一株产氨浸铜细菌的分离与鉴定

第36卷第11期 北京科技大学学报 Vol.36 No.11 2014年11月 Journal of University of Science and Technology Beijing Now.2014 一株产氨浸铜细菌的分离与鉴定 王洪江四，吴爱祥，熊有为，胡凯建，黄明清 北京科技大学金属矿山高效开采与安全教育部重点实验室，北京100083 ☒通信作者，E-mail:wang1988@126.com 摘要从内蒙古某处土壤中分离出一株分解尿素的产氨细菌（命名为JAT一），革兰氏阴性，菌落表面平整湿润，乳白色，短 杆状.菌体尺寸为0.2-0.4um×1.5-2.0μm.结合16 S rDNA测定和菌株系统发育树分析，其与Providencia Sp.Sam130- 9A同源性高达99%.对其生长特性研究结果表明：JAT-1以10g·L1柠檬酸钠作为碳源，20g·L尿素作为氮源，最佳生长 pH值范围为8.0~9.5，最佳初始接种浓度20%.采用该细菌进行碱性铜矿摇瓶浸出实验，144h后铜浸出率可达42.38%，表 明该菌株具有应用于碱性铜矿浸出的潜力. 关键词铜矿；生物浸矿：细菌：氨：分离：鉴定 分类号TD925.5:TF18 Isolation and identification of an ammonia-producing copper leaching strain WANG Hongjiang,WU Ai-xiang,XIONG You-ei,HU Kai-jian,HUANG Ming-ging State Key Laboratory of the Ministry of Education of China for High-Efficient Mining and Safety of Metal Mines,University of Science and Technology Beijing,Beijing 100083,China Corresponding author,E-mail:wanghj1988@126.com ABSTRACT An ammonia-producing strain isolated from Inner Mongolia in north China,which is capable of decomposing urea,was designated as strain JAT-1.Identification results show that this milky strain has a smooth and humid surface,and it is Gram-negative and rod-shaped in d0.2-0.4 um x 1.5-2.0 um.Based on the 16S rDNA sequencing and the phylogenetic tree,this strain was iden- tified as Providencia Sp.By means of the analysis of growth characteristics,the optimal growth condition was achieved when the con- centration of sodium citrate as a carbon source was 10gL,the concentration of urea as a nitrogen source was 20gL,the pH value was between 8.0 and 9.5,and the inoculum concentration was 20%.Alkaline copper ore bioleaching experiment in a shake flask with the ammonia-producing strain yielded a copper leaching efficiency of 42.38%in 144h.This result indicates that this strain has the po- tential for leaching the alkaline copper ore. KEY WORDS copper ores;bioleaching:bacteria:ammonia:isolation;identification 对于高含碱性脉石矿物的难选铜矿，目前主 资大因 要采用的处理方法有浮选、酸浸和氨浸·-习.然而 细菌浸矿技术具有成本低、投资少、污染小、工 浮选工艺复杂，药剂对环境污染严重.酸浸耗酸量 艺设备简单、工作条件温和等优点可.目前，对于产 大，化学反应生成难溶物堵塞浸出通道.采用加 氨细菌的研究和应用主要见于污水中有机氮的氨化 压氨浸在技术上可行，但经济效益较差)：采用常 处理，农业上促进植物对尿素的吸收，以及医学上产 压搅拌氨浸则由于工业氨水的强烈挥发性，导致 脲酶细菌对动物生理的影响等-0.此外，国内的 处理成本增加，环境污染严重，且能耗高，设备投 黄国胜等曾报道过从海水中分离得到产氨细菌 收稿日期：201308-28 基金项目：国家自然科学基金重点资助项目(50934002)：高等学校博士学科点专项科研基金资助项目(20110006130003)：长江学者和创新团 队发展计划资助项目(RT0950) DOI:10.13374/j.issn1001-053x.2014.11.003:http://journals.ustb.edu.cn

第 36 卷 第 11 期 2014 年 11 月 北京科技大学学报 Journal of University of Science and Technology Beijing Vol． 36 No． 11 Nov． 2014 一株产氨浸铜细菌的分离与鉴定 王洪江，吴爱祥，熊有为，胡凯建，黄明清 北京科技大学金属矿山高效开采与安全教育部重点实验室，北京 100083  通信作者，E-mail: wanghj1988@ 126． com 摘 要 从内蒙古某处土壤中分离出一株分解尿素的产氨细菌( 命名为 JAT--1) ，革兰氏阴性，菌落表面平整湿润，乳白色，短 杆状． 菌体尺寸为 0. 2 ～ 0. 4 μm × 1. 5 ～ 2. 0 μm． 结合 16S rDNA 测定和菌株系统发育树分析，其与 Providencia Sp． Sam 130-- 9A 同源性高达 99% ． 对其生长特性研究结果表明: JAT--1 以 10 g·L － 1柠檬酸钠作为碳源，20 g·L － 1尿素作为氮源，最佳生长 pH 值范围为 8. 0 ～ 9. 5，最佳初始接种浓度 20% ． 采用该细菌进行碱性铜矿摇瓶浸出实验，144 h 后铜浸出率可达 42. 38% ，表 明该菌株具有应用于碱性铜矿浸出的潜力． 关键词 铜矿; 生物浸矿; 细菌; 氨; 分离; 鉴定 分类号 TD 925. 5; TF 18 Isolation and identification of an ammonia-producing copper leaching strain WANG Hong-jiang ，WU Ai-xiang，XIONG You-wei，HU Kai-jian，HUANG Ming-qing State Key Laboratory of the Ministry of Education of China for High-Efficient Mining and Safety of Metal Mines，University of Science and Technology Beijing，Beijing 100083，China  Corresponding author，E-mail: wanghj1988@ 126． com ABSTＲACT An ammonia-producing strain isolated from Inner Mongolia in north China，which is capable of decomposing urea，was designated as strain JAT--1． Identification results show that this milky strain has a smooth and humid surface，and it is Gram-negative and rod-shaped in 0. 2 － 0. 4 μm × 1. 5 － 2. 0 μm． Based on the 16S rDNA sequencing and the phylogenetic tree，this strain was iden￾tified as Providencia Sp． By means of the analysis of growth characteristics，the optimal growth condition was achieved when the con￾centration of sodium citrate as a carbon source was 10 g·L － 1，the concentration of urea as a nitrogen source was 20 g·L － 1，the pH value was between 8. 0 and 9. 5，and the inoculum concentration was 20% ． Alkaline copper ore bioleaching experiment in a shake flask with the ammonia-producing strain yielded a copper leaching efficiency of 42. 38% in 144 h． This result indicates that this strain has the po￾tential for leaching the alkaline copper ore． KEY WOＲDS copper ores; bioleaching; bacteria; ammonia; isolation; identification 收稿日期: 2013--08--28 基金项目: 国家自然科学基金重点资助项目( 50934002) ; 高等学校博士学科点专项科研基金资助项目( 20110006130003) ; 长江学者和创新团 队发展计划资助项目( IＲT0950) DOI: 10． 13374 /j． issn1001--053x． 2014． 11． 003; http: / /journals． ustb． edu． cn 对于高含碱性脉石矿物的难选铜矿，目前主 要采用的处理方法有浮选、酸浸和氨浸［1 － 3］． 然而 浮选工艺复杂，药剂对环境污染严重． 酸浸耗酸量 大，化学反应生成难溶物堵塞浸出通道［4］． 采用加 压氨浸在技术上可行，但经济效益较差［5］; 采用常 压搅拌氨浸则由于工业氨水的强烈挥发性，导致 处理成本增加，环境污染严重，且能耗高，设备投 资大［6］． 细菌浸矿技术具有成本低、投资少、污染小、工 艺设备简单、工作条件温和等优点［7］． 目前，对于产 氨细菌的研究和应用主要见于污水中有机氮的氨化 处理，农业上促进植物对尿素的吸收，以及医学上产 脲酶细菌对动物生理的影响等［8 － 10］． 此外，国内的 黄国胜等［11］曾报道过从海水中分离得到产氨细菌

·1444 北京科技大学学报 第36卷 对B30铜镍合金的腐蚀行为；瑞士Groudeva等 肥沃土壤.浸矿实验的矿样为来自云南某矿的高碱 也进行过尿素分解细菌浸出碳酸盐型铜矿的实验. 性氧化铜矿.矿石中主要含铜矿物为孔雀石、硅孔 但是，对于产氨菌种Providencia sp.在浸矿方面的研 雀石以及黄铜矿等.对矿石化学成分进行分析，结 究尚未见报道. 果如表1；采用X射线衍射法进行铜物相分析，结果 本文先从土壤中分离出一株代谢尿素的产氨细 如表2. 菌并鉴定其种属，然后对其生长特性进行研究，最后 从以上分析结果可以看出，矿石中Mg0和CaO 在最优生长条件下，揭示细菌生长和产氨规律，并通 的质量分数为12.03%，其次还有Fe203、Al203等耗 过铜矿石摇瓶浸出实验考察细菌浸矿性能 酸矿物，经过实验可知使用本矿样生产1t铜约消耗 30gL-1的稀硫酸17t.铜氧化率较高，氧化铜占有 1 实验材料和方法 率达63.28%.此外，该铜矿石含泥量较高，为典型 1.1样品来源 的难处理高碱性氧化铜矿.浸矿时采用加工至 用于分离菌种的样品为来自内蒙古某处的湿润 -200目以下的矿样. 表1矿石的化学成分（质量分数） Table 1 Chemical composition of the copper ore Cu FeO Mgo Cao Si02 Al203 Zn As W03 1.013 11.28 1.35 10.68 47.78 7.62 0.198 0.46 0.135 0.16 表2铜物相分析结果 度检测在DX一120型离子色谱仪中进行：采用红色 Table 2 Phase analysis results of copper 湿润石蕊试纸悬于瓶口，检验溶液中生成的氨产物； 自由 结合 次生 原生 物相 总铜 根据氨与酸的中和反应特性，即NH3+HCl一→ 氧化铜氧化铜 硫化铜硫化铜 NH,Cl,采用中和滴定法检测溶液中氨的质量浓度. 质量分数/%0.352 0.289 0.076 0.296 1.013 1.5细菌生长条件研究 占有率/%34.7528.53 7.50 29.22 100 采用室内摇瓶实验方法，将培养基各成分灭菌 处理后混合均匀，接种对数期细菌置于25~35℃旋 1.2培养基（尿素培养基） 转气浴恒温振荡器中以120~150r·min1振荡培 采用5~20g·L-1柠檬酸钠或葡萄糖作为碳源， 养，定期取样检测培养液中细菌生长浓度和氨的质 5~20gL-1尿素作为氮源，KH2P0,1.4gL-、 量浓度.分别考察不同柠檬酸钠碳源的质量浓度、 Na,HP042.1gL-1、MgS047H200.2gL-l,无需 尿素的质量浓度、初始H值、细菌初始接种浓度等 生长因子，H值自然.固体培养基为在以上培养基 因素对产氨细菌生长和代谢产氨的影响. 中加入1.5%~2%的琼脂.培养基中尿素采用过滤 方法进行除菌，其他成分在121℃蒸汽灭菌锅中高 2实验结果及讨论 压灭菌20min 2.1菌种描述与鉴定 1.3菌种分离及鉴定 (1)菌种形态和菌落特征.对纯化后的细菌进 取适量土壤样品打碎于无菌蒸馏水中，取上层 行革兰氏染色，结果显示产氨细菌JAT-1为革兰氏 悬浊液以接种至液体培养基.在恒温摇床中以120 阴性，如图1(a).菌体为短杆状，如图1(b),尺寸为 ~l50r·min-振荡培养，得到增殖菌液.再将菌液 b0.2-0.4μm×1.5~2.0um. 稀释若干倍接种于琼脂平板，25~35℃条件下恒温 (2)菌种鉴定.对纯化后的菌种提取PCR产 培养36~60h,形成单菌落后进行多代培养，直至得 物，测定其碱基序列.将碱基序列提交至NCBI(美 到平板菌落特征和显微镜下菌体形态均一致的纯菌 国国立生物技术信息中心)与GenBank数据进行核 种.对纯化后的菌种提取PCR产物，进行16 S rDNA鉴 苷酸同源性比较分析.结果显示，数据库D为 定（具体工作委托中国科学院微生物研究所进行）. IclI53297的目标菌JAT-1属于Providencia属，其与 1.4样品指标检测 Providencia sp.Saml309A菌株亲缘关系最近，二 培养液中细菌浓度采用血球计数板在蔡司 者同源性高达99%.Thacker等曾报道过利用该 (ZEISS)显微镜下进行计数；采用620型实验室pH Providencia sp.(普罗威登斯菌属)处理含Cr(VI)工 计进行溶液pH值测定；浸出液中铜离子的质量浓 业废水，效果良好：而该菌属在对矿物的处理利用方

北 京 科 技 大 学 学 报 第 36 卷 对 B30 铜镍合金的腐蚀行为; 瑞士 Groudeva 等［12］ 也进行过尿素分解细菌浸出碳酸盐型铜矿的实验． 但是，对于产氨菌种 Providencia sp． 在浸矿方面的研 究尚未见报道． 本文先从土壤中分离出一株代谢尿素的产氨细 菌并鉴定其种属，然后对其生长特性进行研究，最后 在最优生长条件下，揭示细菌生长和产氨规律，并通 过铜矿石摇瓶浸出实验考察细菌浸矿性能． 1 实验材料和方法 1. 1 样品来源 用于分离菌种的样品为来自内蒙古某处的湿润 肥沃土壤． 浸矿实验的矿样为来自云南某矿的高碱 性氧化铜矿． 矿石中主要含铜矿物为孔雀石、硅孔 雀石以及黄铜矿等． 对矿石化学成分进行分析，结 果如表 1; 采用 X 射线衍射法进行铜物相分析，结果 如表 2． 从以上分析结果可以看出，矿石中 MgO 和 CaO 的质量分数为 12. 03% ，其次还有 Fe2O3、Al2O3等耗 酸矿物，经过实验可知使用本矿样生产 1 t 铜约消耗 30 g·L － 1的稀硫酸 17 t． 铜氧化率较高，氧化铜占有 率达 63. 28% ． 此外，该铜矿石含泥量较高，为典型 的难处理高碱性氧化铜矿． 浸矿时采用加工至 － 200目以下的矿样． 表 1 矿石的化学成分( 质量分数) Table 1 Chemical composition of the copper ore % Cu FeO MgO CaO SiO2 Al2O3 Zn S As WO3 1. 013 11. 28 1. 35 10. 68 47. 78 7. 62 0. 198 0. 46 0. 135 0. 16 表 2 铜物相分析结果 Table 2 Phase analysis results of copper 物相 自由 氧化铜 结合 氧化铜 次生 硫化铜 原生 硫化铜 总铜 质量分数/% 0. 352 0. 289 0. 076 0. 296 1. 013 占有率/% 34. 75 28. 53 7. 50 29. 22 100 1. 2 培养基( 尿素培养基) 采用 5 ～ 20 g·L － 1柠檬酸钠或葡萄糖作为碳源， 5 ～ 20 g·L － 1 尿素 作 为 氮 源，KH2 PO4 1. 4 g·L － 1、 Na2HPO4 2. 1 g·L － 1、MgSO4 ·7H2O 0. 2 g·L － 1，无需 生长因子，pH 值自然． 固体培养基为在以上培养基 中加入 1. 5% ～ 2% 的琼脂． 培养基中尿素采用过滤 方法进行除菌，其他成分在 121 ℃ 蒸汽灭菌锅中高 压灭菌 20 min． 1. 3 菌种分离及鉴定 取适量土壤样品打碎于无菌蒸馏水中，取上层 悬浊液以接种至液体培养基． 在恒温摇床中以 120 ～ 150 r·min － 1振荡培养，得到增殖菌液． 再将菌液 稀释若干倍接种于琼脂平板，25 ～ 35 ℃ 条件下恒温 培养 36 ～ 60 h，形成单菌落后进行多代培养，直至得 到平板菌落特征和显微镜下菌体形态均一致的纯菌 种． 对纯化后的菌种提取 PCＲ 产物，进行16S rDNA 鉴 定( 具体工作委托中国科学院微生物研究所进行) ． 1. 4 样品指标检测 培养液中细菌 浓 度 采 用 血 球 计 数 板 在 蔡 司 ( ZEISS) 显微镜下进行计数; 采用 620 型实验室 pH 计进行溶液 pH 值测定; 浸出液中铜离子的质量浓 度检测在 DX--120 型离子色谱仪中进行; 采用红色 湿润石蕊试纸悬于瓶口，检验溶液中生成的氨产物; 根据氨与酸的中和反应特性，即 NH3 + HCl → NH4Cl，采用中和滴定法检测溶液中氨的质量浓度． 1. 5 细菌生长条件研究 采用室内摇瓶实验方法，将培养基各成分灭菌 处理后混合均匀，接种对数期细菌置于 25 ～ 35 ℃ 旋 转气浴恒温振荡器中以 120 ～ 150 r·min － 1 振荡培 养，定期取样检测培养液中细菌生长浓度和氨的质 量浓度． 分别考察不同柠檬酸钠碳源的质量浓度、 尿素的质量浓度、初始 pH 值、细菌初始接种浓度等 因素对产氨细菌生长和代谢产氨的影响． 2 实验结果及讨论 2. 1 菌种描述与鉴定 ( 1) 菌种形态和菌落特征． 对纯化后的细菌进 行革兰氏染色，结果显示产氨细菌 JAT--1 为革兰氏 阴性，如图1( a) ． 菌体为短杆状，如图1( b) ，尺寸为 0. 2 ～ 0. 4 μm × 1. 5 ～ 2. 0 μm． ( 2) 菌种鉴定． 对纯化后的菌种提取 PCＲ 产 物，测定其碱基序列． 将碱基序列提交至 NCBI ( 美 国国立生物技术信息中心) 与 GenBank 数据进行核 苷酸同 源 性 比 较 分 析． 结 果 显 示，数 据 库 ID 为 IcI | 53297 的目标菌 JAT--1 属于 Providencia 属，其与 Providencia sp. Sam 130--9A 菌株亲缘关系最近，二 者同源性高达 99% ． Thacker 等［13］曾报道过利用该 Providencia sp. ( 普罗威登斯菌属) 处理含 Cr( VI) 工 业废水，效果良好; 而该菌属在对矿物的处理利用方 · 4441 ·

第11期 王洪江等：一株产氨浸铜细菌的分离与鉴定 ·1445· I um 04e184约e2012 ·00其w他·B Tme 18111 D0 图1产氨细菌JAT-一1革兰氏染色和电镜照片.(a)革兰氏染色：(b)电镜照片 Fig.1 Gram stain and SEM image of ammonia producing Strain JAT-1:(a)Gram stain:(b)SEM image 面尚未见报道. 10 2.2碳源质量浓度对产氨细菌的影响 10 碳源质量浓度对菌体的代谢、产物的合成以及 氧的传递等都有密切关系，不同质量浓度碳源对产 6 氨细菌的影响如图2所示. 6 4 12 10 4 一一细南浓度 一▲一氨的质量浓度 2 10152025 303 尿素的质量浓度(g·L 图3尿素的质量浓度对细菌生长及产氨的影响 Fig.3 Effect of urea concentration on bacterial growth and ammonia 一一细菌浓度 2 一一氨的质量浓度 production 510152025 为20gL时溶液中氨的质量浓度最大.因此，细 碳源的质量浓度人·L 菌培养过程中最佳的尿素质量浓度为20gL-1 图2碳源的质量分数浓度对细菌生长及产氨的影响 2.4pH值对产氨细菌的影响 Fig.2 Effect of carbon concentration on bacterial growth and ammo- pH值对产氨细菌生命活动有较大影响，在初始 nia production pH值为5.0~11.0的范围内，48h后产氨细菌都有 图2表明，随着柠檬酸钠浓度的增加，细菌数量 一定程度的生长.最佳初始生长pH值为8.0~9.0 和氨浓度均呈逐渐升高的趋势，且10gL-1条件下细菌 时细菌生长浓度最高：当初始pH值接近10.0时， 生长浓度和溶液中氨的质量浓度明显高于5gL,而 细菌生长开始受到抑制，如图4. 再增加碳源的质量浓度无明显意义.因此，柠檬酸 图5表明，产氨细菌在生长过程中由于分解尿 钠的最佳质量浓度为10gL 素产生氨，使培养液pH值维持在9.0~9.5，而在该 2.3尿素的质量浓度对产氨细菌的影响 pH值环境中细菌能够进行正常生长繁殖.因此，综 尿素是产氨细菌唯一氮源，同时也是细菌产氨 合以上分析，产氨细菌适合生长的pH值为5.0~ 的分解基质，尿素的质量浓度在5~20gL-1范围内 10.0,最佳生长pH值为8.0~9.5 时，细菌生长浓度没有明显区别.但是，当尿素的质 2.5接种浓度对产氨细菌的影响 量浓度升高到25g·L1时，高质量浓度的尿素会破 细菌初始接种浓度对产氨细菌的生长繁殖和代 坏微生物细胞渗透压，影响其正常生长繁殖，导致细 谢产氨具有显著影响，如图6.初始接种浓度低于 菌浓度开始降低，如图3所示. 10%时，细菌生长缓慢，氨的质量浓度也较低：随着初 图3还表明，随着尿素的质量浓度增加，培养液 始接种浓度的增加，细菌生长更快，产氨能力也更强。 中氨的质量浓度先升高后下降，当尿素的质量浓度 初始接种浓度由20%增加到30%时，细菌浓度

第 11 期 王洪江等: 一株产氨浸铜细菌的分离与鉴定 图 1 产氨细菌 JAT--1 革兰氏染色和电镜照片． ( a) 革兰氏染色; ( b) 电镜照片 Fig． 1 Gram stain and SEM image of ammonia producing Strain JAT--1: ( a) Gram stain; ( b) SEM image 面尚未见报道． 2. 2 碳源质量浓度对产氨细菌的影响 碳源质量浓度对菌体的代谢、产物的合成以及 氧的传递等都有密切关系，不同质量浓度碳源对产 氨细菌的影响如图 2 所示． 图 2 碳源的质量分数浓度对细菌生长及产氨的影响 Fig． 2 Effect of carbon concentration on bacterial growth and ammo￾nia production 图 2 表明，随着柠檬酸钠浓度的增加，细菌数量 和氨浓度均呈逐渐升高的趋势，且10 g·L － 1条件下细菌 生长浓度和溶液中氨的质量浓度明显高于 5 g·L － 1，而 再增加碳源的质量浓度无明显意义． 因此，柠檬酸 钠的最佳质量浓度为 10 g·L － 1 ． 2. 3 尿素的质量浓度对产氨细菌的影响 尿素是产氨细菌唯一氮源，同时也是细菌产氨 的分解基质，尿素的质量浓度在 5 ～ 20 g·L － 1范围内 时，细菌生长浓度没有明显区别． 但是，当尿素的质 量浓度升高到 25 g·L － 1时，高质量浓度的尿素会破 坏微生物细胞渗透压，影响其正常生长繁殖，导致细 菌浓度开始降低，如图 3 所示． 图 3 还表明，随着尿素的质量浓度增加，培养液 中氨的质量浓度先升高后下降，当尿素的质量浓度 图 3 尿素的质量浓度对细菌生长及产氨的影响 Fig． 3 Effect of urea concentration on bacterial growth and ammonia production 为 20 g·L － 1时溶液中氨的质量浓度最大． 因此，细 菌培养过程中最佳的尿素质量浓度为 20 g·L － 1 ． 2. 4 pH 值对产氨细菌的影响 pH 值对产氨细菌生命活动有较大影响，在初始 pH 值为 5. 0 ～ 11. 0 的范围内，48 h 后产氨细菌都有 一定程度的生长． 最佳初始生长 pH 值为 8. 0 ～ 9. 0 时细菌生长浓度最高; 当初始 pH 值接近 10. 0 时， 细菌生长开始受到抑制，如图 4． 图 5 表明，产氨细菌在生长过程中由于分解尿 素产生氨，使培养液 pH 值维持在 9. 0 ～ 9. 5，而在该 pH 值环境中细菌能够进行正常生长繁殖． 因此，综 合以上分析，产氨细菌适合生长的 pH 值为 5. 0 ～ 10. 0，最佳生长 pH 值为 8. 0 ～ 9. 5． 2. 5 接种浓度对产氨细菌的影响 细菌初始接种浓度对产氨细菌的生长繁殖和代 谢产氨具有显著影响，如图 6． 初始接种浓度低于 10%时，细菌生长缓慢，氨的质量浓度也较低; 随着初 始接种浓度的增加，细菌生长更快，产氨能力也更强． 初始接种浓度由 20% 增加到 30% 时，细菌浓度 · 5441 ·

·1446· 北京科技大学学报 第36卷 12 20%,以及摇床转速150r·min-'条件下对产氨细菌 进行培养，定期取样检测细菌浓度和氨质量浓度，揭 10 示细菌生长规律和产氨规律，结果如图7和图8. 12 10 8 6 6 7 891011 初始H值 4 图4不同初始pH值培养液细菌浓度 Fig.4 Bacterial concentrations at different initial pH values 1224364860728496 10 时间凸 图7产氨细菌生长曲线 (-Tw Fig.7 Growth curve of ammonia producing strain 6 10 三独 一一溶液pH值 一▲一细南浓度 0 20 40 6080100 培养时间h 图5培养过程中pH值变化及细菌生长规律 Fig.5 pH value variation and bacterial growth rule in culture 12 10 061224364860728496 时间h 图8培养液中氨浓度变化规律 Fig.8 Variation of ammonia concentration in culture medium 6 从图7可以看出，经过生长条件优化和不断转 代活化培养，产氨细菌生长延滞期较短，24~48h 一■一细南浓度 一▲一氨的质量浓度 为生长对数期，72h后逐渐衰亡，生长周期为96h. 图8反映了细菌产氨规律，24h后由于细菌处于生 10152025 30 0 长对数期，其产氨速度开始加快，60h时氨的质量浓 细菌接种浓度% 度达到最高，72h后可能溶液中氨己达到饱和，且不 图6细菌初始接种浓度对细菌生长及氨质量浓度的影响 断的恒温振荡加速了氨的挥发，使溶液中氨浓度逐 Fig.6 Effect of initial inoculation concentration on bacterial growth 渐下降. and ammonia concentration 2.7产氨细菌浸铜规律 和氨质量浓度上升幅度不大.这是由于接种浓度越 为了研究产氨细菌浸铜规律与效果，开展浸矿 大，营养物质消耗越快，代谢产物也积累越多，会对 实验对比研究有菌条件下与无菌条件下铜的浸出情 细菌的生长产生抑制作用.因此，综合细菌生长规 况.采用以上各最佳生长条件对产氨细菌进行培 律、产氨能力、经济成本等因素，细菌初始接种浓度 养，有菌组实验取对数期菌种以20%浓度接种到新 应该为20% 鲜培养基中，按矿浆液固质量比7：1加入-200目铜 2.6优化条件下细菌生长曲线及产氨量 矿，在温度30℃条件下，以0.024molL-1硫酸铵为 以10gL-1柠檬酸钠为碳源，20gL尿素作为 助浸剂进行摇瓶浸出实验.无菌组仅不接种产氨细 唯一氮源，在初始pH值8.5，细菌初始接种浓度 菌，其他条件不变.铜浸出率随时间的变化规律如

北 京 科 技 大 学 学 报 第 36 卷 图 4 不同初始 pH 值培养液细菌浓度 Fig． 4 Bacterial concentrations at different initial pH values 图 5 培养过程中 pH 值变化及细菌生长规律 Fig． 5 pH value variation and bacterial growth rule in culture 图 6 细菌初始接种浓度对细菌生长及氨质量浓度的影响 Fig． 6 Effect of initial inoculation concentration on bacterial growth and ammonia concentration 和氨质量浓度上升幅度不大． 这是由于接种浓度越 大，营养物质消耗越快，代谢产物也积累越多，会对 细菌的生长产生抑制作用． 因此，综合细菌生长规 律、产氨能力、经济成本等因素，细菌初始接种浓度 应该为 20% ． 2. 6 优化条件下细菌生长曲线及产氨量 以 10 g·L － 1柠檬酸钠为碳源，20 g·L － 1尿素作为 唯一氮源，在初始 pH 值 8. 5，细菌初始接种浓度 20% ，以及摇床转速 150 r·min － 1条件下对产氨细菌 进行培养，定期取样检测细菌浓度和氨质量浓度，揭 示细菌生长规律和产氨规律，结果如图 7 和图 8． 图 7 产氨细菌生长曲线 Fig． 7 Growth curve of ammonia producing strain 图 8 培养液中氨浓度变化规律 Fig． 8 Variation of ammonia concentration in culture medium 从图 7 可以看出，经过生长条件优化和不断转 代活化培养，产氨细菌生长延滞期较短，24 ～ 48 h 为生长对数期，72 h 后逐渐衰亡，生长周期为 96 h． 图 8 反映了细菌产氨规律，24 h 后由于细菌处于生 长对数期，其产氨速度开始加快，60 h 时氨的质量浓 度达到最高，72 h 后可能溶液中氨已达到饱和，且不 断的恒温振荡加速了氨的挥发，使溶液中氨浓度逐 渐下降． 2. 7 产氨细菌浸铜规律 为了研究产氨细菌浸铜规律与效果，开展浸矿 实验对比研究有菌条件下与无菌条件下铜的浸出情 况． 采用以上各最佳生长条件对产氨细菌进行培 养，有菌组实验取对数期菌种以 20% 浓度接种到新 鲜培养基中，按矿浆液固质量比 7∶ 1加入 － 200 目铜 矿，在温度 30 ℃条件下，以 0. 024 mol·L － 1硫酸铵为 助浸剂进行摇瓶浸出实验． 无菌组仅不接种产氨细 菌，其他条件不变． 铜浸出率随时间的变化规律如 · 6441 ·

第11期 王洪江等：一株产氨浸铜细菌的分离与鉴定 ·1447· 图9. 参考文献 50 ·一接种20%浓度细南浸矿 [1]Zhan X S.Zhou Y.Study on the processing technology for refrac- 。一无菌浸矿 tory copper oxide ore.Met Ore Dressing Abroad,2009 (1/2):16 40 (詹信顺，周源.难选氧化铜矿石的处理技术研究.国外金属 矿选矿，2009(1/2)：16) 竖30 2] Muir D M.A review of the selective leaching of gold from oxidised copper-gold ores with ammonia-eyanide and new insights for plant 20 control and operation.Miner Eng,2011,24(6):576 B]Park K H,Mohapatra D,Reddy B R,et al.Ramachandra Red- dy,et al.A study on the oxidative ammonia/ammonium sulphate leaching of a complex (Cu-Ni-Co-Fe)matte.Hydrometallurgy 2007,86(3/4):164 20 406080100120140160180 4) Yan JL,Wu A X,Wang H J,et al.Mechanism of incrustation 时间h and anti-incrustation during acidic leaching process.Met Mine 图9产氨细菌浸矿铜浸出率变化规律 2010(10):68 Fig.9 Variation of copper leaching rate with ammonia producing (严佳龙，吴爱祥，王洪江，等.酸法堆浸中矿石结垢及防垢 strain 机理研究.金属矿山，2010(10)：68) [5]Liu D X,Zhao B Z,Jiang K X,et al.Study on treatment of Tang- 从图9可以看出：在无菌组浸矿实验中，铜的浸 dan refractory copper oxide ore with high content of alkali gangues. 出率没有明显变化，在120h铜的浸出率仅为 Min Metall,2003,12(2):49 7.26%.在细菌的作用下，浸出进行36h时铜浸出 (刘大星，赵炳智，蒋开喜，等.汤丹高碱性脉石难选氧化铜 率升高速度增大，144h铜浸出率最高达到42.38%； 矿的试验研究和工业实践.矿治，2003,12(2)：49) 6 随着时间的延长，铜浸出率出现下降趋势，这可能是 Zhao G D.Wu C.Wu H S.Study on Agitation leaching of high- 由于随着浸出的进行，矿浆体系中pH值不断升高， alkaline and low-grade oxidized copper ore.Min Res Der,2010, 30(3):55 细菌代谢产物也不断积累，浸出的铜离子生成胶状 (招国栋，吴超，伍横山.高碱性低品位氧化铜矿搅拌浸出研 化合物或被微生物代谢产物吸附，影响铜离子质量 究.矿业研究与开发，2010,30(3)：55) 浓度的检测.根据以上规律，浸出144h后更换新鲜 1 Yin S H,Wu A X.Qiu GZ.Bioleaching of low-grade copper sul- 浸出剂，能避免铜的损失，提高铜的回收率 phides.Trans Nonferrous Met Soc China,2008,18(3):707 K] Saha M L,Alam A,Khan M R,et al.Bacteriological,physical 3结论 and chemical properties of the Pagla Sewage Treatment Plant's wa- ter.Dhaka Unir J Biol Sci,2012,21(1):1 (1)从土壤中分离得到一株能代谢脲酶分解尿 9]Cong PT,Dung T D,Hien T M,et al.Inoculant plant growth- 素的产氨细菌，革兰氏阴性，杆状，尺寸为(0.4± promoting microorganisms enhance utilisation of urea-N and grain 0.05)μm×(1.50.05)μm.结合16 S rDNA测定 yield of paddy rice in southem Vietnam.Eur J Soil Biol,2009,4 (1):52 和菌株系统发育树分析，鉴定为Providencia Sp.（普 [10]Shu M,Browngardt C M,Chen YY M,et al.Role of Urease 罗威登斯菌属)，与相近菌株Providencia sp.Sam Enzymes in stability of a 10-species oral biofilm consortium culti- 1309A同源性99%，命名为JAT-1. vated in a constant-depth film fermenter.Infect Immun,2003,71 (2)实验结果表明，JAT-1最佳生长条件为以 (12):7188 10gL1柠檬酸钠为碳源、20g·L1尿素为氮源、pH [11]Huang G S,Liu G Z,Duan D X,et al.Effects of ammonia pro- ducing bacteria on corrosion of B30.Corros Prot,2005,26(8): 8.5~9.0、初始接种浓度20%. 333 (3)最佳生长条件下细菌生长和产氨规律表 (黄国胜，刘光洲，段东霞，等.产氨菌对B30铜镍合金腐蚀 明，产氨细菌生长延滞期较短，培养24~48h为细 的影响.腐蚀与防护，2005,26(8)：333) 菌生长对数期，72h后细菌开始衰亡，培养60h后氨 [12]Groudeva VI,Krumova K,Groudev S N.Bioleaching of a rich- 的质量浓度达到最高. in-earbonates copper ore at alkaline pH.Ade Mater Res,2007, 20:103 (4)产氨细菌对碱性铜矿的浸出作用明显，采 [13]Thacker U,Parikh R,Shouche Y,et al.Hexavalent chromium 用最佳生长条件下培养的产氨细菌，在一定条件下 reduction by Providencia sp.Process Biochemistry,2006,41 浸出碱性铜矿，144h后铜浸出率最高可达42.38%. (6):1332

第 11 期 王洪江等: 一株产氨浸铜细菌的分离与鉴定 图 9． 图 9 产氨细菌浸矿铜浸出率变化规律 Fig． 9 Variation of copper leaching rate with ammonia producing strain 从图 9 可以看出: 在无菌组浸矿实验中，铜的浸 出率没有明显变化，在 120 h 铜 的 浸 出 率 仅 为 7. 26% ． 在细菌的作用下，浸出进行 36 h 时铜浸出 率升高速度增大，144 h 铜浸出率最高达到42. 38% ; 随着时间的延长，铜浸出率出现下降趋势，这可能是 由于随着浸出的进行，矿浆体系中 pH 值不断升高， 细菌代谢产物也不断积累，浸出的铜离子生成胶状 化合物或被微生物代谢产物吸附，影响铜离子质量 浓度的检测． 根据以上规律，浸出 144 h 后更换新鲜 浸出剂，能避免铜的损失，提高铜的回收率． 3 结论 ( 1) 从土壤中分离得到一株能代谢脲酶分解尿 素的产氨细菌，革兰氏阴性，杆状，尺寸为( 0. 4 ! 0. 05) μm × ( 1. 5 !0. 05) μm． 结合 16S rDNA 测定 和菌株系统发育树分析，鉴定为 Providencia Sp． ( 普 罗威登斯菌属) ，与相近菌株 Providencia sp. Sam 130--9A 同源性 99% ，命名为 JAT--1． ( 2) 实验结果表明，JAT--1 最佳生长条件为以 10 g·L － 1柠檬酸钠为碳源、20 g·L － 1尿素为氮源、pH 8. 5 ～ 9. 0、初始接种浓度 20% ． ( 3) 最佳生长条件下细菌生长和产氨规律表 明，产氨细菌生长延滞期较短，培养 24 ～ 48 h 为细 菌生长对数期，72 h 后细菌开始衰亡，培养 60 h 后氨 的质量浓度达到最高． ( 4) 产氨细菌对碱性铜矿的浸出作用明显，采 用最佳生长条件下培养的产氨细菌，在一定条件下 浸出碱性铜矿，144 h 后铜浸出率最高可达 42. 38% ． 参 考 文 献 ［1］ Zhan X S，Zhou Y． Study on the processing technology for refrac￾tory copper oxide ore． Met Ore Dressing Abroad，2009( 1 /2) : 16 ( 詹信顺，周源． 难选氧化铜矿石的处理技术研究． 国外金属 矿选矿，2009( 1 /2) : 16) ［2］ Muir D M． A review of the selective leaching of gold from oxidised copper-gold ores with ammonia-cyanide and new insights for plant control and operation． Miner Eng，2011，24( 6) : 576 ［3］ Park K H，Mohapatra D，Ｒeddy B Ｒ，et al． Ｒamachandra Ｒed￾dy，et al． A study on the oxidative ammonia /ammonium sulphate leaching of a complex ( Cu-Ni-Co-Fe) matte． Hydrometallurgy， 2007，86( 3 /4) : 164 ［4］ Yan J L，Wu A X，Wang H J，et al． Mechanism of incrustation and anti-incrustation during acidic leaching process． Met Mine， 2010( 10) : 68 ( 严佳龙，吴爱祥，王洪江，等． 酸法堆浸中矿石结垢及防垢 机理研究． 金属矿山，2010( 10) : 68) ［5］ Liu D X，Zhao B Z，Jiang K X，et al． Study on treatment of Tang￾dan refractory copper oxide ore with high content of alkali gangues． Min Metall，2003，12( 2) : 49 ( 刘大星，赵炳智，蒋开喜，等． 汤丹高碱性脉石难选氧化铜 矿的试验研究和工业实践． 矿冶，2003，12( 2) : 49) ［6］ Zhao G D，Wu C，Wu H S． Study on Agitation leaching of high￾alkaline and low-grade oxidized copper ore． Min Ｒes Dev，2010， 30( 3) : 55 ( 招国栋，吴超，伍横山． 高碱性低品位氧化铜矿搅拌浸出研 究． 矿业研究与开发，2010，30( 3) : 55) ［7］ Yin S H，Wu A X，Qiu G Z． Bioleaching of low-grade copper sul￾phides． Trans Nonferrous Met Soc China，2008，18( 3) : 707 ［8］ Saha M L，Alam A，Khan M Ｒ，et al． Bacteriological，physical and chemical properties of the Pagla Sewage Treatment Plant's wa￾ter． Dhaka Univ J Biol Sci，2012，21( 1) : 1 ［9］ Cong P T，Dung T D，Hien T M，et al． Inoculant plant growth￾promoting microorganisms enhance utilisation of urea-N and grain yield of paddy rice in southern Vietnam． Eur J Soil Biol，2009，4 ( 1) : 52 ［10］ Shu M，Browngardt C M，Chen Y Y M，et al． Ｒole of Urease Enzymes in stability of a 10-species oral biofilm consortium culti￾vated in a constant-depth film fermenter． Infect Immun，2003，71 ( 12) : 7188 ［11］ Huang G S，Liu G Z，Duan D X，et al． Effects of ammonia pro￾ducing bacteria on corrosion of B30． Corros Prot，2005，26( 8) : 333 ( 黄国胜，刘光洲，段东霞，等． 产氨菌对 B30 铜镍合金腐蚀 的影响． 腐蚀与防护，2005，26( 8) : 333) ［12］ Groudeva V I，Krumova K，Groudev S N． Bioleaching of a rich￾in-carbonates copper ore at alkaline pH． Adv Mater Ｒes，2007， 20: 103 ［13］ Thacker U，Parikh Ｒ，Shouche Y，et al． Hexavalent chromium reduction by Providencia sp． Process Biochemistry，2006，41 ( 6) : 1332 · 7441 ·