石河子大学医学院 讲稿 课程名称 临床检验基础 任课班级 检验2009级本科(1) 任课教师 刘旻 教学职称 助教 检验系临床检验基础教研室 二O一一 一一二O一二学年第二学期
石河子大学医学院 讲稿 课程名称 临床检验基础 任课班级 检验 2009 级本科（1） 任课教师 刘旻 教学职称 助教 检验 系 临床检验基础 教研室 二○一一 ——二○一二学年第 二 学期
血液标本的采集、血涂片的制备 标本的采集和处理 1.血液标本的种类全血、血浆和血清。血细胞成分的检查：血清用于大部分临床生 化检查和免疫学检查：血浆也适用于部分临床生化检查，此外，凝血因子测定、游离血红蛋 白测定等必须采用血浆标本。 2.采血部位 (1)毛细血管采血：采血部位：指端、拇趾或足跟、烧伤者选择无炎症或水肿部位。 采血深度适当，切忌用力挤压。 (2)静脉采血：需血量较多时采用。 (3)动脉采血：用于血气分析时。股动脉或挠动采血。采得的血标本必须与空气隔 离，立即送检。 3.采血时间 (1)空腹采血：是指在禁食8小时后空腹采取的标本，一般是在晨起早餐前采血，常 用于临床生化检查。其优点是可避免饮食成分和白天生理活动对检验结果的影响，同时因每 次均在固定时间来血也便于对照比较。 (2)特定时间采血：激素、葡萄糖等的测定。检查微丝蚴需在半夜唤醒后来血。此外， 甘油三酯、维生素D等还可有季节性变化。进行治疗药物监测时，更需注意采血时药物浓度 的峰值和低谷。 (3)急诊采血：不受时间限制。检验单上应标明采血时间。 4.标本采集后的处理 (1)抗凝剂：采用全血或血浆标本时，充分混匀。常用的抗凝剂有：1)草酸盐：2)构檬 酸钠：3)肝素：4)EDTA (2)及时送检和检测 (3)微生物血标本 实验诊断的临床应用和评价 (一)正确选择实验室检查项目 实验分类：①按诊断价值分为：确定诊断项目、辅助诊断项目和鉴别诊断项目②按 报告方式分为：定性试验、定量试验和半定量试验实验 (二)参考值 1.参考值与正常值的差别 2.参考值的产生及意义 (三)检验质量的保证 1.分析前质控：选择检验项目、病人准备、正确地采集标本、及时送检、和正确地填写 检验申请单。 2.分析中质控：检验人员素质（上岗证）、实验室条件、检测方法和分析仪器、试剂， 室内或室间质量控制。 3.分析后质控：及时报告检验结果：医生综合分析，对检验结果的正确的解释。 (四)影响检验结果的常见因素 1. 操作因素 2. 个体差异人种、民族、性别、年龄、采血时间。 3 检验标本的采集和处理的影响。 4. 药物的影响
血液标本的采集、血涂片的制备 标本的采集和处理 1．血液标本的种类 全血、血浆和血清。血细胞成分的检查；血清用于大部分临床生 化检查和免疫学检查；血浆也适用于部分临床生化检查，此外，凝血因子测定、游离血红蛋 白测定等必须采用血浆标本。 2．采血部位 （l）毛细血管采血：采血部位：指端、拇趾或足跟、烧伤者选择无炎症或水肿部位。 采血深度适当，切忌用力挤压。 （2）静脉采血：需血量较多时采用。 （3）动脉采血：用于血气分析时。股动脉或挠动采血。采得的血标本必须与空气隔 离，立即送检。 3．采血时间 （1）空腹采血：是指在禁食 8 小时后空腹采取的标本，一般是在晨起早餐前采血，常 用于临床生化检查。其优点是可避免饮食成分和白天生理活动对检验结果的影响，同时因每 次均在固定时间来血也便于对照比较。 （2）特定时间采血：激素、葡萄糖等的测定。检查微丝蚴需在半夜唤醒后来血。此外， 甘油三酯、维生素 D 等还可有季节性变化。进行治疗药物监测时，更需注意采血时药物浓度 的峰值和低谷。 （3）急诊采血：不受时间限制。检验单上应标明采血时间。 4．标本采集后的处理 （l）抗凝剂：采用全血或血浆标本时，充分混匀。常用的抗凝剂有：1）草酸盐： 2）构檬 酸钠： 3）肝素： 4）EDTA （2）及时送检和检测 （3）微生物血标本 实验诊断的临床应用和评价 （－）正确选择实验室检查项目 实验分类：①按诊断价值分为：确定诊断项目、辅助诊断项目和鉴别诊断项目②按 报告方式分为：定性试验、定量试验和半定量试验实验 （二）参考值 １．参考值与正常值的差别 ２．参考值的产生及意义 （三）检验质量的保证 1．分析前质控：选择检验项目、病人准备、正确地采集标本、及时送检、和正确地填写 检验申请单。 2．分析中质控：检验人员素质（上岗证）、实验室条件、检测方法和分析仪器、试剂， 室内或室间质量控制。 3．分析后质控：及时报告检验结果；医生综合分析，对检验结果的正确的解释。 （四）影响检验结果的常见因素 1． 操作因素 2． 个体差异 人种、民族、性别、年龄、采血时间。 3． 检验标本的采集和处理的影响。 4． 药物的影响
(五)检验结果解释 1.检验结果诊断的局限性 2.结合临床资料综合分析的重要性 血涂片的制作及白细胞分类计数 染色原理 血涂片经Wright染色后进行分类计数。细胞受色包括物理吸附与化学亲和作用。酸性染料 伊红与细胞中的碱性物质如血红蛋白，嗜酸性颗粒结合，使其染成红色：碱性染料美蓝与细 胞中的酸性物质如核染色质、嗜碱性颗粒、血小板及富含核蛋白的胞质结合，使其染成兰色。 介于两者之间的中性物质如白细胞染色质、中性粒细胞颗粒及血小板颗粒区染成紫色。由于 不同细胞的成分不同，对两种染料结合的多少也不同，而使各种细胞呈现出各自的染色特点 缓冲液作用：染色对氢离子浓度是十分敏感的，据观察pH值的改变，可使蛋白质与染料形 成的化合物重新离解。缓冲液须保持一定的pH使染色稳定，PBS的pH一般在6.4-68， 偏陆性热料可与绥中液中游基記中和作用，偏移性边料叫与缓中液中的陆其起中和作用，使 pH恒定。 制备血涂片 推片：取外周血一滴与载玻片右端，左手持载玻片，右手持推玻片，从血滴前方向后移动 接触血滴，使其沿推片下缘散开。然后以平稳的速度将血液向前推进，注意推片与载玻片 之间保持约30度的平面夹角，血液在载玻片上形成一舌形，边缘整齐，厚薄适宜头体尾分 明的血膜。 干燥：手持载玻片末端，迅速挥动玻片，使之在空气中干燥。 标记：用记号笔在载玻片右上角标记被检者编号 染色 ①准备：血膜干透后，用特制蜡笔在血片两端划线，以防染色时染液外溢。加I液（瑞氏染 液)：在涂片上加数滴，以染液覆盖整个血膜为度。静置0.5-lmin。加Ⅱ液（缓冲液）：滴 加约两倍于I液的的量，用吸球吹气混匀，染色5-l0min,注意防止干涸。 ②染色效果观察：将血涂片小心移至显微镜物台上。用低倍镜观察体尾交界处血细胞平铺的 部分，如红细胞呈粉红色，各类白细胞核、胞质着色清晰，说明染色恰到好处，可进行冲洗。 ③冲洗不要先倒掉染液，平持血涂片用流水缓缓冲洗干净。 ④干燥直立血涂片，使其自然干燥。 注意事项： 1.血膜厚薄要适宜 2.染色时切记染液干酒 3使用的染液量，染液、磷酸盐缓冲液比例，染色时间长短，要依具体情况而定 计数方法： 通过镜检进行分类 用低倍镜检视全片，选择细胞分布均匀着色良好体、尾交界处加香柏油，用油镜沿弓字 形轨道向尾部检视，分别计数各种白细胞，计数100个求得各类白细胞的出现率 注意事项 1.分类时要有秩序地、循一定方向顺序地连续进行，既不重复亦不遗漏，避免主观选择视 野。 2.白细胞总数在(3.0~15.0)×109L之间者，分类计数100个细胞。总数在15.0×109/1 以上时，应计数200个白细胞，而总数低于3.0×109L时，则应选用2张血涂片计数50 100个白细胞
（五）检验结果解释 1. 检验结果诊断的局限性 2. 结合临床资料综合分析的重要性 血涂片的制作及白细胞分类计数 染色原理 血涂片经 Wright 染色后进行分类计数。细胞受色包括物理吸附与化学亲和作用。酸性染料 伊红与细胞中的碱性物质如血红蛋白，嗜酸性颗粒结合，使其染成红色；碱性染料美蓝与细 胞中的酸性物质如核染色质、嗜碱性颗粒、血小板及富含核蛋白的胞质结合，使其染成兰色。 介于两者之间的中性物质如白细胞染色质、中性粒细胞颗粒及血小板颗粒区染成紫色。由于 不同细胞的成分不同，对两种染料结合的多少也不同，而使各种细胞呈现出各自的染色特点。 缓冲液作用：染色对氢离子浓度是十分敏感的，据观察 pH 值的改变，可使蛋白质与染料形 成的化合物重新离解。缓冲液须保持 一定的 pH 使染色稳定,PBS 的 pH 一般在 6.4-6.8 ， 偏碱性染料可与缓冲液中酸基起中和作用，偏酸性染料则与缓冲液中的碱基起中和作用，使 pH 恒定。 制备血涂片 推片：取外周血一滴与载玻片右端，左手持载玻片，右手持推玻片，从血滴前方向后移动， 接触血滴，使其沿推片下缘散开。 然后以平稳的速度将血液向前推进，注意推片与载玻片 之间保持约 30 度的平面夹角，血液在载玻片上形成一舌形，边缘整齐，厚薄适宜头体尾分 明的血膜。 干燥：手持载玻片末端，迅速挥动玻片，使之在空气中干燥。 标记：用记号笔在载玻片右上角标记被检者编号 染色 ①准备：血膜干透后，用特制蜡笔在血片两端划线，以防染色时染液外溢。加Ⅰ液（瑞氏染 液）：在涂片上加数滴，以染液覆盖整个血膜为度。静置 0.5-1min。加Ⅱ液（缓冲液）：滴 加约两倍于Ⅰ液的的量，用吸球吹气混匀，染色 5-10min，注意防止干涸。 ②染色效果观察：将血涂片小心移至显微镜物台上。用低倍镜观察体尾交界处血细胞平铺的 部分，如红细胞呈粉红色，各类白细胞核、胞质着色清晰，说明染色恰到好处，可进行冲洗。 ③冲洗 不要先倒掉染液，平持血涂片用流水缓缓冲洗干净。 ④干燥 直立血涂片，使其自然干燥。 注意事项： 1.血膜厚薄要适宜 2.染色时切记染液干涸 3.使用的染液量，染液、磷酸盐缓冲液比例，染色时间长短，要依具体情况而定 计数方法： 通过镜检进行分类 用低倍镜检视全片，选择细胞分布均匀着色良好体、尾交界处加香柏油，用油镜沿弓字 形轨道向尾部检视，分别计数各种白细胞，计数 100 个求得各类白细胞的出现率 注意事项 1．分类时要有秩序地、循一定方向顺序地连续进行，既不重复亦不遗漏，避免主观选择视 野。 2．白细胞总数在（3.0～15.0）×109/L 之间者，分类计数 100 个细胞。总数在 15.0×109/L 以上时，应计数 200 个白细胞，而总数低于 3.0×109/L 时，则应选用 2 张血涂片计数 50～ 100 个白细胞
3.分类计数的同时，应注意白细胞、红细胞、血小板的形态改变以及有无血液寄生虫 循环血液中的白细胞包括： 1、中性粒细胞 2、嗜酸性粒细胞 3、嗜碱性粒细胞 4、淋巴细胞 5、单核细胞 参考值：白细胞数： 成人(4~10)×109/L 新生儿(15~20)×109/1 中性粒细啊 N 050-070 林巴细狗 L 0.200.40 单核细胞 0.03-0.08 嗜酸性粒细胞 E 0005005 塔威性粒细胞 B 00.01 临床意义 中性粒细胞 1.增高 生理性 ①胎儿、新生儿②妊娠后期③分娩和产伤④剧烈、运动、劳动⑤严寒、暴 热⑥淋浴、狗餐后 病理性 ①急性感染 ②严重组织损伤③急性大出血、溶血④急性中毒⑤白血病、 恶性种瘤 2减少（白细胞总数低干4X109/L称为白细胞减少） ①某些病毒、G杆菌感染②某些血液病③自身免疫性疾病(SLE)④某些理化损伤⑤ 脾功能亢进 嗜酸性粒细胞 1.增高①变态反应性疾病②寄生虫病③某些皮肤病④某些传染病（猩红热）⑤某些血 液病⑥某些恶性种瘤（何杰金、肺Ca) 2.减少①长期使用皮质素②急性传染病 转城性粒细阳 1增高①慢性粒细胞白血病②嗜碱性粒细胞白血病③转移瘤④骨髓纤维化症 2.减少无意义 淋巴细胞 1增高 生理性：小儿生后4-6天，4-6岁 病理性：①病毒感染②慢性感染③淋巴细胞白血病、淋巴瘤④急性传染病恢复期⑤组 织移植后的排斥反应 2.减少 病理性：①射线照射②肾上腺皮质激素③免疫缺陷 单核细胞 1.增高： 生理性：婴幼儿、儿童高于成人 病理性：①某些感染②血液病③急性传染病和急性感染恢复期 2.减小： 无意义 中性杆状核粒细胞：圆形，直径约10一15μm。胞浆淡红色，胞浆内有多量紫红色细小颗粒
3.分类计数的同时，应注意白细胞、红细胞、血小板的形态改变以及有无血液寄生虫 循环血液中的白细胞包括： 1、中性粒细胞 2、嗜酸性粒细胞 3、嗜碱性粒细胞 4、淋巴细胞 5、单核细胞 参考值：白细胞数： 成人（4～10）×109／L 新生儿(15～20)×109／L 中性粒细胞 N 0.50~0.70 淋巴细胞 L 0.20~0.40 单核细胞 M 0.03~0.08 嗜酸性粒细胞 E 0.005~0.05 嗜碱性粒细胞 B 0~0.01 临床意义 中性粒细胞 1.增高 生理性 ①胎儿、新生儿 ②妊娠后期 ③分娩和产伤 ④剧烈、运动、劳动 ⑤严寒、暴 热 ⑥淋浴、饱餐后 病理性 ①急性感染 ②严重组织损伤 ③急性大出血、溶血 ④急性中毒 ⑤白血病、 恶性肿瘤 2.减少（白细胞总数低于 4×109 ／L 称为白细胞减少 ） ①某些病毒、G-杆菌感染 ②某些血液病 ③自身免疫性疾病（SLE）④某些理化损伤 ⑤ 脾功能亢进 嗜酸性粒细胞 1.增高 ①变态反应性疾病 ②寄生虫病 ③某些皮肤病 ④某些传染病（猩 红热）⑤某些血 液病 ⑥某些恶性肿瘤（何杰金、肺 Ca） 2.减少 ①长期使用皮质素②急性传染病 嗜碱性粒细胞 1.增高 ① 慢性粒细胞白血病 ② 嗜碱性粒细胞白血病 ③ 转移瘤 ④ 骨髓纤维化症 2.减少 无意义 淋巴细胞 1. 增高 生理性：小儿生后 4-6 天，4-6 岁 病理性：①病毒感染 ②慢性感染 ③淋巴细胞白血病、淋巴瘤 ④急性传染病恢复期 ⑤组 织移植后的排斥反应 2.减少 病理性：①射线照射②肾上腺皮质激素③免疫缺陷 单核细胞 1.增高： 生理性：婴幼儿、儿童高于成人 病理性：①某些感染②血液病③急性传染病和急性感染恢复期 2.减小：无意义。 中性杆状核粒细胞：圆形，直径约 10—15μm。胞浆淡红色，胞浆内有多量紫红色细小颗粒
(染色不佳时则看不清楚)。核染成深紫色，其形状多样，可呈马蹄形，带形或S形。 中性杆状核粒细胞 中性分叶核粒细脂 中性分叶核粒细胞：圆形，直径约10一15μm,核呈分叶状，在叶之间有细丝相连的或完全 断开或互相重叠.浆内可见特异性颗粒.常分2.5叶，三叶以上多见。 嗜酸性白细胞：圆形，大小，形态与嗜中性白细胞大体相似，唯胞浆内含有粗大的橙红色颗 粒，核多数为两叶。 嗜酸性粒细胞 嗜碱性白细胞：圆形，大小、形态与嗜中性白细胞相似，但胞浆内含有粗大的深蓝色颗粒， 常遮盖在核上。核分叶不明显。 淋巴细胞：分大小两种，小淋巴细胞圆形或椭圆形，直径约7一10μm,核染成深紫色，圆 形或肾形。胞浆很少，常仅呈一小片月牙状，染成蓝色。大淋巴细胞常呈椭圆形，直径约 12一15μm,核圆形或肾形。胞浆相对较多，染成天蓝色，在胞浆与核之间有淡染带。有时 内含少数紫红色大颗粒
(染色不佳时则看不清楚)。核染成深紫色，其形状多样，可呈马蹄形，带形或 S 形。 中性分叶核粒细胞：圆形，直径约 10—15μm，核呈分叶状，在叶之间有细丝相连的或完全 断开或互相重叠．浆内可见特异性颗粒．常分２-５叶，三叶以上多见。 嗜酸性白细胞：圆形，大小，形态与嗜中性白细胞大体相似，唯胞浆内含有粗大的橙红色颗 粒，核多数为两叶。 嗜碱性白细胞：圆形，大小、形态与嗜中性白细胞相似，但胞浆内含有粗大的深蓝色颗粒， 常遮盖在核上。核分叶不明显。 淋巴细胞：分大小两种，小淋巴细胞圆形或椭圆形，直径约 7—10μm，核染成深紫色，圆 形或肾形。胞浆很少，常仅呈一小片月牙状，染成蓝色。大淋巴细胞常呈椭圆形，直径约 12—15μm，核圆形或肾形。胞浆相对较多，染成天蓝色，在胞浆与核之间有淡染带。有时 内含少数紫红色大颗粒
大淋巴细胞 小淋巴细胞 淋巴细胞 单核细胞。是外周血液中最大的细胞，直径约为12一20μm。核染成紫色，其染色质疏松纤 细，核形不规则，呈肾形，马蹄形，多角形，折叠状等。胞浆较多，染成浅灰蓝色，边缘不 规则可呈伪足突起，胞浆中有无数细小散在的淡红色小颗粒 牛鲍计数板的使用，白细胞计数 改良牛鲍计数板的使用 原理 一定倍数稀释的血液或体液，混匀后滴入具有固定体积和精密分划刻度的血细胞计数板 中，在显微镜下对所选择方格中的细胞进行计数，再乘以稀释倍数，即可换算成单位体 积内的细胞数。 牛鲍计数板结构 改良牛鲍计数板为优质厚玻璃制成。每块计数板由“H”型凹槽分为两个同样的计数池 计数池两侧各有一条支持堤，比计数池平面高出0.1mm。将特制的专用盖玻片覆盖其上， 形成高0.100mm的计数池。计数池长、宽各3.00mm,平均分为9个大格，每个大格面 积为1.00mm2,容积为0.1mm3(μ1D。在这9个大格中，中央大方格用双线分成25个 中方格，其中位于正中及四角的这五个中方格是红细胞和血小板计数区。每个中方格又 用单线分为16个小方格，便于计数。位于四角的四个大方格是白细胞计数区，它们分
单核细胞。是外周血液中最大的细胞，直径约为 12—20μm。核染成紫色，其染色质疏松纤 细，核形不规则，呈肾形，马蹄形，多角形，折叠状等。胞浆较多，染成浅灰蓝色，边缘不 规则可呈伪足突起，胞浆中有无数细小散在的淡红色小颗粒 牛鲍计数板的使用，白细胞计数 改良牛鲍计数板的使用 原理 一定倍数稀释的血液或体液，混匀后滴入具有固定体积和精密分划刻度的血细胞计数板 中，在显微镜下对所选择方格中的细胞进行计数，再乘以稀释倍数，即可换算成单位体 积内的细胞数。 牛鲍计数板结构 改良牛鲍计数板为优质厚玻璃制成。每块计数板由“H”型凹槽分为两个同样的计数池。 计数池两侧各有一条支持堤，比计数池平面高出 0.1mm。将特制的专用盖玻片覆盖其上， 形成高 0.100mm 的计数池。计数池长、宽各 3.00mm，平均分为 9 个大格，每个大格面 积为 1.00mm2，容积为 0.1mm3（μl）。在这 9 个大格中，中央大方格用双线分成 25 个 中方格，其中位于正中及四角的这五个中方格是红细胞和血小板计数区。每个中方格又 用单线分为 16 个小方格，便于计数。位于四角的四个大方格是白细胞计数区，它们分
别用单线划分为16个中方格，便于计数。 4 1,计数板2.计数室与玻片的距离为 0,1毫米3.盖玻片支柱4.盖玻片 操作步骤 ①稀释血液：取试管一支，标明A,加白细胞稀释液0.38ml,加抗凝血20μ1，混匀备 用：另取试管一只，标明B,加红细胞稀释液2ml,加抗凝血10μl,混匀备用。 ②准备计数盘：用纱布拭净血细胞计数板和盖玻片，采用推式法从计数板下缘向前瓶推 盖玻片，将其盖在计数池上。 ③充池：充分混匀A液，用微量吸管或小玻璃棒将稀释血液在计数板与盖玻片交界处滴 下，液体沿间隙充满计数池：再取B液，以同样方法在另一侧计数板与盖玻片交界处滴 下。充液量以液体恰好充满计数池为宜，决不可过多、过少或有气泡，否则应重新操作。 ④静置：计数盘充液后应于桌面静置2~3min,待细胞下沉。 显微镜计数：先用低倍镜观察整个计数盘结构（大、中、小格）及特征，同时观察血细 胞分布是否均匀，如严重不均，应重新充池。 在充A液的计数池观察白细胞计数范围，在充B液的计数池观察红细胞计数范围。计 数时需循一定方向逐格进行，以免重复或遗漏。对压线细胞采用数左不数右，数上不数 下的原则。计录所数五个中方格的红细胞数和四个大方格的白细胞数X1和X1'。重复 步骤2~5，计录X2和X2',算出两次计数的均值X和X。 注意事项 ①改良牛鲍计数板在启用前和用后每隔一年都要鉴定一次，以防不合格或磨损而影响计 数结果的准确性。 ②计数板和盖玻片如使用中污染血液，用后应依次用95%乙醇、蒸馏水棉球擦拭，最 后用清洁纱布擦净。千万勿用粗糙织物擦拭，以免磨损计数板上的刻度。 ③操作中勿让手指接触计数池表面，以防油腻污染，致使充液时起泡。 方法学评价 ①使用血细胞计数板进行细胞计数是医学生最常用的基本功之一。目前虽然有各种自动 化分析方法，但改方法由于经典、方便、实用，仍较广泛应用于临床检验和科研实践中： ②该方法使用中产生技术误差的主要影响因素包括：微量吸管和计数板的质量：采血、 稀释、混合、充池等操作是否规范：计算是否准确：以及细胞的计数量。从统计学的角 度看，细胞计数的固有误差随计数数目的增加而减少。 白细胞计数
别用单线划分为 16 个中方格，便于计数。 操作步骤 ①稀释血液：取试管一支，标明 A，加白细胞稀释液 0.38ml， 加抗凝血 20μl，混匀备 用；另取试管一只，标明 B，加红细胞稀释液 2ml，加抗凝血 10μl，混匀备用。 ②准备计数盘：用纱布拭净血细胞计数板和盖玻片，采用推式法从计数板下缘向前瓶推 盖玻片，将其盖在计数池上。 ③充池：充分混匀 A 液，用微量吸管或小玻璃棒将稀释血液在计数板与盖玻片交界处滴 下，液体沿间隙充满计数池；再取 B 液，以同样方法在另一侧计数板与盖玻片交界处滴 下。充液量以液体恰好充满计数池为宜，决不可过多、过少或有气泡，否则应重新操作。 ④静置：计数盘充液后应于桌面静置 2～3min,待细胞下沉。 显微镜计数：先用低倍镜观察整个计数盘结构（大、中、小格）及特征，同时观察血细 胞分布是否均匀，如严重不均，应重新充池。 在充 A 液的计数池观察白细胞计数范围，在充 B 液的计数池观察红细胞计数范围。计 数时需循一定方向逐格进行，以免重复或遗漏。对压线细胞采用数左不数右，数上不数 下的原则。计录所数五个中方格的红细胞数和四个大方格的白细胞数 X1 和 X1’。重复 步骤 2～5，计录 X2 和 X2’，算出两次计数的均值 X 和 X’。 注意事项 ①改良牛鲍计数板在启用前和用后每隔一年都要鉴定一次，以防不合格或磨损而影响计 数结果的准确性。 ② 计数板和盖玻片如使用中污染血液，用后应依次用 95%乙醇、蒸馏水棉球擦拭，最 后用清洁纱布擦净。千万勿用粗糙织物擦拭，以免磨损计数板上的刻度。 ③ 操作中勿让手指接触计数池表面，以防油腻污染，致使充液时起泡。 方法学评价 ①使用血细胞计数板进行细胞计数是医学生最常用的基本功之一。目前虽然有各种自动 化分析方法，但改方法由于经典、方便、实用，仍较广泛应用于临床检验和科研实践中。 ②该方法使用中产生技术误差的主要影响因素包括：微量吸管和计数板的质量；采血、 稀释、混合、充池等操作是否规范；计算是否准确；以及细胞的计数量。从统计学的角 度看，细胞计数的固有误差随计数数目的增加而减少。 白细胞计数
原理 用白细胞稀释液将全血稀释一定倍数并破坏红细胞，充入血细胞计数池，显微镜下计数一定 体积内的白细胞数，经换算求出每升血液中的白细胞数量。 操作步骤 ①加稀释液取白细胞稀释液0.38ml于小试管中。 ②加血用微量吸管取血20μ1加入白细胞稀释液中，用其上清清洗管腔内残余液2~3次。 ③溶血混匀后室温静置，待液体变为棕褐色，即红细胞被完全破坏。 ④充池混匀后充入计数池，室温平放2~3mi,待细胞下沉后显微镜下计数。 ⑤计数 低倍镜下计数四角4个大方格内白细胞总数。 ⑥计算 WBC=(四个大方格内白细胞数(N)4)×10×20X10=NV20X10L 注意事项 ①采血部位不得有冻疮、水肿、发绀、炎症等，采血时不得过度挤压。 ②白细胞数量过高时，可加大稀释倍数，反之白细胞过低时可计数8个大方格内白细胞数或 加大取血量。 ③白细胞稀释液不能破坏有核红细胞，某些病理情况下外周血出现大量有核红细胞，可使白 细胞计数结果偏高，此时应按下式减去有核红细胞： 实际白细胞L=100/(100+分类100个白细胞过程中所见有核红细胞数)】×校正前白细 胞数。 方法学评价 显微镜计数法是传统的白细胞计数法并用于校准血细胞分析仪。由于此法影响因素较多（如 微量吸管、血细胞计数板、细胞分布情况、以及诸多人为因素)使得其精密度和重复性欠佳】 此法用于校准血细胞分析仪时应在严格规范的条件下（如操作人员的选择、试验多次重复等） 进行，而经校准后的血细胞分析仪在严格质量控制和规范操作步骤条件下，计数的精确性及 准确性较高。 参考值 成人：(4~10)×10L 初生儿：(15~20)×10 6个月~2岁：(11~12)×10/m 临床意义 增高见于： 生理性：新生儿、妊娠末期、分娩期、经期、饭后、剧烈运动后、冷水浴及极 度恐惧与疼痛等。 病理性：(1)急性感染：急性化脓性感染所引起的急性全身性感染、局部炎症，以及一些细 胞感染。(2)组织损伤：手术后急性心肌梗死（塞）。(3)恶性肿瘤及白白病：急性、慢性 粒细胞性白血病，尤以慢性白血病增高最多。各种恶性肿瘤的晚期，如肝癌、胃癌等。(4) 其它：骨髓纤维化、真性红细胞增多症、尿毒症、酸中毒、某些药物中毒、烧伤等。 减少见于：(1)某些感染：细菌感染（如伤感、付伤寒）：病毒感染（如流感、风疹、麻疹）。 (2)某些血液病：再生障碍性贫血、急性粒细胞缺乏症、恶性网状细胞增多症。(3)脾功 能亢进：各种原因所致的脾肿大，如肝硬班替氏综合症。(4)理化因素：放射性物质、X线、 某些抗癌药、解热镇痛药等，可造成白细胞减少
原理 用白细胞稀释液将全血稀释一定倍数并破坏红细胞，充入血细胞计数池，显微镜下计数一定 体积内的白细胞数，经换算求出每升血液中的白细胞数量。 操作步骤 ①加稀释液 取白细胞稀释液 0.38ml 于小试管中。 ②加血 用微量吸管取血 20μl 加入白细胞稀释液中，用其上清清洗管腔内残余液 2～3 次。 ③溶血 混匀后室温静置，待液体变为棕褐色，即红细胞被完全破坏。 ④充池 混匀后充入计数池，室温平放 2～3min，待细胞下沉后显微镜下计数。 ⑤计数 低倍镜下计数四角 4 个大方格内白细胞总数。 ⑥计算 WBC=（四个大方格内白细胞数（N）/4）×10×20×106=N/20×109 /L 注意事项 ①采血部位不得有冻疮、水肿、发绀、炎症等，采血时不得过度挤压。 ②白细胞数量过高时，可加大稀释倍数，反之白细胞过低时可计数 8 个大方格内白细胞数或 加大取血量。 ③白细胞稀释液不能破坏有核红细胞，某些病理情况下外周血出现大量有核红细胞，可使白 细胞计数结果偏高，此时应按下式减去有核红细胞： 实际白细胞/L=[100/（100+分类 100 个白细胞过程中所见有核红细胞数）] ×校正前白细 胞数。 方法学评价 显微镜计数法是传统的白细胞计数法并用于校准血细胞分析仪。由于此法影响因素较多（如 微量吸管、血细胞计数板、细胞分布情况、以及诸多人为因素）使得其精密度和重复性欠佳。 此法用于校准血细胞分析仪时应在严格规范的条件下（如操作人员的选择、试验多次重复等） 进行，而经校准后的血细胞分析仪在严格质量控制和规范操作步骤条件下，计数的精确性及 准确性较高。 参考值 成人：（4～10）×109 /L 初生儿：（15～20）×109 /L 6 个月～2 岁：（11～12）×109 /L 临床意义 增高见于： 生理性：新生儿、妊娠末期、分娩期、经期、饭后、剧烈运动后、冷水浴及极 度恐惧与疼痛等。 病理性：（1）急性感染：急性化脓性感染所引起的急性全身性感染、局部炎症，以及一些细 胞感染。（2）组织损伤：手术后急性心肌梗死（塞）。（3）恶性肿瘤及白白病：急性、慢性 粒细胞性白血病，尤以慢性白血病增高最多。各种恶性肿瘤的晚期，如肝癌、胃癌等。（4） 其它：骨髓纤维化、真性红细胞增多症、尿毒症、酸中毒、某些药物中毒、烧伤等。 减少见于：（1）某些感染：细菌感染（如伤感、付伤寒）；病毒感染（如流感、风疹、麻疹）。 （2）某些血液病：再生障碍性贫血、急性粒细胞缺乏症、恶性网状细胞增多症。（3）脾功 能亢进：各种原因所致的脾肿大，如肝硬班替氏综合症。（4）理化因素：放射性物质、X 线、 某些抗癌药、解热镇痛药等，可造成白细胞减少
血小板计数，血小板粘附试验 血小板计数一般情况下如需判断患者有无出血倾向和有无止血能力，需要做血小板 检查，其中最为常见的是做血小板计数。 (100-300)×109/L。(10-30万/m3) 血小板计数，指单位体积血液中所含的血小板数目。血小板是血液中最小的细胞， 可保护毛细血管的完整性。 全国临检方法学学术会议推荐草酸铵溶解计数方法为首选方法。 血小板计数有助于临床上止血和血栓性疾病的诊断和鉴别诊断 1,血小板增多：当>400x109/儿时为血小板增多，常见于骨髓增生性疾病，例如 原发性血小板增多症、慢性粒细胞白血病、真性红细胞增多症、急性大出血、急性溶 血、恶性肿瘤、感染、缺氧、创伤、骨折等。反应性血小板增多症常见于急慢性炎 症，缺铁性贫血及癌症患者，此类增多一般不超过500×109/L,经治疗后情况改善 血小板数目会很快下降至正常水平。脾切除术后血小板会有明显升高，常高于 600x109几，随后会缓慢下降到正常范围。 2.血小板减少：当<100x109几即为血小板减少 血小板生成减少（见于急性白血病、再生障碍性贫血和急性放射病等） 血小板破坏过多（见于原发性血小板减少性紫癜、脾功能亢进等疾病） 血小板消耗增加（见于弥散性血管内凝血、血栓性血小板减少性紫癜等：家族性 血小板减少如巨大血小板综合征等)。 血小板粘附试验 一、目的与要求： 会血小板粘附试验 一一玻球法。 二、原理 血液接触玻球时血小板会黏附在玻球上，通过检测接触玻球前后血液的血小板数量，可 以了解血小板在体外黏附于物体表面的能力，借以推测血小板的黏附作用。 操作： 1.取静脉血4.5ml,置于含109 mmol/L枸橼酸钠溶液0.5ml的试管中，混匀。 ,立即用微量加样器取抗凝血1.5ml置球形玻璃瓶中，以3r/min速度转动球形玻璃瓶 15mine 3.分别取接触玻球前后抗凝血各1ml,置2个大试管中，均加入19ml109 nmol/L枸橼 酸钠溶液，颠倒混匀三次后静置2小时，取上清夜作血小板计数。 三、结果： 接触前血小板数一接触后血小板数 血小板黏附率(%)= -*100% 接触前血小板数 五生华项实头的难站 空腹血用109mmol/L枸橼酸钠抗凝，血液与抗凝剂之比为9：】 六、临床意义 1粘附率增高：血栓前状态及血栓性疾病如心肌梗死、心绞痛、糖尿病、肾小球肾炎、 妊娠高血压综合征
血小板计数，血小板粘附试验 血小板计数一般情况下如需判断患者有无出血倾向和有无止血能力，需要做血小板 检查，其中最为常见的是做血小板计数。 （100～300）×10^9/L。 (10-30 万/mm3) 血小板计数，指单位体积血液中所含的血小板数目。血小板是血液中最小的细胞， 可保护毛细血管的完整性。 全国临检方法学学术会议推荐草酸铵溶解计数方法为首选方法。 血小板计数有助于临床上止血和血栓性疾病的诊断和鉴别诊断。 1．血小板增多：当>400x109/L 时为血小板增多，常见于骨髓增生性疾病，例如 原发性血小板增多症、慢性粒细胞白血病、真性红细胞增多症、急性大出血、急性溶 血、恶性肿瘤、感染、缺氧、创伤、骨折等。 反应性血小板增多症常见于急慢性炎 症，缺铁性贫血及癌症患者，此类增多一般不超过 500×109/L，经治疗后情况改善， 血小板数目会很快下降至正常水平。脾切除术后血小板会有明显升高，常高于 600x109/L,，随后会缓慢下降到正常范围。 2．血小板减少：当<100x109/L 即为血小板减少， 血小板生成减少（见于急性白血病、再生障碍性贫血和急性放射病等） 血小板破坏过多（见于原发性血小板减少性紫癜、脾功能亢进等疾病） 血小板消耗增加（见于弥散性血管内凝血、血栓性血小板减少性紫癜等；家族性 血小板减少如巨大血小板综合征等）。 血小板粘附试验 一、目的与要求： 会血小板粘附试验——玻球法。 二、原理 血液接触玻球时血小板会黏附在玻球上，通过检测接触玻球前后血液的血小板数量，可 以了解血小板在体外黏附于物体表面的能力，借以推测血小板的黏附作用。 操作： 1. 取静脉血 4.5ml，置于含 109mmol/L 枸橼酸钠溶液 0.5 ml 的试管中，混匀。 2. 立即用微量加样器取抗凝血 1.5ml 置球形玻璃瓶中，以 3r/min 速度转动球形玻璃瓶 15min。 3. 分别取接触玻球前后抗凝血各 1ml，置 2 个大试管中，均加入 19ml109mmol/L 枸橼 酸钠溶液，颠倒混匀三次后静置 2 小时，取上清夜作血小板计数。 三、结果： 接触前血小板数－接触后血小板数 血小板黏附率（%）= ——————————————— * 100% 接触前血小板数 四、参考值：.玻球法：男性 29%～40.8%；女性 34.2%～44.6%。 五、注意事项：（详见实验指导） 空腹血用 109mmol/L 枸橼酸钠抗凝，血液与抗凝剂之比为 9∶1 六、临床意义 1.粘附率增高：血栓前状态及血栓性疾病如心肌梗死、心绞痛、糖尿病、肾小球肾炎、 妊娠高血压综合征
2粘附率减低：血管性血友病、巨大血小板综合征、血小板无力症、尿毒症、肝硬变等， 以及服用阿司匹林、双嘧达莫、保泰松等药物之后。 网织红细胞计数，血沉测定 网织红细胞计数 原理 网织红细胞胞质内残存的少量核蛋白体和核糖核酸等嗜碱性物质，在活体染色时可被煌焦油 蓝染成蓝色网状或颗粒状，可与完全成熟的红细胞区别。 操作步骤 ①加染液于小试管中加入10gL煌焦油蓝生理盐水溶液2滴，再加入新鲜全血2滴，立即 混匀，室温下15-20min。 ②制备涂片取1小滴制成薄血涂片，自然干燥。 ③观察在低倍镜下选择红细胞分布均匀的部位进行观察。 ④计数在油镜下计数至少1000个红细胞中的网织红细胞数 计算 网织红细胞相对数=计算的网织红细胞数/1000 网织红细胞绝对值=红细胞数LX网织红细胞百分数 参考值 相对值成人 0.005~0.015 新生儿0.020~0.060 绝对值 (24~84)×10°L 注意事项 ①检查网织红细胞计数需活体染色，已固定的血标本不适用。 ②网织红细胞计数需制备薄膜片。镜检时若发现油镜视野内的红细胞数≥100应设法缩 小视野。可在目镜处加网格测微计分隔视野计数。否则，计数不准确。 ③温度对染色效果有显著影响。 ④HCT在0.35以下贫血患者的网织红细胞计数结果应进行校正后报告。 红细胞沉降率测定 (estimation of erythrocyte sedimentation rate,ESR) 方法一魏氏法(westergren）
2.粘附率减低：血管性血友病、巨大血小板综合征、血小板无力症、尿毒症、肝硬变等， 以及服用阿司匹林、双嘧达莫、保泰松等药物之后。 网织红细胞计数，血沉测定 网织红细胞计数 原理 网织红细胞胞质内残存的少量核蛋白体和核糖核酸等嗜碱性物质，在活体染色时可被煌焦油 蓝染成蓝色网状或颗粒状，可与完全成熟的红细胞区别。 操作步骤 ①加染液 于小试管中加入 10g/L 煌焦油蓝生理盐水溶液 2 滴，再加入新鲜全血 2 滴，立即 混匀，室温下 15-20min。 ②制备涂片 取 1 小滴制成薄血涂片，自然干燥。 ③观察 在低倍镜下选择红细胞分布均匀的部位进行观察。 ④计数 在油镜下计数至少 1000 个红细胞中的网织红细胞数。 计算 网织红细胞相对数=计算的网织红细胞数/1000 网织红细胞绝对值=红细胞数/L×网织红细胞百分数 参考值 相对值 成人 0.005～0.015 新生儿 0.020～0.060 绝对值 （24～84）×109 /L 注意事项 ①检查网织红细胞计数需活体染色，已固定的血标本不适用。 ②网织红细胞计数需制备薄膜片。镜检时若发现油镜视野内的红细胞数≥100 应设法缩 小视野。可在目镜处加网格测微计分隔视野计数。否则，计数不准确。 ③温度对染色效果有显著影响。 ④HCT 在 0.35 以下贫血患者的网织红细胞计数结果应进行校正后报告。 红细胞沉降率测定 （estimation of erythrocyte sedimentation rate,ESR） 方法一 魏氏法（westergren ）