第十三章生化药物和基因工程药物分析概论 [教学目的 、掌握本类药物质量检验的基本程序与方法类型。 、掌握HPLC法和酶活力测定法在本类药物测定中的应用。 熟悉本类药物的范围、种类、质量控制的要点。 四、了解本类药物含量测定的其他方法。 [本章分配学时数]2学时 [教学环节与教学内容 在上节课,我们进行了药物制剂的分析,要求同学们掌握药物制剂中常见附 加剂的干扰及其排除、熟悉片剂的常规检查以及复方制剂分析方法,并了解注射 液的常规检査。那么,这节课我们就要进行生化药物和基因工程药物的分析,经 过本章的学习后,要求掌握本类药物质量检验的基本程序与方法类型、HPLC法 和酶活力测定法在本类药物测定中的应用,熟悉本类药物的范围、种类、质量控 制的要点,了解本类药物含量测定的其他方法 [复习引入]2分钟 第一节概述 、生化药物和基因工程药物的定义 物药物主要包括:生化药物、生物技术药物、生物制品以及相关的生物医药 产品。 1.生化药物( Biomemical drugs):是从动物、植物及微生物提取的,也可 用生物-化学半合成或用现代生物技术制得的生命基本物质及其衍生物、降解物 以及大分子的结构修饰物等 2.生物技术药物( Biotechnology drugs):生物技术是利用生物体或其组 成部分发展产品的技术体系,用现代生物技术研制的药物称为生物技术药物(或 生物工程药物)。 3.基因工程药物( Genetic engineering drugs):属于生物技术药物范 畴,系指先确定对某种疾病具有预防和治疗作用的蛋白质,然后将控制该蛋白合
- 1 - 第十三章 生化药物和基因工程药物分析概论 [教学目的] 一、掌握本类药物质量检验的基本程序与方法类型。 二、掌握 HPLC 法和酶活力测定法在本类药物测定中的应用。 三、熟悉本类药物的范围、种类、质量控制的要点。 四、了解本类药物含量测定的其他方法。 [本章分配学时数] 2 学时 [教学环节与教学内容] 在上节课,我们进行了药物制剂的分析,要求同学们掌握药物制剂中常见附 加剂的干扰及其排除、熟悉片剂的常规检查以及复方制剂分析方法,并了解注射 液的常规检查。那么,这节课我们就要进行生化药物和基因工程药物的分析,经 过本章的学习后,要求掌握本类药物质量检验的基本程序与方法类型、HPLC 法 和酶活力测定法在本类药物测定中的应用,熟悉本类药物的范围、种类、质量控 制的要点,了解本类药物含量测定的其他方法。 [复习引入] 2 分钟 [教授新课] 第一节 概述 一、 生化药物和基因工程药物的定义 物药物主要包括:生化药物、生物技术药物、生物制品以及相关的生物医药 产品。 1.生化药物(Biomemical drugs):是从动物、植物及微生物提取的,也可 用生物-化学半合成或用现代生物技术制得的生命基本物质及其衍生物、降解物 以及大分子的结构修饰物等。 2.生物技术药物(Biotechnology drugs):生物技术是利用生物体或其组 成部分发展产品的技术体系,用现代生物技术研制的药物称为生物技术药物(或 生物工程药物)。 3.基因工程药物(Genetic engineering drugs):属于生物技术药物范 畴,系指先确定对某种疾病具有预防和治疗作用的蛋白质,然后将控制该蛋白合
成过程的基因分离、纯化或进行人工合成,利用重组DNA技术加以改造,最后将 该基因放入可以大量生产的受体细胞中不断繁殖,并能进行大规模生产具有预防 和治疗这种疾病的蛋白质,通过这种方法生产的新型药物称为基因工程药物。 4.生物制品( Biological medicinal products):是应用普通的或以基因 工程、细胞工程、蛋白质工程、发酵工程等生物技术获得的微生物、细胞及各种 动物和人源的组织和液体等生物材料制备,用于人类疾病预防、治疗和诊断的药 品 、生化药物和基因工程药物的种类 1.生化药物的种类 1)氨基酸、多肽与蛋白质类药物:氨基酸及其衍生物 药用活性多肽 药用蛋白 2)酶类与辅酶类药物 3)多糖类药物 4)脂质类药物 5)核酸及其降解物和衍生物类药物 基因工程药物的种类 1)激素类及神经递质类药物:人生长激素释放抑制因子 人胰岛素 人生长激素 2)细胞因子类药物:人干扰素 人白细胞介素 集落刺激因子 促红细胞生成素 3)酶类及凝血因子类药物 三、生化药物和基因工程药物的特点 1.共同特点 2.分子量大 3.结构确证难
- 2 - 成过程的基因分离、纯化或进行人工合成,利用重组 DNA 技术加以改造,最后将 该基因放入可以大量生产的受体细胞中不断繁殖,并能进行大规模生产具有预防 和治疗这种疾病的蛋白质,通过这种方法生产的新型药物称为基因工程药物。 4.生物制品(Biological medicinal products):是应用普通的或以基因 工程、细胞工程、蛋白质工程、发酵工程等生物技术获得的微生物、细胞及各种 动物和人源的组织和液体等生物材料制备,用于人类疾病预防、治疗和诊断的药 品。 二、 生化药物和基因工程药物的种类 1.生化药物的种类 1)氨基酸、多肽与蛋白质类药物:氨基酸及其衍生物 药用活性多肽 药用蛋白 2)酶类与辅酶类药物 3)多糖类药物 4)脂质类药物 5)核酸及其降解物和衍生物类药物 2.基因工程药物的种类 1)激素类及神经递质类药物:人生长激素释放抑制因子 人胰岛素 人生长激素 2)细胞因子类药物:人干扰素 人白细胞介素 集落刺激因子 促红细胞生成素 3)酶类及凝血因子类药物 三、 生化药物和基因工程药物的特点 1. 共同特点 2. 分子量大 3. 结构确证难
4.全过程的质量控制 5.生物活性检查 6.安全性检查 7.效价(含量)测定 生化药物和基因工程药物生物活性质量控制特点。表13 第二节质量检验的基本程序与方法 生化药物和基因工程药物质量控制的项目:来源与种类、形状、鉴别、氨基 酸组分分析、肽图、糖含量、纯度、干燥失重或水分、炽灼残渣、生物活性、热 源试验、含量分析。 (一)鉴别方法理化鉴别法:化学鉴别法 紫外分光光度法 HPLC法 生化鉴别法:酶法 电泳法 等电聚焦法 生物鉴别法:家兔惊厥试验 (二)杂质检査一般杂质检查、特殊杂质检査。 三)安全性试验热原检査法和细菌内毒素检査法、异常毒性试验、过敏 试验、降压物质试验、无菌试验、基因工程药物中可能杂质与污染物检査、致突 变试验、生殖毒性试验 (四)含量测定 生化药物和基因工程药物的含量表示方法: 百分含量:适用于结构明确的小分子药物或经水解后变成小分子的 药物。 生物效价或酶活力单位:适用于酶类、蛋白质类药物。 第三节常用定量分析方法及其应用 生化药物和基因工程药物的含量测定方法: 理化分析法:化学分析法:重量测定法 滴定分析法
- 3 - 4. 全过程的质量控制 5. 生物活性检查 6. 安全性检查 7. 效价(含量)测定 8. 生化药物和基因工程药物生物活性质量控制特点。表 13-1。 第二节 质量检验的基本程序与方法 生化药物和基因工程药物质量控制的项目:来源与种类、形状、鉴别、氨基 酸组分分析、肽图、糖含量、纯度、干燥失重或水分、炽灼残渣、生物活性、热 源试验、含量分析。 (一)鉴别方法 理化鉴别法:化学鉴别法 紫外分光光度法 HPLC 法 生化鉴别法:酶法 电泳法 等电聚焦法 生物鉴别法:家兔惊厥试验 (二)杂质检查 一般杂质检查、特殊杂质检查。 (三)安全性试验 热原检查法和细菌内毒素检查法、异常毒性试验、过敏 试验、降压物质试验、无菌试验、基因工程药物中可能杂质与污染物检查、致突 变试验、生殖毒性试验 (四)含量测定 生化药物和基因工程药物的含量表示方法: 百分含量:适用于结构明确的小分子药物或经水解后变成小分子的 药物。 生物效价或酶活力单位:适用于酶类、蛋白质类药物。 第三节 常用定量分析方法及其应用 生化药物和基因工程药物的含量测定方法: 理化分析法:化学分析法:重量测定法 滴定分析法
电化学分析法 光谱分析法:比色法 紫外分光光度法 荧光分光光度法 色谱分析法:HPLC法:RP-HPLC HPIEC 灌注色谱法 HPCE法 酶法:酶活力测定法 酶分析法 电泳法 生物检定法 1.HPLC法 方法 适用范围 示例 RP-HPLC法广泛用于肽类、氨基酸、蛋白质生白能的测定 和多糖的定量分析 重组人粒细胞集落刺激 因子的测定 HPIEC法分析蛋白质、多肽 HPGFC法用于多肽和蛋白质的分析与其分重组人肿瘤坏死因子衍 子量的测定 生物的分子量测定 应用示例:中国药典(2000年版)重组人胰岛素的质量控制 1)鉴别: 法1:在效价测定项下,供试品主峰的保留时间应与对照品的一致。 法2:供试品与对照品分别经过酶解后,再分别进行梯度洗脱,供试品 的肽图谱与对照品的肽图谱一致。 2)检査:检査项目有:有关物质、高分子蛋白、锌、氮、干燥失重、无菌
- 4 - 电化学分析法 光谱分析法:比色法 紫外分光光度法 荧光分光光度法 色谱分析法:HPLC 法:RP-HPLC HPIEC HPGFC 灌注色谱法 HPCE 法 酶法:酶活力测定法 酶分析法 电泳法 生物检定法 1.HPLC 法 方法 适用范围 示例 RP-HPLC 法 广泛用于肽类、氨基酸、蛋白质 生白能的测定 和多糖的定量分析 重组人粒细胞集落刺激 因子的测定 HPIEC 法 分析蛋白质、多肽 HPGFC 法 用于多肽和蛋白质的分析与其分 重组人肿瘤坏死因子衍 子量的测定 生物的分子量测定 应用示例:中国药典(2000 年版)重组人胰岛素的质量控制 1)鉴别: 法 1:在效价测定项下,供试品主峰的保留时间应与对照品的一致。 法 2:供试品与对照品分别经过酶解后,再分别进行梯度洗脱,供试品 的肽图谱与对照品的肽图谱一致。 2)检查:检查项目有:有关物质、高分子蛋白、锌、氮、干燥失重、无菌
和细菌内毒素。 有关物质:供试液经梯度洗脱,按峰面积归一化法计算有关物质的量不得超 过3.0% 高分子蛋白质:固定相:色谱用亲水硅胶,它可以分离分子量为5000 6000的球状蛋白。 分离度的测定:用人胰岛素单体和二聚体对照品测定分 离度,以人胰岛素单体和二聚体之间的峰谷高 与二聚体峰高之比作为分离度,不应大于0.6 限量的测定:分别测定供试液(lmg/m1)和对照液(将 供试液稀释成0.01mg/ml),供试液显示的所有 分子量大于重组人胰岛素单体的各峰面积之 和,应不得大于对照液主峰面积(限量1.0%)。 3)效价测定 系统适用性试验:测定胰岛素主峰和A2l脱氨胰岛素峰之间的 分离度与拖尾因子。 含量测定:分别进样供试液和对照液,按峰面积外标法计算含 量。 2.酶活力测定法 1)基本原理 酶活力是指酶催化一定化学反应的能力。酶活力测定实质上是测定一个被酶 所催化的化学反应速度。酶反应速度可以用单位时间反应底物的减少或产物的增 加来表示,酶反应速度越快所表示的酶活力越高。通常酶活力测定时,先制备酶 反应进程曲线和酶浓度曲线。 酶反应进程曲线:纵坐标为底物或产物的变化量,横坐标为反应时间,曲线 斜率表示反应速度。从酶反应进程曲线求得反应的初速度 酶浓度曲线:纵坐标为反应速度,横坐标为酶量。通过酶浓度曲线检验反应 测定系统是否适宜。 酶活力测定的目的就是要通过酶反应速度的测定,求得酶的浓度或含量,因 此,测得的反应速度必须和酶浓度间有线性的比例关系,这也是检验酶反应和测
- 5 - 和细菌内毒素。 有关物质:供试液经梯度洗脱,按峰面积归一化法计算有关物质的量不得超 过 3.0%。 高分子蛋白质:固定相:色谱用亲水硅胶,它可以分离分子量为 5000~ 6000 的球状蛋白。 分离度的测定:用人胰岛素单体和二聚体对照品测定分 离度,以人胰岛素单体和二聚体之间的峰谷高 与二聚体峰高之比作为分离度,不应大于 0.6。 限量的测定:分别测定供试液(1mg/ml)和对照液(将 供试液稀释成 0.01mg/ml),供试液显示的所有 分子量大于重组人胰岛素单体的各峰面积之 和,应不得大于对照液主峰面积(限量 1.0%)。 3)效价测定: 系统适用性试验:测定胰岛素主峰和 A21 脱氨胰岛素峰之间的 分离度与拖尾因子。 含量测定:分别进样供试液和对照液,按峰面积外标法计算含 量。 2.酶活力测定法 1)基本原理 酶活力是指酶催化一定化学反应的能力。酶活力测定实质上是测定一个被酶 所催化的化学反应速度。酶反应速度可以用单位时间反应底物的减少或产物的增 加来表示,酶反应速度越快所表示的酶活力越高。通常酶活力测定时,先制备酶 反应进程曲线和酶浓度曲线。 酶反应进程曲线:纵坐标为底物或产物的变化量,横坐标为反应时间,曲线 斜率表示反应速度。从酶反应进程曲线求得反应的初速度。 酶浓度曲线:纵坐标为反应速度,横坐标为酶量。通过酶浓度曲线检验反应 测定系统是否适宜。 酶活力测定的目的就是要通过酶反应速度的测定,求得酶的浓度或含量,因 此,测得的反应速度必须和酶浓度间有线性的比例关系,这也是检验酶反应和测
定系统是否适宜、正确的标准。 2)酶促反应的条件及影响因素 i.底物的浓度:一般选用底物的浓度[S]=100K i.pH:选用一个适宜的缓冲离子和离子强度、适宜的pH值的缓冲系统来控 制pH ⅲi.温度:酶反应的温度通常选用25℃、30℃或37℃,实验中温度变动应控 制在±0.1℃以内。 辅助因子:有些酶需要金属离子,有些需要相应的辅酶 V.空白和对照试验: 空白试验:是指杂质反应和自发反应引起的变化量,它提供的是未知因 素的影响。空白值可以通过加酶,或不加底物,或二者都加(酶预先经过失效处 理)。 对照试验:是指用纯酶或标准酶制剂测得的结果,主要作为比较或标定 的标准。 3)测定方法:取样测定法、连续测定法 检测方法:紫外-可见分光光度法、荧光分光光度法、旋光法、酶偶联测 定法、电化学测定法、离子选择性电极测定法等。 三、生物检定法 生物检定法是利用药物对生物体(整体动物、离体组织、微生物等)的 作用以测定其效价或生物活性的一种方法 生物检定法的应用范围: 1.药物的效价测定 2.大分子结构的测定 3.微量生理活性物质的测定 重点:生化药物和基因工程药物的定义、特点及其质量检验的基本程序与方法 难点:常用定量分析方法及其应用 [作业 [练习题与答案
- 6 - 定系统是否适宜、正确的标准。 2)酶促反应的条件及影响因素 ⅰ.底物的浓度:一般选用底物的浓度[S]=100Km。 ⅱ.pH:选用一个适宜的缓冲离子和离子强度、适宜的 pH 值的缓冲系统来控 制 pH。 ⅲ.温度:酶反应的温度通常选用 25℃、30℃或 37℃,实验中温度变动应控 制在±0.1℃以内。 ⅳ.辅助因子:有些酶需要金属离子,有些需要相应的辅酶。 ⅴ.空白和对照试验: 空白试验:是指杂质反应和自发反应引起的变化量,它提供的是未知因 素的影响。空白值可以通过加酶,或不加底物,或二者都加(酶预先经过失效处 理)。 对照试验:是指用纯酶或标准酶制剂测得的结果,主要作为比较或标定 的标准。 3)测定方法:取样测定法、连续测定法 检测方法:紫外-可见分光光度法、荧光分光光度法、旋光法、酶偶联测 定法、电化学测定法、离子选择性电极测定法等。 三、生物检定法 生物检定法是利用药物对生物体(整体动物、离体组织、微生物等)的 作用以测定其效价或生物活性的一种方法。 生物检定法的应用范围: 1. 药物的效价测定 2. 大分子结构的测定 3. 微量生理活性物质的测定 [新课小结] 重点:生化药物和基因工程药物的定义、特点及其质量检验的基本程序与方法 难点:常用定量分析方法及其应用 [作业] [练习题与答案]
1.何谓:生化药物、生物技术药物、基因工程药物和生物制品? 2.生化药物和基因工程药物各分哪几种? 3.与化学合成药物的分析相比,生物药物的分析有何特点?
- 7 - 1.何谓:生化药物、生物技术药物、基因工程药物和生物制品? 2.生化药物和基因工程药物各分哪几种? 3.与化学合成药物的分析相比,生物药物的分析有何特点?