AJ11638 DECr（德夸香素） KMr（酮丙二酸 r） Logphase cell A 蛋白胨 1%、酵母 1% NaCl0.5%、蔗糖 0.5% PH7.0、31.5℃ 0.3μg/mL Penicilian （31℃，90 分钟） Centrifugation 收集菌体，高渗 洗涤后，悬浮于高渗溶液中 300μg/mL Lysozyme （31.5℃静止 21h）
（五）重组 DNA 技术选育高产 Lys 菌株 Renerend 将 E.coli 的 Lys 生物合成途径中 Asp-β-半醛（ASA）脱氢酶，二氢吡啶 2、 6 二羧酸（DDP 或 Ps）合成酶，PPP 还原酶和二氨基庚二酸（DAP）脱羧酶的基因。 Asd,dapA,dapB,LysA 从染色体上切下，分别连接到拷贝数高的质粒 PBR322 上，配制成杂种 质粒 PADI PDA1 PDB2 PLA17 等，并在亲代株 TocR21（此菌为 Asp 激酶即 AK 酶）的反馈抑 制被解除，而且 Lys 分解能力缺损的突变株进行克隆研究对 Lys 产量的影响结果。 ASA 脱氢酶比活力增加 7-16 倍，DDP 还原酶比活力增加 22 倍，DDP 合成酶比活力增加 31 倍，DAP 脱羧酶比活力增加 4.4 倍。但可惜只携带 PDAI 的菌体才能使 Lys 产量大大增加， 可提高 Lys 产量 5 倍。而其它杂种质粒的菌株，尽管酶比活力增加，但 Lys 产量均无变化。 这也证明由 DPP 合成酶催化从 ASA 到 DDP 是 TocR21 菌的 Lys 生物合成的限速反应步骤，也 证明通过 DNA 重组技术基因扩增的方法能够改良 Lys 菌株的性能并提高产率。 Protoplant A Protoplant B 等量混合 centrifugation Resuspensionin hypertonic solution （pH10.5,0.1M CaCl2） 33%PEG6000+0.1M CaCl 处理 36℃，15min 进行融合，融合反应 液离心后，收集融合原生质体悬浮 于 10.5 高渗溶液中 Plating in hypertonic soft agar lager on the selectine solid agar media 移植到（涂布）选择固体琼脂培养 基上的高渗软琼脂层中 Inculation at 31.5℃ for 14 days Fusant 融合子 产酸和遗传标记稳定性测定 液体摇瓶 10-15 次 AJ11794 （生长快，耗糖速率高 3 倍，发酵时间 缩短 1/3，L-Lys 产量维持不变）
（五）重组 DNA 技术选育高产 Lys 菌株 Renerend 将 E.coli 的 Lys 生物合成途径中 Asp-β-半醛（ASA）脱氢酶，二氢吡啶 2、 6 二羧酸（DDP 或 Ps）合成酶，PPP 还原酶和二氨基庚二酸（DAP）脱羧酶的基因。 Asd,dapA,dapB,LysA 从染色体上切下，分别连接到拷贝数高的质粒 PBR322 上，配制成杂种 质粒 PADI PDA1 PDB2 PLA17 等，并在亲代株 TocR21（此菌为 Asp 激酶即 AK 酶）的反馈抑 制被解除，而且 Lys 分解能力缺损的突变株进行克隆研究对 Lys 产量的影响结果。 ASA 脱氢酶比活力增加 7-16 倍，DDP 还原酶比活力增加 22 倍，DDP 合成酶比活力增加 31 倍，DAP 脱羧酶比活力增加 4.4 倍。但可惜只携带 PDAI 的菌体才能使 Lys 产量大大增加， 可提高 Lys 产量 5 倍。而其它杂种质粒的菌株，尽管酶比活力增加，但 Lys 产量均无变化。 这也证明由 DPP 合成酶催化从 ASA 到 DDP 是 TocR21 菌的 Lys 生物合成的限速反应步骤，也 证明通过 DNA 重组技术基因扩增的方法能够改良 Lys 菌株的性能并提高产率。 Protoplant A Protoplant B 等量混合 centrifugation Resuspensionin hypertonic solution （pH10.5,0.1M CaCl2） 33%PEG6000+0.1M CaCl 处理 36℃，15min 进行融合，融合反应 液离心后，收集融合原生质体悬浮 于 10.5 高渗溶液中 Plating in hypertonic soft agar lager on the selectine solid agar media 移植到（涂布）选择固体琼脂培养 基上的高渗软琼脂层中 Inculation at 31.5℃ for 14 days Fusant 融合子 产酸和遗传标记稳定性测定 液体摇瓶 10-15 次 AJ11794 （生长快，耗糖速率高 3 倍，发酵时间 缩短 1/3，L-Lys 产量维持不变）