C35.040 中华人民共和国国家标准 Gt￥℃B509356-293 食品中合成着色剂的测定 Determination of synthetic colour in foods 2003-08-11发布 2004-01-01实施 串朵靠秘器委贵雲发布 2
GB/T5009.35-2003 前 言 本标准代替GB/T5009.35-一1996食品中合成者色剂的测定方法》 本标准与GB/T5009.35一1996相比主要修改如下： 一修改了标准的中文名称，标准中文名称改为《食品中合成兼色剂的测定： -按照GB/T20001.4一2001《标准缩写规则第4部分：化学分析方法》对原标准的结构进行了 修改 -增加了示被极谱法作为第三法。 本标准由中华人民共和国卫生部提出并归口。 本标准第一法由天律巾食品卫生监督检验所，辽宁省食品卫生监督检验所、宁艾回族自治区卫生防 疫站、西安市卫生防疫站负责起草。 本标准第二法由卫生部食品卫生监督检验所负资起草 木标准第三法由卫生部食品卫生监督检验所负费起草， 本标准于1985年首次发布，于1996年第一次修订，本次为第二次修订。 276
GB/T5009.35-2003 食品中合成着色剂的测定 1范围 本标准规定了食品中合成着色剂的测定方法。 本标准适用于食品中合成着色剂的测定。 本方法检出限：新红5ng、柠檬黄4g、苋菜红6g、网脂红8n唱、日落黄7ng、赤莓红18ng、亮燕 26ng,当进样量相当0.025g时，检出浓度分别为0.2mg/kg10.16mg/kg0.24mg/kg0.32mg/kg: 0.28 mg/kg:0.72 mg/kg:1.04 mg/kg. 第一法高效液相色谱法 2原理 食品中人工合成着色剂用聚酰胺吸附法或液液分配法提取，制成水溶液，注人高效液相色谱仪，经 反相色谱分离，根据保留时间定性和与蜂面积比较进行定量。 3试剂 3.1正已烷。 3.2盐酸 3.3乙酸， 3.4甲醇：经0.5um滤膜过滤。 3.5聚酰胺粉（尼龙6）：过200日筛。 3.6乙酸铵溶液(0.02mol/L):称取1.54g乙酸铵，加水至1000mL,溶解，经0.45m滤膜过滤 3.7氨水：量取氨水2mL,加水至100nL,混匀。 3.8氨水-乙酸铵溶液(0.02mol/L):量取氢水0.5mL,加乙酸铵溶液(0.02mol/L)至1000mL, 混匀。 3.9甲醇-甲酸(6+4)溶液：量取甲醇60mL,甲酸40ml,混匀. ,柠檬酸溶波：称取20g柠檬酸(CHO,·HO》,加水至100mL,溶解混匀 1)溶液 量取无水乙醇70mL氨水20mL 水10mL,混匀。 3.12三正辛胺正丁醇溶液(5%)：景取三正辛胺5mL,如正丁醇至100mL,混匀. 3.13饱和硫酸纳溶液。 3.14硫酸钠溶液(2g/L), 3.15DH6的水，水加拧整酸溶液调pH值到6。 3.16合成者 剂标准溶液：准确称取按其纯度折算为10%质量的柠黄、日落黄、苋菜红、因脂红 新红、赤藓红、亮蓝、靛蓝各0.1008，置100mL容量瓶中，加pH6水到刻度，配成水溶 液(1.00g/mL). 3.17合成着色剂标准使用液：临用时上述溶液（或将3.16）加水稀释20倍，经0.45m被膜过滤，配 成每毫升相当于50.0g的合成者色剂。 4仪器 高效液相色谱仪，带紫外检测器，254nm波长。 277
GB/T5009.35-2003 5分析步骤 5.1试样处理 5.1.1桔子汁、果味水、果子露汽水等：称取20.0g一40.0g,放入100mL烧杯中，含二氧化碳试样加 热驱除二氧化碳。 5.1.2配制酒类：称取20.0g~40.0g,放100mL烧杯中，加小碎瓷片数片，加热驱除乙醇。 5.1.3硬钻、蜜伐类、淀粉软糖等：称取5.00g~10.00g粉碎试样，放人100mL小烧杯中，加水 30mL,温热溶解 若试样溶液pH值较高，用柠檬酸溶液调pH值到6左右。 5.1.4巧克力豆及着色衣制品：称取5.00g~10.00,放入100mL小烧杯中，用水反复洗涤色素 到试样无色素为止，合并色素漂洗液为试样溶液， 5.2色素提取 5.2.1聚酰胺吸附法：试样溶液加柠棕酸溶液调pH值到6，加热至60℃，将1g聚酰胺粉加少许水两 成粥状，倒人试样溶液中，搅拌片刻，以G3垂融漏斗抽滤，用60℃pH=4的水洗涤3次一5次，然后用 甲醇-甲酸混合溶液洗涤3次~5次（含赤裤红的试样用5.2.2法处理），再用水洗至中性，用乙醇-氨水 水混合溶被解吸3次~5次，每次5mL,收解吸液，加乙酸中和，蒸发至近干，加水溶解，定容至5mL 经0.5m滤膜过滤，取10L进高效液相色谱仪。 5.2.2液-液分配法（适用于含赤藓红的试样）：将制备好的试样溶液放入分液漏斗中，加2L盐酸、三 正辛蔽正丁醇溶液(5%)10mL~20mL,振摇提取，分取有机相，重复提取至有机相无色，合并有机相， 用饱和破酸钠溶液洗2次，每次10mL,分取有机相，放蒸发皿中，水裕加热浓缩至10mL,转移至分 漏斗中，加60mL正已烷，混匀，加氨水提取2次~3次，每次5mL,合并氨水溶液层（含水溶性酸性色 素)，用正已烷洗2次，氨水层加乙酸调成中性，水浴加热蒸发至近干，加水定容至5mL。经就聪 0.45m过滤，取10L进高效液相色谱仪 5.3高效液相色谱参考桌件 5.3.1柱：YWG-C.104m不锈钢柱4.6mm(i.d)×250mm. 5.3.2流动相：甲醇：乙酸铵溶液(pH=4,0.02mol/L). 5.3.3 梯度洗脱：甲醇：20%35%，3%/amin,35%98%，9%/min,98%继续6min 5.3.4流速：lmL/min. 5.3.5紫外检测器，254nm波长， 5.4测定 取相同体积样液和合成着色剂标准使用液分别注入高教液相色谱仪，根据保留时间定性，外标蜂面 积法定量。 5.5结果计算 试样中着色剂的含盘按式(1)进行计算。 式中： X一试样中着色剂的含量，单位为克每千克(g/kg)； A—样液中着色剂的质盘，单位为微克(g): 进样体积，单位为意升(mL) 试样稀释总体积，单位为毫升(mL), 试样质量，单位为克(g)。 计算结果保留两位有效数字。 278
GB/T5009.35-2003 5.6精密度 在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的10%， 5.7其他 - 图1八种着色剂色谥分离图 第二法薄层色谱法 6原理 水溶性酸性合成者色剂在酸性条件下被聚酰胺吸附，而在碱性条件下解吸附，再用纸色谐法或薄层 色法进行分离后，与标准比较定性，定盘 最低检出量为50g。点样量为1L时，检出浓度约为50mg/kg 7试剂 ,7.1石油醚：沸程60℃90℃. 7.2甲醇。 7.3聚酰胺粉（尼龙6）：200目. 7.4硅胶G 7.5酸：(1+10) 6甲 酸溶 ：(6+4)。 77氢化销溶(60gLD。 7.8海砂：先用盐酸(1+10)煮沸15min,用水洗至中性，再用氢氧化钠溶液(50g/L)煮沸15min,用 水洗至中性，再于105℃干燥，贮于具玻璃塞的瓶中，备用。 7.9乙醇(50%). 7.10乙醇-氨溶液：取1mL氨水，加乙醇(70%)至100mL. 总
GB/T5009.35-2003 7.11pH6的水：用柠檬酸溶液(20%)调节至pH6。 7.12盐酸(1+10) 7.13 柠檬酸溶液(200g/L) 7.14 钨酸钠溶液(100g/L)。 7.15碎瓷片：处理方法同7.8。 716居开剂加下， 7.16.1正丁醇-无水乙醇-氨水(1%)(6+2+3)：供纸色谱用. 7.16.2 正丁醇晚啶氨水(1%)(6+3+4)：供纸色谱用 7.16.3 甲乙码丙码水(7+3+3)：供纸色谱用。 7.16.4甲醇-乙二胺-氨水(10+3+2)：供薄层色谱用。 7.16.5甲醇-氨水-乙醇(5+1十10)：供莎层色游用. 7.16.6柠檬酸钠溶液(25g/L)-氨水-乙醇(8+1+2)：供薄层色谱用 7.17 合成着色剂标准溶液：按3.16方法，分别配制着色剂的标准溶液浓度为每毫升相当于1.0mg。 7.18着色剂标准使用液：临用时吸取色素标准溶液各5.0mI,分别置于50mL容量瓶中，加pH6的 水稀释至刻度。此溶液每毫升相当于0.10mg着色剂。 8仪器 8.1可见分光光度计 8.2微量注射器或血色素吸管。 8.3展开楷，25cm×6cm×4cm。 84层析缸。 8,5滤纸：中速涉纸，纸色谱用 8.6薄层板： cmX20cm。 8.7电吹风机 8.8水泵. 9分析步骤 9.1试样处 9.1.1果味水、果子瑶、汽水：称取50.0g试样于100mL烧杯中。汽水需加热驱除二氧化碳。 9.1.2配制酒：称取100.0g试样于100mL烧杯中.加碎瓷片数块，加热驱除乙醇。 9.1.3硬糖，蜜饯类、淀粉软糖：称取5.D0g或10.0g粉碎的试样，加30mL水，温热溶解，若样液pH 值较高，用柠棕酸溶液(200g/L,)调至pH4左右 9.1.4奶糖：称取10.0g粉碎均匀的试样，加30ml乙醇-氨溶液溶解，登水浴上浓缩至约20mL,立 即用碗酸溶液(1+10)调至微酸性，再加1.0mL疏酸(1+10)，加1mL钨酸钠溶液(100g/1),使蛋白 质沉淀，过滤，用少量水洗涤，收集滤液。 9.15蛋糕类.称取10.0g粉碎均匀的试样，加海砂少许，混匀，用热风吹干用品（用手檬已干操即 可)，加人30mL石油醚搅拌 放置片刻，倾出石袖酷，如此重复处理三次，以除去脂肪，吹干后研细，全 郎倒人G3垂融漏斗或普通漏斗中，用乙醇-红溶液提取色素，直至若色剂全部提完，以下按9.1,4白“置 水裕上浓缩至约20mL.”起依法搡作。 9.2吸附分离 将处理后所得的溶液加热至70℃，加入0.5g~1.0g聚酰胺粉充分搅拌，用柠棕酸溶液(200g/1) 调pH至4，使着色剂完全被吸附，如溶液还有 ,可以 些聚酰胺 ,将吸附着色剂的聚酰 全部转入G3垂盈斗中过滤（如用G3垂融漏斗过滤可以用水泵慢慢地抽滤）。用pH4的70C水反复 280
GB/T5009.35-2003 洗涤，每次20mL,边洗边搅拌，若含有天然着色剂。再用甲醇-甲酸溶液洗涤1次一3次，每次20mL, 至洗液无色为止。再用70℃水多次洗涤至流出的 液为叶 性 洗涤过程中应充分搅拌。然后用乙醇 红溶液分次解吸全部卷色剂，收集全部解吸液，于水浴上驱氨.如果为单色，则用水准确稀释至50L 用分光光度法进行测定，如果为多种着色剂混合薇，则进行纸色谐或薄层色谱法分离后测定，即将上述 溶液置水浴上浓缩至2mlL.后移人5ml.容量瓶中，用50%乙称洗涤容器，洗液并人容量瓶中并稀释至 刻度， 9.3定性 9.3.1纸色谱 取色谱用纸，在距底边2cm的起始线上分别点3L一104L试样溶液，1L一2rL者色剂标准溶 液，挂于分别盛有7.161,7.16.2的展开剂的层析缸中，用上行法展开，待溶剂前沿展至15cm处，将德 纸取出于空气中晾干，与标准斑比较定性 也可取0.5mL样液，在起始线上从左到右点成条状，纸的左边点着色剂标准溶液，依法展开，晾干 后先定性后再供定量用。靛蓝在碱性条件下易褪色，可用7.16.3展开剂. 9.3.2薄层色谱 93.2.1 薄层板的制备 称取1.6g聚酰胶粉、0.4g可溶性淀粉及2g硅胶G,登于合适的研钵中，加15ml.水研匀后，立 即置涂布器中铺成厚度为0.3mm的板。在室温晾干后，于80℃干燥1h,置干燥器中备用 9.3.2.2点样 离板底边 2cm处将0.5mL样液从左到右点成与底边平行的条状，板的左边点2L色素标准 溶液。 9.3.2.3展开 苋菜红与胭脂红用7.16.4展开剂，靛蓝与亮蓝用7.16.5展开剂，柠楼黄与其他着色剂用7.16.6 展开剂。取适量展开剂倒人展开柚中，将薄层板放人展开，待着色剂明显分开后取出，隙干，与标准爽比 较，如R相同即为同一色素。 9.4定量 9.4.1试样圆定 将纸色谱的条状色斑下，用少量热水洗涤数次，洗液移入10mL比色管中，并加水稀释至刻度 作比色测定用 将薄层色谱的条状色斑包括有扩散的部分，分别用刮刀刮下，移入漏斗中，用乙醇-氨溶液解吸着色 剂，少量反复多次至解吸液于蒸发皿中，于水浴上挥去氨，移人10mL此色管中，加水至刻度，作比 色用。 94.2标准曲线制备 分别吸取0,0.5、1.0,2.0、3.0、4.0mL胭脂红、苋菜红、柠棕黄、日落黄色素标准使用溶液，或0 0.2,0.4.0.6,0.8、1.0ml.亮蓝、靛蓝色素标准使用溶液，分别置于10mL比色管中，各加水稀释至 刻度。 上述试样与标准管分别用1cm比色杯，以零管测节零点，于一定波长下（服脂红510nm,苑莱红 520nm,柠檬黄430nm,日落黄482nm,亮蓝627nm,靛蓝620nm),测定吸光度，分别绘制标准曲线比 较或与标准系列目测比较 9.5结果计算 试样中着色剂的含量按式(2)进行计算 X而 281
GB/T5009.35-2003 式中！ -试样中着色剂的含量，单位为克每千克(g/kg) A 测定用样液中色素的质量，单位为毫克(mg): 试样质量或体积，单位为克或毫升（仪或L)； V,一试样解吸后总体积，单位为毫升(mL), V2一样被点板（纸）体积，单位为度升(mL)」 计算结果保留两位有效数字 第三法示波极谱法 10原理 食品中的合成者色剂，在特定的缓冲溶液中，在滴汞电极上可产生敏感的极谱波，波高与若色剂的 浓度成正比，当食品中存在一种或两种以上互不影响测定的着色剂时，可用其进行定性定量分析。 11试剂 11,1底液A:磷酸盐缓冲液（常用于红色和黄色复合色素），可作苋菜红、胭脂红、日落黄、柠檬黄以及 蓝着色剂的测定底液 称取13.6g无水磷酸二氢钾(KHP0,)和14.1g无水磷酸氢二钠(Na,HPO,)[或35.6g含结品 水的群酸氢二钠(Na:HPO,·12H,O)门及10.0g氮化钠，加水溶解后稀释至1L. 11,2底液B:乙酸盐缓冲液（常用于绿色和蓝色复合色素），可作靛蓝、亮蓝、柠檬黄、日落黄着色剂的 测定底液， 取40.0mL冰乙酸，加水约400L,加人20.0g无水乙酸钠，溶解后加水稀释至1L。 11.3 柠檬酸溶液：200g/L, 11.4乙醇-氨溶液：取】mL浓氢水，加乙醇(70%)至100m 11,5着色剂标准溶液：准确称取按其纯度折算为100%质量的人工合成着色剂0.100g,溶解后置于 10mL容量瓶中，加水至刻度，此溶液1mL含1,0mg着色剂， 11.6着色剂标准使用溶液：吸取着色剂标准溶液1.00mL,置于100mL容量瓶中，加水至刻度.此 溶液1mL含10.0g着色剂。 12仪器 12.1微机极谱仪 12.2常用玻璃仪器 13分析步骤 13.1试样处理 13.1.1饮料和酒类：取样10.0mL~25.0mL,加热驱除二氧化碳和乙醇，冷却后用200g/L氢氧化 钠和盐酸(1十1)调至中性，然后加燕馏水至原体积 13.1.2 层色素类：取样5,0g一10,0g,用燕馏水反复漂洗直至色素完全被洗脱。合并洗脱液并定 容至一定体积。 13.1.3水果糖和果冻类：取样5.0g,用水加热溶解，冷却后定容至25.0mL。 13.1.4奶油类：取样5.0g于50mL离心管中，用石油醚洗涤 三次，每次约20mL~30mL,用玻璃 搅匀，离心，弃上清液 ,低温挥去残留的石油醚后用 醇-氨溶液溶解并定容至25.0mL,离心，取上清 液一定量水浴蒸干，用适量的水加热溶解色素，用水洗人10mL容量瓶并定容。 282
GB/T5009.35-2003 13.1.5奶精类：取样5.0g溶于乙醇氢溶液至25.0mL,离心.取上清液20.0mL,加水20mL,加 挥去约20mL,冷却，用200g/L柠檬酸调至pH4,加入200目聚酰胺粉0.5g~1.0g,充分搅拌使色素 完全吸附后，用30m1一40mI酸性水洗人50mL离心管，离心，弃上层液体。沉淀物反复用酸性水洗 涤3次一4次后，用适量酸性水洗入含滤纸的漏斗中。用乙醇氨溶液洗股色素，将洗脱液水浴蒸干，用 活量的水加热溶解色素，用水洗人10mL容量瓶并定容 13.2测定 13.2.1极谱条件：滴汞电极，一阶导数，三电极制，扫描速度250mV/s,底液A的初始扫描电位为 一0.2V,终止扫描电位为一0.9V.参考峥电位为苑莱红一0.42V、日落黄-0.50V、柠檬黄 一0.56V、取脂红一0.69V、蓝一0.29V底液B的初始扫描中位为0.0V,终止扫描由位为 一1.0V。参考锋电位（溶液、底液偏酸使出峰电位正移，偏碱使出峰电位负移）：靛蓝一0.16V、日落黄 -0.32V,柠檬黄-0.45V、亮蓝-0.80V. 13.2.2标准曲线：吸取著色剂标准使用溶液0,0.50,1.00,2.00,3.00,4.00mL分别于10mL比色管 中，加人5.00ml.底液，用水定容至10.0mL(浓度分别为0,0.50,1.00,2.00,3.00,4.00g/mL),混 匀后于微机极谐仪上测定。0为试剂空白溶液。 13.2.3试样测定：取试样处理液1.00ml,或一定量（复合色素峰电位较近时，尽量取稀溶液），加底液 5.00mL,加水至10.0mL,播匀后与标准系列溶被同时测定 14计算 试样中着色剂的含量按式(3)进行计算， X m,00x100 .(3) 式中： 试样中着色剂的含量，单位为克每开或克每千克(g/L或g/kg): c,一试样测定液中着色剂的含量，单位为微克每毫升(g/m1)； —试样取样质量或体积，单位为克或意升(g或mL), V,一试样测定液中试样处理液的体积，单位为毫升(mL): 一试样稀释后的总体积，单位为毫升(mL)。 计算结果保留两位有效数学 15精密度 在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的10⅓. 283