亲和层析法 ●1 原理： 要有一对具有高亲和性的分子 ●2 亲和吸附剂： 有很多亲和性吸附剂可利用 ●3 金属螯合层析法： 利用分子与金属的吸引力
亲和层析法 ●1 原理： 要有一对具有高亲和性的分子 ●2 亲和吸附剂： 有很多亲和性吸附剂可利用 ●3 金属螯合层析法： 利用分子与金属的吸引力
亲和色谱 原理：酶与载体之间的特异性作用。 亲和洗提 酶与其它化合物一起吸附到一种离子交换剂上，然后用 适当的底物特异地洗提
亲和色谱 原理：酶与载体之间的特异性作用。 亲和洗提 酶与其它化合物一起吸附到一种离子交换剂上，然后用 适当的底物特异地洗提
■ 亲和层析法的四项要素： (2) Specific Binding Substance (B) 洗脱 Elution (4) 配 体 Ligand (A) 耦合反应 (3) Coupling Reaction 杂质 B B B B (1) Solid Matrix B
■ 亲和层析法的四项要素： (2) Specific Binding Substance (B) 洗脱 Elution (4) 配 体 Ligand (A) 耦合反应 (3) Coupling Reaction 杂质 B B B B (1) Solid Matrix B
■ 亲和层析法的作用机理： 固相载体 (1) (2) (3) A B Sample Washing Elution X B 亲和基团 配体 X B A A
■ 亲和层析法的作用机理： 固相载体 (1) (2) (3) A B Sample Washing Elution X B 亲和基团 配体 X B A A
■ 典型的亲和层析操作： Activity Elution volume Protein pH 2.05 *
■ 典型的亲和层析操作： Activity Elution volume Protein pH 2.05 *
II. Interaction Forces: (1) Hydrogen bond (2) Hydrophobic interaction (3) Electrostatic interaction (4) Van der waals interaction ■ 专一性作用力的种类： I. Conformational Match: Van der waals interaction + Kd 两分子间因构象互补所造成的 吸引力是由范德华力所贡献 + - =O.H-N-
II. Interaction Forces: (1) Hydrogen bond (2) Hydrophobic interaction (3) Electrostatic interaction (4) Van der waals interaction ■ 专一性作用力的种类： I. Conformational Match: Van der waals interaction + Kd 两分子间因构象互补所造成的 吸引力是由范德华力所贡献 + - =O.H-N-
B A ■构型互补所产生的吸引力： Van der Waal interactions between non -polar surfaces 范 vdw vdw 德华键数目够多就足以产生亲和力
B A ■构型互补所产生的吸引力： Van der Waal interactions between non -polar surfaces 范 vdw vdw 德华键数目够多就足以产生亲和力
■ 生化分子的反应基团： 胺 基 -NH2 羧 基 -COOH 醛 基 -HC=O 醚 -O- 氰 基 -C N 醇 基 -OH 硫醇基 -SH 烷 基 -CH3 ●●●●● ●●● X ●● ● ●
■ 生化分子的反应基团： 胺 基 -NH2 羧 基 -COOH 醛 基 -HC=O 醚 -O- 氰 基 -C N 醇 基 -OH 硫醇基 -SH 烷 基 -CH3 ●●●●● ●●● X ●● ● ●
■ 可与各种配体基团反应的载体： 配体基团 親 和 性 载体 反应基团 反应方式 直接反应 加 EDC* 直接反应 直接反应 加 EDC* 直接反应 直接反应 DTT 活化 直接反应 -C≡N -COOH N-OH-succinimide Oxirane环氧己烷 -NH2 oxirane oxirane -S-S-R -G-S-S-R CH-Sepharose 4B 或活化型 CNBr-activated Sepharose 4B Epoxy-activated Sepharose 4B AH Sepharose 4B Epoxy-activated Sepharose 4B Epoxy-activated Sepharose 4B Thiopropyl-Sepharose 4B Activated thio-Sepharose 4B -NH2 -COOH -OH -SH * EDC = N-ethyl-N'-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide HCl Pharmacia
■ 可与各种配体基团反应的载体： 配体基团 親 和 性 载体 反应基团 反应方式 直接反应 加 EDC* 直接反应 直接反应 加 EDC* 直接反应 直接反应 DTT 活化 直接反应 -C≡N -COOH N-OH-succinimide Oxirane环氧己烷 -NH2 oxirane oxirane -S-S-R -G-S-S-R CH-Sepharose 4B 或活化型 CNBr-activated Sepharose 4B Epoxy-activated Sepharose 4B AH Sepharose 4B Epoxy-activated Sepharose 4B Epoxy-activated Sepharose 4B Thiopropyl-Sepharose 4B Activated thio-Sepharose 4B -NH2 -COOH -OH -SH * EDC = N-ethyl-N'-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide HCl Pharmacia
■ 亲和性载体的反应基团： spacer arm -O-C-C-C-O-C-C-C-C-O-C-C-C OH O -OH -O- C N NH2 -Protein -NH -C-C-C-C-C-C-NH2 -NH -C-C-C-C-C-C-COOH -O- C-NH -Protein NH Epoxy N-Succinimide 琥珀酰亚胺 Carboxylic Amino CNBr activated -NH -C-C-C-C-C-C-C -O-N O O O -O- C N CNBr
■ 亲和性载体的反应基团： spacer arm -O-C-C-C-O-C-C-C-C-O-C-C-C OH O -OH -O- C N NH2 -Protein -NH -C-C-C-C-C-C-NH2 -NH -C-C-C-C-C-C-COOH -O- C-NH -Protein NH Epoxy N-Succinimide 琥珀酰亚胺 Carboxylic Amino CNBr activated -NH -C-C-C-C-C-C-C -O-N O O O -O- C N CNBr