第十三章生化药物和基因工程药物分析概论 [教学目的 、掌握本类药物质量检验的基本程序与方法类型。 、掌握HPLC法和酶活力测定法在本类药物测定中的应用。 熟悉本类药物的范围、种类、质量控制的要点。 四、了解本类药物含量测定的其他方法。 [本章分配学时数]2学时 [教学环节与教学内容 在上节课,我们进行了药物制剂的分析,要求同学们掌握药物制剂中常见附 加剂的干扰及其排除、熟悉片剂的常规检查以及复方制剂分析方法,并了解注射 液的常规检査。那么,这节课我们就要进行生化药物和基因工程药物的分析,经 过本章的学习后,要求掌握本类药物质量检验的基本程序与方法类型、HPLC法 和酶活力测定法在本类药物测定中的应用,熟悉本类药物的范围、种类、质量控 制的要点,了解本类药物含量测定的其他方法 [复习引入]2分钟 第一节概述 、生化药物和基因工程药物的定义 物药物主要包括:生化药物、生物技术药物、生物制品以及相关的生物医药 产品。 1.生化药物( Biomemical drugs):是从动物、植物及微生物提取的,也可 用生物-化学半合成或用现代生物技术制得的生命基本物质及其衍生物、降解物 以及大分子的结构修饰物等 2.生物技术药物( Biotechnology drugs):生物技术是利用生物体或其组 成部分发展产品的技术体系,用现代生物技术研制的药物称为生物技术药物(或 生物工程药物)。 3.基因工程药物( Genetic engineering drugs):属于生物技术药物范 畴,系指先确定对某种疾病具有预防和治疗作用的蛋白质,然后将控制该蛋白合
- 1 - 第十三章 生化药物和基因工程药物分析概论 [教学目的] 一、掌握本类药物质量检验的基本程序与方法类型。 二、掌握 HPLC 法和酶活力测定法在本类药物测定中的应用。 三、熟悉本类药物的范围、种类、质量控制的要点。 四、了解本类药物含量测定的其他方法。 [本章分配学时数] 2 学时 [教学环节与教学内容] 在上节课，我们进行了药物制剂的分析，要求同学们掌握药物制剂中常见附 加剂的干扰及其排除、熟悉片剂的常规检查以及复方制剂分析方法，并了解注射 液的常规检查。那么，这节课我们就要进行生化药物和基因工程药物的分析，经 过本章的学习后，要求掌握本类药物质量检验的基本程序与方法类型、HPLC 法 和酶活力测定法在本类药物测定中的应用，熟悉本类药物的范围、种类、质量控 制的要点，了解本类药物含量测定的其他方法。 [复习引入] 2 分钟 [教授新课] 第一节 概述 一、 生化药物和基因工程药物的定义 物药物主要包括：生化药物、生物技术药物、生物制品以及相关的生物医药 产品。 1．生化药物（Biomemical drugs）：是从动物、植物及微生物提取的，也可 用生物-化学半合成或用现代生物技术制得的生命基本物质及其衍生物、降解物 以及大分子的结构修饰物等。 2．生物技术药物（Biotechnology drugs）：生物技术是利用生物体或其组 成部分发展产品的技术体系，用现代生物技术研制的药物称为生物技术药物（或 生物工程药物）。 3．基因工程药物（Genetic engineering drugs）：属于生物技术药物范 畴，系指先确定对某种疾病具有预防和治疗作用的蛋白质，然后将控制该蛋白合
成过程的基因分离、纯化或进行人工合成,利用重组DNA技术加以改造,最后将 该基因放入可以大量生产的受体细胞中不断繁殖,并能进行大规模生产具有预防 和治疗这种疾病的蛋白质,通过这种方法生产的新型药物称为基因工程药物。 4.生物制品( Biological medicinal products):是应用普通的或以基因 工程、细胞工程、蛋白质工程、发酵工程等生物技术获得的微生物、细胞及各种 动物和人源的组织和液体等生物材料制备,用于人类疾病预防、治疗和诊断的药 品 、生化药物和基因工程药物的种类 1.生化药物的种类 1)氨基酸、多肽与蛋白质类药物:氨基酸及其衍生物 药用活性多肽 药用蛋白 2)酶类与辅酶类药物 3)多糖类药物 4)脂质类药物 5)核酸及其降解物和衍生物类药物 基因工程药物的种类 1)激素类及神经递质类药物:人生长激素释放抑制因子 人胰岛素 人生长激素 2)细胞因子类药物:人干扰素 人白细胞介素 集落刺激因子 促红细胞生成素 3)酶类及凝血因子类药物 三、生化药物和基因工程药物的特点 1.共同特点 2.分子量大 3.结构确证难
- 2 - 成过程的基因分离、纯化或进行人工合成，利用重组 DNA 技术加以改造，最后将 该基因放入可以大量生产的受体细胞中不断繁殖，并能进行大规模生产具有预防 和治疗这种疾病的蛋白质，通过这种方法生产的新型药物称为基因工程药物。 4．生物制品（Biological medicinal products）：是应用普通的或以基因 工程、细胞工程、蛋白质工程、发酵工程等生物技术获得的微生物、细胞及各种 动物和人源的组织和液体等生物材料制备，用于人类疾病预防、治疗和诊断的药 品。 二、 生化药物和基因工程药物的种类 1．生化药物的种类 1）氨基酸、多肽与蛋白质类药物：氨基酸及其衍生物 药用活性多肽 药用蛋白 2）酶类与辅酶类药物 3）多糖类药物 4）脂质类药物 5）核酸及其降解物和衍生物类药物 2．基因工程药物的种类 1）激素类及神经递质类药物：人生长激素释放抑制因子 人胰岛素 人生长激素 2）细胞因子类药物：人干扰素 人白细胞介素 集落刺激因子 促红细胞生成素 3）酶类及凝血因子类药物 三、 生化药物和基因工程药物的特点 1. 共同特点 2. 分子量大 3. 结构确证难
4.全过程的质量控制 5.生物活性检查 6.安全性检查 7.效价(含量)测定 生化药物和基因工程药物生物活性质量控制特点。表13 第二节质量检验的基本程序与方法 生化药物和基因工程药物质量控制的项目:来源与种类、形状、鉴别、氨基 酸组分分析、肽图、糖含量、纯度、干燥失重或水分、炽灼残渣、生物活性、热 源试验、含量分析。 (一)鉴别方法理化鉴别法:化学鉴别法 紫外分光光度法 HPLC法 生化鉴别法:酶法 电泳法 等电聚焦法 生物鉴别法:家兔惊厥试验 (二)杂质检査一般杂质检查、特殊杂质检査。 三)安全性试验热原检査法和细菌内毒素检査法、异常毒性试验、过敏 试验、降压物质试验、无菌试验、基因工程药物中可能杂质与污染物检査、致突 变试验、生殖毒性试验 (四)含量测定 生化药物和基因工程药物的含量表示方法: 百分含量:适用于结构明确的小分子药物或经水解后变成小分子的 药物。 生物效价或酶活力单位:适用于酶类、蛋白质类药物。 第三节常用定量分析方法及其应用 生化药物和基因工程药物的含量测定方法: 理化分析法:化学分析法:重量测定法 滴定分析法
- 3 - 4. 全过程的质量控制 5. 生物活性检查 6. 安全性检查 7. 效价（含量）测定 8. 生化药物和基因工程药物生物活性质量控制特点。表 13-1。 第二节 质量检验的基本程序与方法 生化药物和基因工程药物质量控制的项目：来源与种类、形状、鉴别、氨基 酸组分分析、肽图、糖含量、纯度、干燥失重或水分、炽灼残渣、生物活性、热 源试验、含量分析。 （一）鉴别方法 理化鉴别法：化学鉴别法 紫外分光光度法 HPLC 法 生化鉴别法：酶法 电泳法 等电聚焦法 生物鉴别法：家兔惊厥试验 （二）杂质检查 一般杂质检查、特殊杂质检查。 （三）安全性试验 热原检查法和细菌内毒素检查法、异常毒性试验、过敏 试验、降压物质试验、无菌试验、基因工程药物中可能杂质与污染物检查、致突 变试验、生殖毒性试验 （四）含量测定 生化药物和基因工程药物的含量表示方法： 百分含量：适用于结构明确的小分子药物或经水解后变成小分子的 药物。 生物效价或酶活力单位：适用于酶类、蛋白质类药物。 第三节 常用定量分析方法及其应用 生化药物和基因工程药物的含量测定方法： 理化分析法：化学分析法：重量测定法 滴定分析法
电化学分析法 光谱分析法:比色法 紫外分光光度法 荧光分光光度法 色谱分析法:HPLC法:RP-HPLC HPIEC 灌注色谱法 HPCE法 酶法:酶活力测定法 酶分析法 电泳法 生物检定法 1.HPLC法 方法 适用范围 示例 RP-HPLC法广泛用于肽类、氨基酸、蛋白质生白能的测定 和多糖的定量分析 重组人粒细胞集落刺激 因子的测定 HPIEC法分析蛋白质、多肽 HPGFC法用于多肽和蛋白质的分析与其分重组人肿瘤坏死因子衍 子量的测定 生物的分子量测定 应用示例:中国药典(2000年版)重组人胰岛素的质量控制 1)鉴别: 法1:在效价测定项下,供试品主峰的保留时间应与对照品的一致。 法2:供试品与对照品分别经过酶解后,再分别进行梯度洗脱,供试品 的肽图谱与对照品的肽图谱一致。 2)检査:检査项目有:有关物质、高分子蛋白、锌、氮、干燥失重、无菌
- 4 - 电化学分析法 光谱分析法：比色法 紫外分光光度法 荧光分光光度法 色谱分析法：HPLC 法：RP-HPLC HPIEC HPGFC 灌注色谱法 HPCE 法 酶法：酶活力测定法 酶分析法 电泳法 生物检定法 1．HPLC 法 方法 适用范围 示例 RP-HPLC 法 广泛用于肽类、氨基酸、蛋白质 生白能的测定 和多糖的定量分析 重组人粒细胞集落刺激 因子的测定 HPIEC 法 分析蛋白质、多肽 HPGFC 法 用于多肽和蛋白质的分析与其分 重组人肿瘤坏死因子衍 子量的测定 生物的分子量测定 应用示例：中国药典（2000 年版）重组人胰岛素的质量控制 1）鉴别： 法 1：在效价测定项下，供试品主峰的保留时间应与对照品的一致。 法 2：供试品与对照品分别经过酶解后，再分别进行梯度洗脱，供试品 的肽图谱与对照品的肽图谱一致。 2）检查：检查项目有：有关物质、高分子蛋白、锌、氮、干燥失重、无菌
和细菌内毒素。 有关物质:供试液经梯度洗脱,按峰面积归一化法计算有关物质的量不得超 过3.0% 高分子蛋白质:固定相:色谱用亲水硅胶,它可以分离分子量为5000 6000的球状蛋白。 分离度的测定:用人胰岛素单体和二聚体对照品测定分 离度,以人胰岛素单体和二聚体之间的峰谷高 与二聚体峰高之比作为分离度,不应大于0.6 限量的测定:分别测定供试液(lmg/m1)和对照液(将 供试液稀释成0.01mg/ml),供试液显示的所有 分子量大于重组人胰岛素单体的各峰面积之 和,应不得大于对照液主峰面积(限量1.0%)。 3)效价测定 系统适用性试验:测定胰岛素主峰和A2l脱氨胰岛素峰之间的 分离度与拖尾因子。 含量测定:分别进样供试液和对照液,按峰面积外标法计算含 量。 2.酶活力测定法 1)基本原理 酶活力是指酶催化一定化学反应的能力。酶活力测定实质上是测定一个被酶 所催化的化学反应速度。酶反应速度可以用单位时间反应底物的减少或产物的增 加来表示,酶反应速度越快所表示的酶活力越高。通常酶活力测定时,先制备酶 反应进程曲线和酶浓度曲线。 酶反应进程曲线:纵坐标为底物或产物的变化量,横坐标为反应时间,曲线 斜率表示反应速度。从酶反应进程曲线求得反应的初速度 酶浓度曲线:纵坐标为反应速度,横坐标为酶量。通过酶浓度曲线检验反应 测定系统是否适宜。 酶活力测定的目的就是要通过酶反应速度的测定,求得酶的浓度或含量,因 此,测得的反应速度必须和酶浓度间有线性的比例关系,这也是检验酶反应和测
- 5 - 和细菌内毒素。 有关物质：供试液经梯度洗脱，按峰面积归一化法计算有关物质的量不得超 过 3.0%。 高分子蛋白质：固定相：色谱用亲水硅胶，它可以分离分子量为 5000～ 6000 的球状蛋白。 分离度的测定：用人胰岛素单体和二聚体对照品测定分 离度，以人胰岛素单体和二聚体之间的峰谷高 与二聚体峰高之比作为分离度，不应大于 0.6。 限量的测定：分别测定供试液（1mg/ml）和对照液（将 供试液稀释成 0.01mg/ml），供试液显示的所有 分子量大于重组人胰岛素单体的各峰面积之 和，应不得大于对照液主峰面积（限量 1.0%）。 3）效价测定： 系统适用性试验：测定胰岛素主峰和 A21 脱氨胰岛素峰之间的 分离度与拖尾因子。 含量测定：分别进样供试液和对照液，按峰面积外标法计算含 量。 2．酶活力测定法 1）基本原理 酶活力是指酶催化一定化学反应的能力。酶活力测定实质上是测定一个被酶 所催化的化学反应速度。酶反应速度可以用单位时间反应底物的减少或产物的增 加来表示，酶反应速度越快所表示的酶活力越高。通常酶活力测定时，先制备酶 反应进程曲线和酶浓度曲线。 酶反应进程曲线：纵坐标为底物或产物的变化量，横坐标为反应时间，曲线 斜率表示反应速度。从酶反应进程曲线求得反应的初速度。 酶浓度曲线：纵坐标为反应速度，横坐标为酶量。通过酶浓度曲线检验反应 测定系统是否适宜。 酶活力测定的目的就是要通过酶反应速度的测定，求得酶的浓度或含量，因 此，测得的反应速度必须和酶浓度间有线性的比例关系，这也是检验酶反应和测
定系统是否适宜、正确的标准。 2)酶促反应的条件及影响因素 i.底物的浓度:一般选用底物的浓度[S]=100K i.pH:选用一个适宜的缓冲离子和离子强度、适宜的pH值的缓冲系统来控 制pH ⅲi.温度:酶反应的温度通常选用25℃、30℃或37℃,实验中温度变动应控 制在±0.1℃以内。 辅助因子:有些酶需要金属离子,有些需要相应的辅酶 V.空白和对照试验: 空白试验:是指杂质反应和自发反应引起的变化量,它提供的是未知因 素的影响。空白值可以通过加酶,或不加底物,或二者都加(酶预先经过失效处 理)。 对照试验:是指用纯酶或标准酶制剂测得的结果,主要作为比较或标定 的标准。 3)测定方法:取样测定法、连续测定法 检测方法:紫外-可见分光光度法、荧光分光光度法、旋光法、酶偶联测 定法、电化学测定法、离子选择性电极测定法等。 三、生物检定法 生物检定法是利用药物对生物体(整体动物、离体组织、微生物等)的 作用以测定其效价或生物活性的一种方法 生物检定法的应用范围: 1.药物的效价测定 2.大分子结构的测定 3.微量生理活性物质的测定 重点:生化药物和基因工程药物的定义、特点及其质量检验的基本程序与方法 难点:常用定量分析方法及其应用 [作业 [练习题与答案
- 6 - 定系统是否适宜、正确的标准。 2）酶促反应的条件及影响因素 ⅰ.底物的浓度：一般选用底物的浓度[S]=100Km。 ⅱ.pH：选用一个适宜的缓冲离子和离子强度、适宜的 pH 值的缓冲系统来控 制 pH。 ⅲ.温度：酶反应的温度通常选用 25℃、30℃或 37℃，实验中温度变动应控 制在±0.1℃以内。 ⅳ.辅助因子：有些酶需要金属离子，有些需要相应的辅酶。 ⅴ.空白和对照试验： 空白试验：是指杂质反应和自发反应引起的变化量，它提供的是未知因 素的影响。空白值可以通过加酶，或不加底物，或二者都加（酶预先经过失效处 理）。 对照试验：是指用纯酶或标准酶制剂测得的结果，主要作为比较或标定 的标准。 3）测定方法：取样测定法、连续测定法 检测方法：紫外-可见分光光度法、荧光分光光度法、旋光法、酶偶联测 定法、电化学测定法、离子选择性电极测定法等。 三、生物检定法 生物检定法是利用药物对生物体（整体动物、离体组织、微生物等）的 作用以测定其效价或生物活性的一种方法。 生物检定法的应用范围： 1. 药物的效价测定 2. 大分子结构的测定 3. 微量生理活性物质的测定 [新课小结] 重点：生化药物和基因工程药物的定义、特点及其质量检验的基本程序与方法 难点：常用定量分析方法及其应用 [作业] [练习题与答案]
1.何谓:生化药物、生物技术药物、基因工程药物和生物制品? 2.生化药物和基因工程药物各分哪几种? 3.与化学合成药物的分析相比,生物药物的分析有何特点?
- 7 - 1．何谓：生化药物、生物技术药物、基因工程药物和生物制品？ 2．生化药物和基因工程药物各分哪几种？ 3．与化学合成药物的分析相比，生物药物的分析有何特点？
