实验八 肉制品中亚硝酸盐与硝酸盐的测定 一、亚硝酸盐测定 (一)原理：样品经沉淀蛋白质，除去脂肪后，在弱酸条件下与对氨基苯磺酸重氨化以后， 再与、-1-禁基乙二胺偶合形成紫红色染料，与标准比较定量。 (二)试剂 1.氯化铵缓冲液：在1儿玻璃烧杯中，加入500ml水，准确加入20ml盐酸，混匀，准确 加入50m1氨水，必要时用稀盐酸和稀氨水调试至p9.6-9.7。 2.硫酸锌溶液(0.42mol/L)：称取120g硫酸锌用水溶解，并稀释至1000ml。 3.氢氧化钠溶液(20g/L)：称取20g氢氧化钠用水溶解，稀释至1000ml。 4.对氨基苯磺酸溶液：称取1g对氨基苯磺酸，溶于70ml水和30ml醋酸中，置棕色瓶 中混匀，室温保存。 5.N-1-萘基乙二胺溶液：称取0.1gN-1-萘基乙二胺，加60%醋酸溶解，并稀释至 100ml,混匀后，置棕色瓶中，在冰箱中保存，一周内稳定。 6。显色剂：临用前将N-1-萘基乙二胺和对氨基苯磺酸溶液等体积混合。 7.亚硝酸钠标准溶液：准确称取0.2500g于硅胶干燥器中干燥24h的亚硝酸钠，加水溶 解移入500ml容量瓶中，加100m1氯化铵缓冲液，加水稀释至刻度，混匀，在4℃避光 保存，此溶液每毫升相当于500ug的亚硝酸钠，作准备液。 8.亚硝酸钠标准使用液：临用前，吸取亚硝酸钠标准溶液1.0加l置于100ml容量瓶中， 加水稀至刻度，此溶液每毫升相当于5.0ug亚硝酸钠。 (三)仪器：小型绞肉机，匀浆器，分光光度计。 (四)操作方法 1.样品处理：称取约10.0g(粮食取5g)经纹碎混匀的样品，置于匀浆器中，加70m1水 和12ml的氢氧化钠溶液，混匀，用氢氧化钠溶液调样品pH=8，定量转移至250ml容量 瓶中，加10ml硫酸锌溶液，混匀，如不产生白色沉淀，再补加2-5l氢氧化钠，混匀， 置60℃水浴中加热10min,取出后冷至室温，加水至刻度，混匀。放置0.5h,除去上 层脂肪，用滤纸过滤，弃去初滤液20m1,收集滤液备用。 2.测定 (1)亚硝酸盐标准曲线的制备：吸取0、0.5,1.0,2.0,3.0,4.0,5.0ml 亚硝酸钠标准使用液分别置于25ml具塞比色管中，于标准管中分别加入4.5l氯化铵缓
实验八 肉制品中亚硝酸盐与硝酸盐的测定 一、亚硝酸盐测定 （一）原理 : 样品经沉淀蛋白质，除去脂肪后，在弱酸条件下与对氨基苯磺酸重氮化以后， 再与 N-1- 萘基乙二胺偶合形成紫红色染料，与标准比较定量。 （二）试剂 1. 氯化铵缓冲液：在 1L 玻璃烧杯中，加入 500ml 水，准确加入 20ml 盐酸，混匀，准确 加入 50ml 氨水，必要时用稀盐酸和稀氨水调试至 pH9.6-9.7 。 2. 硫酸锌溶液（ 0.42mol/L ）：称取 120g 硫酸锌用水溶解，并稀释至 1000ml 。 3. 氢氧化钠溶液（ 20g/L ） : 称取 20g 氢氧化钠用水溶解，稀释至 1000ml 。 4. 对氨基苯磺酸溶液：称取 1g 对氨基苯磺酸，溶于 70ml 水和 30ml 醋酸中，置棕色瓶 中混匀，室温保存。 5. N-1- 萘基乙二胺溶液：称取 0.1gN-1- 萘基乙二胺，加 60% 醋酸溶解，并稀释至 100ml ，混匀后，置棕色瓶中，在冰箱中保存，一周内稳定。 6. 显色剂：临用前将 N-1- 萘基乙二胺和对氨基苯磺酸溶液等体积混合。 7. 亚硝酸钠标准溶液：准确称取 0.2500g 于硅胶干燥器中干燥 24h 的亚硝酸钠，加水溶 解移入 500ml 容量瓶中，加 100ml 氯化铵缓冲液，加水稀释至刻度，混匀，在 4 ℃避光 保存，此溶液每亳升相当于 500ug 的亚硝酸钠，作准备液。 8. 亚硝酸钠标准使用液：临用前，吸取亚硝酸钠标准溶液 1.0ml 置于 100ml 容量瓶中， 加水稀至刻度，此溶液每毫升相当于 5.0ug 亚硝酸钠。 （三）仪器： 小型绞肉机，匀浆器，分光光度计。 （四）操作方法 1. 样品处理：称取约 10.0g （粮食取 5g ）经绞碎混匀的样品，置于匀浆器中，加 70ml 水 和 12ml 的氢氧化钠溶液，混匀，用氢氧化钠溶液调样品 pH=8 ，定量转移至 250ml 容量 瓶中，加 10ml 硫酸锌溶液，混匀，如不产生白色沉淀，再补加 2-5ml 氢氧化钠，混匀， 置 60 ℃水浴中加热 10min ，取出后冷至室温，加水至刻度，混匀。放置 0.5h ，除去上 层脂肪，用滤纸过滤，弃去初滤液 20ml ，收集滤液备用。 2. 测定 （ 1 ）亚硝酸盐标准曲线的制备：吸取 0 、 0.5 ， 1.0 ， 2.0 ， 3.0 ， 4.0 ， 5.0ml 亚硝酸钠标准使用液分别置于 25ml 具塞比色管中，于标准管中分别加入 4.5ml 氯化铵缓
冲，加2.5ml60%醋酸后，立即加入5.0ml显色剂，加水至零点，于波长550m处测吸光 度，绘制标准曲线，求出回归方程。 低含量样品以制备低含量标准曲线计算，标准系列为0,0.4,0.8,1.2,1.6,2.0ml 亚硝酸盐标淮使用液（相当于0,2,4,8,1.0g亚硝酸钠） (2)样品测定：吸取10样品滤液于25l具塞红色管中，其它试剂按标准系列法操作， 同时做试剂空白。 二、硝酸盐测定 (一)原理：样品经沉淀蛋白质，除去脂肪后，溶液通过镉柱，使其中的硝酸根离子还原 成亚硝酸根离子，在弱酸性条件下，亚硝酸根与对氨基苯磺酸重氨化后，再与心1-萘基乙 二胺偶合形成红色染料，测得亚硝酸盐总量，由总量减去亚硝酸盐含量即得硝酸盐含量。 (二)试剂 1.氯化铵缓冲溶液。+ 2.疏酸隔溶液：称取37g硫酸隔用水溶解，稀释至10001， 3.盐酸溶液：吸取8.4n1浓盐酿，用水稀释至10001. 4.硝酸钠标准溶液：准确称取0.5000g于110120℃干燥恒 重的硝酸钠，加水溶解，移至500m1容量瓶中，加501氧化铵缓 中液，用水稀释至刻度，混匀，在4度冰箱中避光，保存，此溶 液每nl剂 使 。临用时吸取硝酸钠标准溶液11， 瓶中，加水稀释至刻度，混匀，临用时现配，此溶液每 毫升相当于10u硝酸钠。 6,亚硝酸钠标准使用液，同一。 7.镉柱及制备：于500m1硫酸福溶液中，投入足够的锌棒经 3-4h,当其中的福全部被锌置换后，用玻璃棒轻轻刮下，取出残刹 锌棒，使语沉淀，倾去上层清液，以水用倾斜法多次洗涤，然后移 入粉碎机中，加5001水控散约2秒，用水将金属细粒洗至标准筛 上，取20-40目之间的部分，置试剂瓶中，用水封盖保存，备用。 福柱还原效率的测定，取25m1酸式滴定管数支，向柱底压入图4篇柱装置图(cn) 1©高的玻璃棉作垫，上置一小漏斗，将新置的隔柱带水加入柱内，边装边轻敲击术，挂除 柱内空气，加福粉至8-10m高，上而用1面高的玻座棉强盖。上置一液漏斗。 当福柱墙装好后，先用251盐酸洗涤，再以水洗两次，每次251，调节术流速度至 3-5n1/ 用时用水封盖， 随时都要保持水平面在镉层之上，不得使福层夹有气泡， 镉柱每次使用完毕后，应先以25m1盐酸洗涤，再以水洗两次，每次25后用水覆盖镉柱 柱先加25ml氯化铵缓冲液，至液面接近海绵镉时，吸取2ml硝酸钠标准使用液，控制流 速，用50ml容量瓶接收，加入5ml氯化铵缓冲液，液面接近海绵镉时，加入15ml水洗 柱，还原液和洗涤一并流入50容量瓶中，加60%醋酸，10m1显色剂，加水稀释至刻度
冲，加 2.5ml60% 醋酸后，立即加入 5.0ml 显色剂，加水至零点，于波长 550nm 处测吸光 度，绘制标准曲线，求出回归方程。 低含量样品以制备低含量标准曲线计算，标准系列为 0 ，0.4 ，0.8 ，1.2 ，1.6 ，2.0ml 亚硝酸盐标准使用液（相当于 0 ， 2 ， 4 ， 8 ， 1.0 ug 亚硝酸钠） （ 2 ）样品测定：吸取 10 样品滤液于 25ml 具塞红色管中，其它试剂按标准系列法操作， 同时做试剂空白。 二、硝酸盐测定 （一）原理： 样品经沉淀蛋白质，除去脂肪后，溶液通过镉柱，使其中的硝酸根离子还原 成亚硝酸根离子，在弱酸性条件下，亚硝酸根与对氨基苯磺酸重氮化后，再与 N-1- 萘基乙 二胺偶合形成红色染料，测得亚硝酸盐总量，由总量减去亚硝酸盐含量即得硝酸盐含量。 镉柱每次使用完毕后，应先以 25ml 盐酸洗涤，再以水洗两次，每次 25 后用水覆盖镉柱。 柱先加 25ml 氯化铵缓冲液，至液面接近海绵镉时，吸取 2ml 硝酸钠标准使用液，控制流 速，用 50ml 容量瓶接收，加入 5ml 氯化铵缓冲液，液面接近海绵镉时，加入 15ml 水洗 柱，还原液和洗涤一并流入 50 容量瓶中，加 60% 醋酸， 10ml 显色剂，加水稀释至刻度
混匀。暗处放置25min,用1cm比色杯，以标准零管调节零点，于波长550nm处测吸光 度，根据亚硝酸盐标准溶液计算还原效率（如镉柱还原率小于95%，应经盐酸浸泡活化处 理)。 ×1.232 ×100 20 式中：名。一一不原效率，% 20一一硝酸盐的质量，ug 1 290- 亚硝酸盐换算成硝酸盐的系数。 (三)操作方法：经活化的镉 1氯化铵缓冲液，到液面接近海绵镉时，准 确吸取样品滤液101，加入镉术还原，以下按镉术还原率视测定法依法操作。 (四)计算 (m）X1.232×10004 ×100 式中：一 品中硝酸盐的含量kg 一样品的质量g 一经镉粉还原后测得亚硝酸钠的总量，g 一直接测得亚硝酸盐的含量， 1.23 亚酸盐换成盐的系数 样品处理液总体积1 Vs- 一测定用样液体积，1。 结果的表述，报告算术平均值的两位有效数字。· 允许差：相对相差≤10%。 三、说明 1,根据GB5198-84食品中亚硝酸盐限量卫生标准规定（表1-11）： 表1-11肉品中亚硝酸盐探量卫生标准 指标（以,计)，kg 肉英（鲜） 3 蛋类〔鲜) 50 乳粉和 23 C2760-80规定： 肉类醒头最大使用量0.50g/九g,残留量≤50mgkg 肉制品0.15g/kg,残留量≤30mg/kg: 净肉制盐水火腿残留量≤7 Ong/kg 2.本方法亚硝酸盐方法检出限为1gkg,硝酸盐方法检出为1.4gkg 3。硝酸盐和亚硝酸盐是食品添加剂中发色剂，添加在制品中后转化为亚硝酸，它极易分解 出亚硝基，与肌红蛋白反应生成鲜艳的亮红色的亚硝基血色原，从而赋予食品鲜艳的红色
混匀。暗处放置 25min ，用 1cm 比色杯，以标准零管调节零点，于波长 550nm 处测吸光 度，根据亚硝酸盐标准溶液计算还原效率（如镉柱还原率小于 95 ％，应经盐酸浸泡活化处 理）。 3. 硝酸盐和亚硝酸盐是食品添加剂中发色剂，添加在制品中后转化为亚硝酸，它极易分解 出亚硝基，与肌红蛋白反应生成鲜艳的亮红色的亚硝基血色原，从而赋予食品鲜艳的红色
另外，亚硝酸盐对抑制微生物增殖有一定作用，与食盐并用，可增加抑菌，对肉毒梭状芽孢 杆菌有特殊抑制作用。 4.亚硝酸盐摄入量过多会对人体产生毒害作用。在p6.0-7.0从-18-22℃温度范围内， 亚硝酸盐与仲胺反应生成亚硝胺，具有致癌作用，已得到公认，另外误食亚硝酸钠为食盐在 国内也屡屡发生，过多地摄入亚硝酸盐会引起正常血红蛋白转变为高铁血红蛋白，而失去携 氧功能，导致组织缺氧，引起肠原性青紫症。 5.硫酸锌溶液，在H=8.0产生氢氧化锌是蛋白质沉淀剂，这是GB/T5009.33-1996方法 和过去GB5009.33-85不同的地方，后者采用亚铁氢化钾和乙酸锌溶液，产生亚铁氰化锌沉 淀与蛋白质产生共沉淀，另还应饱和硼砂溶液，也是蛋白质沉淀剂。 6.显色反应式 +wa+on监aoH+c a.aa分+0gOoa4 2C·NH.CH.CHN-○>-NN-○-SH+H 镉柱还原可定量地将心，还原成O Cd+NO; Cdo+NO:+ 镉柱经使用后，用稀盐酸除去表面氧化镉可重新使用 Cd0+2Hc1→Cc1.tH0 7。氨缓冲液除控制溶液的p班条件外，又可缓解隔对亚硝酸根的还原，还可作为络合剂， 以防止反应生成的c与o形成沉淀， 8.在制取海绵状镉和装镉术时最好在水中进行，勿使镉粒暴露于空气中以免氧化，每 次使用完毕后，应先以25m10.1mol/L盐酸洗涤，再以水洗两次，每次25ml,最后用水覆 盖镉信，镉柱还原率应当经常检查。 9.本法是国家标准食品中亚硝酸盐和硝酸盐的测定方法(GB/T5009.33-1996）
另外，亚硝酸盐对抑制微生物增殖有一定作用，与食盐并用，可增加抑菌，对肉毒梭状芽孢 杆菌有特殊抑制作用。 4. 亚硝酸盐摄入量过多会对人体产生毒害作用。在 pH6.0-7.0 从 -18-22 ℃温度范围内， 亚硝酸盐与仲胺反应生成亚硝胺，具有致癌作用，已得到公认，另外误食亚硝酸钠为食盐在 国内也屡屡发生，过多地摄入亚硝酸盐会引起正常血红蛋白转变为高铁血红蛋白，而失去携 氧功能，导致组织缺氧，引起肠原性青紫症。 5. 硫酸锌溶液，在 pH=8.0 产生氢氧化锌是蛋白质沉淀剂，这是 GB/T5009.33-1996 方法 和过去 GB5009.33-85 不同的地方，后者采用亚铁氢化钾和乙酸锌溶液，产生亚铁氰化锌沉 淀与蛋白质产生共沉淀，另还应饱和硼砂溶液，也是蛋白质沉淀剂。 9. 本法是国家标准食品中亚硝酸盐和硝酸盐的测定方法（ GB/T5009.33-1996 ）。 8. 在制取海绵状镉和装镉术时最好在水中进行，勿使镉粒暴露于空气中以免氧化，每 次使用完毕后，应先以 25ml0.1mol/L 盐酸洗涤，再以水洗两次，每次 25ml ，最后用水覆 盖镉信，镉柱还原率应当经常检查