中国药物依赖性杂志(Chin」Drug Depend)2014,23(2):81-85 81· 综述] 光遗传技术在精神疾病研究中的应用 张艳薛言学艾思志梁洁时杰* (北京大学中国药物依懒性研究所，北京，100191) 光遗传学技术是将光学和分子遗传学有机结合 细胞，从而导致实验结果不准确，也给数据分析带来 后产生的一门新兴技术，这种方法是利用光刺激光 了很多不便：另外，电刺激的时间效应远远慢于光刺 敏感通道蛋白来控制神经元的活动及功能。应用这 激，这也限制了电刺激技术的进一步发展。光遗传 项技术，将光敏感蛋白表达在特定神经元中，通过不 学技术避免了这两种方法的缺点，它通过光敏蛋白 同波长或频率的光刺激激活或沉默特定的神经元， 在特定细胞上的表达，使得随后的光刺激局限在某 来达到控制动物行为的目的。本文主要介绍这项技 一类型的特定神经元，避免影响到周围组织：而且光 术的基本原理，以及在精神疾病及神经科学领域中 刺激的速度可以达到毫秒级，这样就可以有效地模 如何应用这种技术来控制神经环路和动物行为。 拟正常神经元的放电现象。2005年，美国斯坦福大 学Karl Deisseroth的研究小组首次在技术上实现了 1简介 光控制神经元活动0，此后该技术在神经科学领域 光遗传学技术是将光学和遗传学技术结合以达 得到广泛应用，并于20l0年被Nature Methods评为 到调控动物体内某一特定神经元激活或沉默的效 该年年度技术。本文就光遗传学技术的基本原理及 果-)。神经系统包括许多不同类型的神经元，这 其应用进展作一简单介绍。 些神经元相互联系，形成具有不同功能的神经环路， 控制着相应的行为表现。长期以来，科学家们一直 2基本原理 致力于研究控制不同行为的神经环路的工作机制， 光遗传学技术可以分为两部分，光敏感蛋白在 探讨在外界刺激下神经环路是如何协同作用来控制 特定神经元上的表达、光刺激与信号记录。 机体应对外界的应激。由于神经系统有大量的神经 2.1光敏感蛋白的表达 元与突触连接，给研究工作带来了极大的挑战，而不 早在20世纪70年代，科学家们就发现自然界 断再生和退化的神经元又给神经系统的研究带来了 中存在能够感应外界光刺激的蛋白日，但直到本世 更多的难题。 纪初才开始应用到神经科学领域中。 为了阐明神经系统之间的工作环路，科学家们 Channerlhodopsin22(ChR2)是一种从单细胞绿藻中分 不仅要探讨它们之间的投射连接，而且更希望通过 离出来的七通道跨膜蛋白，在视黄醛辅因子(ATR) 调控某一神经元的活动来观察其对行为的影响。常 的存在下，它能够感应蓝光(~470nm),在蓝光的刺 用的经典方法有两种，一种是通过药理学手段，给予 激下，ATR发生构象变化，使细胞去极化，打开通道 机体特定的药物激活或抑制神经元的活动，但是这 释放Na+日。2005年，Karl Deisseroth研究小组首 种方法往往作用时程比较长，激活的神经元并不能 次将ChR2应用于光控制神经活动实验中，使得 局限在某一类型的细胞中，也难以作用于特定的神 ChR2在海马CA1/CA3脑区表达，兴奋海马内神经 经元类型：另一种方法是采用电刺激的方法使得细 元，而不影响其他脑区，并且光照也没有导致细胞死 胞膜去极化或超极化，通过改变电刺激的频率等一 亡。继ChR2之后，又发现一种抑制性光敏感蛋 系列参数，来模拟和调控神经元的放电，观察其对行 白Halorhodopsin(NpHR),它可以感应黄光刺激 为的影响。但是这种方法也有其局限性，电刺激往 （~580nm),使细胞超极化，Cl通道开放，这两种不 往不能局限在某一区域，经常会影响到周围神经元 同的光敏蛋白可以同时在细胞中表达，来控制神经 元的活动。VChRI是ChR2的亚型，也是从单细 胞绿藻中提取出来的，它可以感应黄光刺激 (~589nm)图。因此，它可以和ChR2混合使用，兴 国家自然科学基金杰出青年基金项目(30725016)：国家自 奋特定的神经元。 然科学基金面上项目(81071079)资助 *通讯作者：E-mail:shijie(@bjmu.edu.cm 对ChR2结构改造得到的ChETA,可以感应高 达20OHz的光刺激。此外，ChR1和ChR2的嵌合 ?1994-2014 China Academic Journal Electronic Publishing House.All rights reserved.http://www.cnki.net
书 * 国家自然科学基金杰出青年基金项目( 30725016) ; 国家自 然科学基金面上项目( 81071079) 资助 ＊＊ 通讯作者: E － mail: shijie@ bjmu． edu． cn ［综述］ 光遗传技术在精神疾病研究中的应用* 张 艳 薛言学 艾思志 梁 洁 时 杰＊＊ ( 北京大学中国药物依赖性研究所，北京，100191) 光遗传学技术是将光学和分子遗传学有机结合 后产生的一门新兴技术，这种方法是利用光刺激光 敏感通道蛋白来控制神经元的活动及功能。应用这 项技术，将光敏感蛋白表达在特定神经元中，通过不 同波长或频率的光刺激激活或沉默特定的神经元， 来达到控制动物行为的目的。本文主要介绍这项技 术的基本原理，以及在精神疾病及神经科学领域中 如何应用这种技术来控制神经环路和动物行为。 1 简介 光遗传学技术是将光学和遗传学技术结合以达 到调控动物体内某一特定神经元激活或沉默的效 果［1 － 3］。神经系统包括许多不同类型的神经元，这 些神经元相互联系，形成具有不同功能的神经环路， 控制着相应的行为表现。长期以来，科学家们一直 致力于研究控制不同行为的神经环路的工作机制， 探讨在外界刺激下神经环路是如何协同作用来控制 机体应对外界的应激。由于神经系统有大量的神经 元与突触连接，给研究工作带来了极大的挑战，而不 断再生和退化的神经元又给神经系统的研究带来了 更多的难题。 为了阐明神经系统之间的工作环路，科学家们 不仅要探讨它们之间的投射连接，而且更希望通过 调控某一神经元的活动来观察其对行为的影响。常 用的经典方法有两种，一种是通过药理学手段，给予 机体特定的药物激活或抑制神经元的活动，但是这 种方法往往作用时程比较长，激活的神经元并不能 局限在某一类型的细胞中，也难以作用于特定的神 经元类型; 另一种方法是采用电刺激的方法使得细 胞膜去极化或超极化，通过改变电刺激的频率等一 系列参数，来模拟和调控神经元的放电，观察其对行 为的影响。但是这种方法也有其局限性，电刺激往 往不能局限在某一区域，经常会影响到周围神经元 细胞，从而导致实验结果不准确，也给数据分析带来 了很多不便; 另外，电刺激的时间效应远远慢于光刺 激，这也限制了电刺激技术的进一步发展。光遗传 学技术避免了这两种方法的缺点，它通过光敏蛋白 在特定细胞上的表达，使得随后的光刺激局限在某 一类型的特定神经元，避免影响到周围组织; 而且光 刺激的速度可以达到毫秒级，这样就可以有效地模 拟正常神经元的放电现象。2005 年，美国斯坦福大 学 Karl Deisseroth 的研究小组首次在技术上实现了 光控制神经元活动［4］，此后该技术在神经科学领域 得到广泛应用，并于 2010 年被 Nature Methods 评为 该年年度技术。本文就光遗传学技术的基本原理及 其应用进展作一简单介绍。 2 基本原理 光遗传学技术可以分为两部分，光敏感蛋白在 特定神经元上的表达、光刺激与信号记录。 2． 1 光敏感蛋白的表达 早在 20 世纪 70 年代，科学家们就发现自然界 中存在能够感应外界光刺激的蛋白［5］，但直到本世 纪初 才 开 始 应 用 到 神 经 科 学 领域中。 Channerlhodopsin2( ChＲ2) 是一种从单细胞绿藻中分 离出来的七通道跨膜蛋白，在视黄醛辅因子( ATＲ) 的存在下，它能够感应蓝光( ～ 470nm) ，在蓝光的刺 激下，ATＲ 发生构象变化，使细胞去极化，打开通道 释放 Na +［6］。2005 年，Karl Deisseroth 研究小组首 次将 ChＲ2 应用于光控制神经活动实验中，使 得 ChＲ2 在海马 CA1 /CA3 脑区表达，兴奋海马内神经 元，而不影响其他脑区，并且光照也没有导致细胞死 亡 ［4］。继 ChＲ2 之后，又发现一种抑制性光敏感蛋 白 Halorhodopsin ( NpHＲ) ，它可以感应黄光刺激 ( ～ 580nm) ，使细胞超极化，Cl － 通道开放，这两种不 同的光敏蛋白可以同时在细胞中表达，来控制神经 元的活动［7］。VChＲ1 是 ChＲ2 的亚型，也是从单细 胞绿藻中提取出来的，它 可 以 感 应 黄 光 刺 激 ( ～ 589nm) ［8］。因此，它可以和 ChＲ2 混合使用，兴 奋特定的神经元。 对 ChＲ2 结构改造得到的 ChETA，可以感应高 达 200Hz 的光刺激［9］。此外，ChＲ1 和 ChＲ2 的嵌合 中国药物依赖性杂志( Chin J Drug Depend) 2014，23( 2) : 81 － 85 ·81·
·82· 中国药物依赖性杂志(Chin J Drug Depend)2014,23(2):81-85 体-ChEF,可以耐受持久的光刺激，感应高频的光 中得到了广泛的应用，包括在神经环路、神经递质传 刺激o-m。NpHR2.0和NpHR3.0是NpHR的两 递以及一些正常和病态行为机制的研究。下面我们 种变体，它们在细胞膜的运输效率较ChR2有所提 主要就目前研究比较集中的几个领域进行简要介 高m。Archaerhodopsin-3(ArCh)是由原始细菌中 绍。 提取出来的光敏感蛋白，它可以使细胞超极化，最大 3.1药物成瘾 可达到90OpA,因此，ACh可以使细胞在光刺激后 长期暴露于成瘾性药物使奖赏环路发生持续的 的失活状态中自发恢复，避免细胞长期处于失活状 神经适应性改变，这些改变与奖赏一觅药行为密切 态回。 相关，最终导致药物成瘾和复吸。利用光遗传学技 现己开发出许多病毒载体将光感基因运载至体 术分析与奖赏一觅药行为相关的神经环路，确定了 内，并有效地表达成光敏感蛋白。最常用的有慢病 药物成瘾的神经适应性变化，从而给成瘾机制的研 毒、腺相关病毒AAV、Cre-Loxp重组酶系统以及各 究带来了新的曙光。多巴胺中脑边缘奖赏系统在成 种转基因小鼠等。以慢病毒作为光感基因载体，可 瘾机制的研究中起到非常重要的作用，Tsai等人的 产生稳定而长期的表达可。AAV更多地用在需要 研究发现，使用ChR2激活小鼠中脑腹侧被盖区 广泛区域表达的实验中。通常在注入动物体内之 (VTA)的多巴胺能神经元可以诱导小鼠的条件性 前，需要载入荧光蛋白受体，便于以后检测蛋白是否 位置偏爱行为，给予多巴胺神经元高频刺激，模拟多 成功的表达-W。Cre-Loxp重组酶系统可以使 巴胺能神经元的放电，证实了多巴胺能神经元在条 光敏蛋白以较高水平表达，并且可实现在某些特定 件性刺激行为中的重要作用P。Lobo等人发现，伏 脑区表达。除此之外，科学家们还成功繁殖多 隔核(NAc)脑区多巴胺的两个不同亚型的神经元： 种转基因小鼠，例如在胆碱能神经元上表达ChAT- D1和D2神经元在可卡因的条件性位置偏爱中起 ChR2-EYFP的小鼠，在GABA能神经元上表达 到了相反的作用。使用CR2激活D1神经元，可以 的VGAT-ChR2-EYFP的小鼠，在五羟色胺(5- 使小鼠形成可卡因的条件性位置偏爱，而激活D2 HT)神经元上表达PH2-ChR2-EYFP的小鼠和在 神经元，则起到了相反的作用，研究还提示脑源性神 肌钙蛋白神经元上表达Pvalb-ChR2-EYFP的小 经生长因子(BDNF)在调节D1和D2神经元中有重 鼠等m。己有研究证实，ChR2的表达对小鼠的影 响很小，可以说ChR2本身对动物没有影响图。 要作用的。 光敏感蛋白作为光遗传技术的一种工具，主要 除了多巴胺系统之外，光遗传学技术还在成瘾 相关的其他神经递质的研究中有重要应用。从 功能在于它可以在脑内很多神经元中稳定表达，具 体选用哪一种蛋白，需要综合考虑其优缺点。随着 VTA脑区到NAc脑区的神经投射，在药物成瘾中是 生物工程技术的发展，我们期待开发出更多新的光 非常重要的奖赏环路a。NAc脑区中超过90%以 上的神经元都是中间棘神经元，利用光遗传技术发 敏感蛋白，并在更多类型的神经元中稳定的表达。 2.2光刺激和信号记录 现，它们均来自于VTA脑区的GABA能神经元，而 常用的光刺激系统有卤素、氙气光源和光列二 不是多巴胺能神经元m。值得一提的是，如果抑制 极管(LED)等。在体外实验中，常用脑片电生理的 奖赏环路的神经元，则可导致厌恶。利用光遗传技 方法记录神经元放电信号：在在体动物实验中，将光 术激活VTA脑区的GABA能神经元可以抑制多巴 纤套管植入动物脑内回，并将电极和光纤绑在一起 胺能神经元，从而导致条件性位置厌恶行为，同时使 (光电极)固定于动物颅骨上0-训，在进行光刺激 GABA能神经元的放电频率增高D。2010年， 的同时记录神经元的放电情况四。光遗传学技术 Tecuapetla等人将此项技术用来研究中脑边缘系统 还可以联合其他技术，如脑电图、MRI等，在 的奖赏效应，证明了谷氨酸递质的传递参与了NAc 激活神经元的情况下，记录正常和病理状态下的差 脑区的奖赏效应四，之后KoOs等人利用光遗传技 异。正因为有了光遗传学技术这些工具的应用，特 术详细阐明了谷氨酸递质在中脑多巴胺神经元中的 别是其在在体技术方面的应用，使我们可以实时地 传递对行为的影响以及分子机制B0。Witten等人 记录动物体内神经元放电情况，这是神经科学领域 发现，胆碱能中间神经元在成瘾中也有重要的作用。 的一项重大进步。 使用ChR2激活NAc脑区的胆碱能神经元，可以形 成条件性位置偏爱行为：而使用eNpHR.3.0抑制胆 3应用 碱能神经元，则可逆转可卡因形成的条件性位置偏 目前，光遗传学技术已经在神经系统领域研究 爱行为，提示NAc脑区的胆碱能中间神经元参与了 ?1994-2014 China Academic Journal Electronic Publishing House.All rights reserved.http://www.cnki.net
体 － ChIEF，可以耐受持久的光刺激，感应高频的光 刺激［10 － 11］。NpHＲ2． 0 和 NpHＲ3． 0 是 NpHＲ 的两 种变体，它们在细胞膜的运输效率较 ChＲ2 有所提 高［11］。Archaerhodopsin － 3( ArCh) 是由原始细菌中 提取出来的光敏感蛋白，它可以使细胞超极化，最大 可达到 900pA，因此，ArCh 可以使细胞在光刺激后 的失活状态中自发恢复，避免细胞长期处于失活状 态［12］。 现已开发出许多病毒载体将光感基因运载至体 内，并有效地表达成光敏感蛋白。最常用的有慢病 毒、腺相关病毒 AAV、Cre － Loxp 重组酶系统以及各 种转基因小鼠等。以慢病毒作为光感基因载体，可 产生稳定而长期的表达 ［4］。AAV 更多地用在需要 广泛区域表达的实验中。通常在注入动物体内之 前，需要载入荧光蛋白受体，便于以后检测蛋白是否 成功的表达［13 － 14］。Cre － Loxp 重组酶系统可以使 光敏蛋白以较高水平表达，并且可实现在某些特定 脑区表达 ［13，15］。除此之外，科学家们还成功繁殖多 种转基因小鼠，例如在胆碱能神经元上表达 ChAT － ChＲ2 － EYFP 的小鼠［16］，在 GABA 能神经元上表达 的 VGAT － ChＲ2 － EYFP 的小鼠，在五羟色胺( 5 － HT) 神经元上表达 PH2 － ChＲ2 － EYFP 的小鼠和在 肌钙蛋白神经元上表达 Pvalb － ChＲ2 － EYFP 的小 鼠等［17］。已有研究证实，ChＲ2 的表达对小鼠的影 响很小，可以说 ChＲ2 本身对动物没有影响［18］。 光敏感蛋白作为光遗传技术的一种工具，主要 功能在于它可以在脑内很多神经元中稳定表达，具 体选用哪一种蛋白，需要综合考虑其优缺点。随着 生物工程技术的发展，我们期待开发出更多新的光 敏感蛋白，并在更多类型的神经元中稳定的表达。 2． 2 光刺激和信号记录 常用的光刺激系统有卤素、氙气光源和光列二 极管( LED) 等。在体外实验中，常用脑片电生理的 方法记录神经元放电信号; 在在体动物实验中，将光 纤套管植入动物脑内［19］，并将电极和光纤绑在一起 ( 光电极) 固定于动物颅骨上［20 － 21］，在进行光刺激 的同时记录神经元的放电情况［21］。光遗传学技术 还可以联合其他技术，如脑电图［22］、fMＲI ［23］等，在 激活神经元的情况下，记录正常和病理状态下的差 异。正因为有了光遗传学技术这些工具的应用，特 别是其在在体技术方面的应用，使我们可以实时地 记录动物体内神经元放电情况，这是神经科学领域 的一项重大进步。 3 应用 目前，光遗传学技术已经在神经系统领域研究 中得到了广泛的应用，包括在神经环路、神经递质传 递以及一些正常和病态行为机制的研究。下面我们 主要就目前研究比较集中的几个领域进行简要介 绍。 3． 1 药物成瘾 长期暴露于成瘾性药物使奖赏环路发生持续的 神经适应性改变，这些改变与奖赏 － 觅药行为密切 相关，最终导致药物成瘾和复吸。利用光遗传学技 术分析与奖赏 － 觅药行为相关的神经环路，确定了 药物成瘾的神经适应性变化，从而给成瘾机制的研 究带来了新的曙光。多巴胺中脑边缘奖赏系统在成 瘾机制的研究中起到非常重要的作用，Tsai 等人的 研究发现，使用 ChＲ2 激活小鼠中脑腹侧被盖 区 ( VTA) 的多巴胺能神经元可以诱导小鼠的条件性 位置偏爱行为，给予多巴胺神经元高频刺激，模拟多 巴胺能神经元的放电，证实了多巴胺能神经元在条 件性刺激行为中的重要作用［24］。Lobo 等人发现，伏 隔核( NAc) 脑区多巴胺的两个不同亚型的神经元: D1 和 D2 神经元在可卡因的条件性位置偏爱中起 到了相反的作用。使用 ChＲ2 激活 D1 神经元，可以 使小鼠形成可卡因的条件性位置偏爱，而激活 D2 神经元，则起到了相反的作用，研究还提示脑源性神 经生长因子( BDNF) 在调节 D1 和 D2 神经元中有重 要作用［25］。 除了多巴胺系统之外，光遗传学技术还在成瘾 相关的其他神经递质的研究中有重要应用。从 VTA 脑区到 NAc 脑区的神经投射，在药物成瘾中是 非常重要的奖赏环路［26］。NAc 脑区中超过 90% 以 上的神经元都是中间棘神经元，利用光遗传技术发 现，它们均来自于 VTA 脑区的 GABA 能神经元，而 不是多巴胺能神经元［27］。值得一提的是，如果抑制 奖赏环路的神经元，则可导致厌恶。利用光遗传技 术激活 VTA 脑区的 GABA 能神经元可以抑制多巴 胺能神经元，从而导致条件性位置厌恶行为，同时使 GABA 能神经元的放电频率增高［28］。2010 年， Tecuapetla 等人将此项技术用来研究中脑边缘系统 的奖赏效应，证明了谷氨酸递质的传递参与了 NAc 脑区的奖赏效应［29］，之后 Koos 等人利用光遗传技 术详细阐明了谷氨酸递质在中脑多巴胺神经元中的 传递对行为的影响以及分子机制［30］。Witten 等人 发现，胆碱能中间神经元在成瘾中也有重要的作用。 使用 ChＲ2 激活 NAc 脑区的胆碱能神经元，可以形 成条件性位置偏爱行为; 而使用 eNpHＲ3． 0 抑制胆 碱能神经元，则可逆转可卡因形成的条件性位置偏 爱行为，提示 NAc 脑区的胆碱能中间神经元参与了 ·82· 中国药物依赖性杂志( Chin J Drug Depend) 2014，23( 2) : 81 － 85
中国药物依赖性杂志(Chin J Drug Depend)2014,23(2):81-85 ·83 可卡因的奖赏记忆Bu。2012年，Vincent等人在 神经环路进行深入分析，确定了其发生功能改变的 Nature》上发表的文章，利用光遗传技术重新调整 神经机制。Tye等人的研究发现，当使用eNpHR3.0 行为敏化行为探索可卡因引起的突触可塑性增强机 进行光刺激，可以抑制基底外侧杏仁核在中央杏仁 制，证明了可卡因的行为敏化需要依赖于NMDA受 核的突触终端，使得小鼠在高架十字迷宫的开臂时 体依赖的LTP,通过光遗传技术逆转可卡因诱导的 间减少，表明其具有焦虑样行为：而使用CR2进行 神经可塑性变化能够逆转药物所诱导的行为适应性 光刺激激活它们之间的突触连接，小鼠的开臂时间 改变阅 增多，则表明降低了其焦虑样行为，提示基底外侧杏 光遗传学技术从分子水平、细胞水平以及空间 仁核至中央杏仁核之间的突触联系在焦虑症的发病 和时间特异性上给成瘾机制的研究带来了新的机 机制中具有重要作用网 遇，对这项技术的不断改进，可能使这项技术从目前 抑郁症是目前亟待解决的医学难题之一，并引 的研究手段发展成为未来的治疗手段。 起了广泛的社会关注。虽然药物治疗可以暂时缓解 3.2学习记忆 症状，但其带来的不良反应往往与疗效同等，并且无 光遗传技术在学习记忆研究中的应用主要集中 法治愈。另外一种方法是深部脑刺激(DBS)治疗， 在奖赏与惩罚记忆、恐惧记忆、记忆的巩固以及长期 DBS用于治疗多种精神疾病，但其具体机制仍不明 记忆的机制研究等方面。Cohen等人采用光遗传技 确。斯坦福大学Deisseroth教授带领的研究小组在 术发现，VTA脑区存在三种类型的神经元，当动物 利用DBS刺激丘脑底核时发现，其影响的不仅仅是 得到预期奖赏时，第一类神经元处于阶段性的兴奋 局部的神经元细胞，而是刺激了多个区域的细 状态；而在奖赏延迟出现时，第二类神经元和第三类 胞。利用光遗传技术发现中间前额叶皮质 神经元则处于持续的激活状态。进一步研究发现， (mP℉C)在抑郁症的发病机制中起到重要作用，在 VTA脑区所有标记的多巴胺能神经元属于第一类 社会交往失败模型小鼠中，发现P℉C脑区的即早基 神经元，具有奖赏作用，而GABA能神经元属于第 因表达降低，而对这种小鼠的mPFC脑区进行光刺 二类神经元，具有抑制作用B阅。Haubensak等人采 激则可以恢复正常的社会交往能力和糖水偏爱0。 用ChR2在研究恐惧记忆的学习过程中发现，激活 最近的一项研究发现，给予VTA脑区光刺激，可引 外侧杏仁核中GABA能神经元内的PKC-8过表达 发该脑区多巴胺能神经元的位相型放电，小鼠表现 可以抑制内侧杏仁核的神经输出，从而达到控制恐 出社会交往失败行为：进一步研究发现，在促进应激 惧记忆中的不动行为。Liu等人的研究也发现， 易感的神经环路上可表现出多种模式：VTA脑区的 海马的DG脑区至CA3脑区的神经输入，介导了恐 位相型激活投射至NAc脑区（而不是mPFC),导致 惧记忆的唤起B。Goshen等人的研究发现，表达 社会交往失败应激的易感性；而VTA至mPFC的抑 eNpHR3.1蛋白的小鼠，利用光刺激抑制其海马 制性神经元投射则介导了社会交往失败应激抵抗。 CA1区神经元，可以可逆性地消除条件性恐惧记忆 这些研究都为抑郁症的发病机制提供了新的证 唤起，进而发现恐惧记忆的长期效应由从海马依赖 据 性转变为非海马依赖性的记忆所介导，并揭示了海 3.4其他 马CA1区至扣带回的神经环路在长期记忆唤起中 光遗传技术还应用到帕金森症、精神分裂症的 的重要作用购。Ros等人将光遗传学技术应用在 机制研究中。例如，Kravitz等人的研究发现，激活中 记忆巩固过程的研究中，发现表达ChR2的小鼠在 间棘突神经元中的间接通路，可使小鼠产生帕金森 睡眠的不同阶段激活hypocretin和orexin两种神经 样症状，即运动迟缓，活动力下降，而激活中间棘突 元（它们在睡眠的觉醒系统中有着重要作用），而不 神经元的直接通路，则产生相反的作用。其中，帕金 破坏睡眠的整体水平，结果显示，小鼠在新颖物体识 森的间接通路与多巴胺的D2受体有关，直接通路 别的学习模式中记忆能力下降，从而揭示了睡眠的 与D1受体有关，这就从机制上解释了基底神经节 连续性在记忆巩固中的重要作用例。 两条通路在帕金森症状中的不同作用。目前认 3.3抑郁和焦虑样行为 为，精神分裂主要是由于神经微环路的兴奋和抑制 长时间暴露于恐惧或焦虑的环境下会导致焦虑 比例(E)失衡，而利用光遗传技术，科学家们可以 症、创伤后应激障碍或抑郁症等。虽然传统的药理 评估mP℉℃脑区的E1I比例，为精神分裂的机制研 学手段已描绘出形成恐惧的神经环路，但对此环路 究提供了有效的依据回。 的功能结构还不是很清楚。科学家们利用光遗传学 另外，光遗传学还应用在一些常见的神经元功 技术从神经解剖结构上对参与恐惧和焦虑样行为的 能以及胶质细胞的研究中。例如，Ren等人的研究 ?1994-2014 China Academic Journal Electronic Publishing House.All rights reserved.http://www.cnki.net
可卡 因 的 奖 赏 记 忆［31］。2012 年，Vincent 等 人 在 《Nature》上发表的文章，利用光遗传技术重新调整 行为敏化行为探索可卡因引起的突触可塑性增强机 制，证明了可卡因的行为敏化需要依赖于 NMDA 受 体依赖的 LTP，通过光遗传技术逆转可卡因诱导的 神经可塑性变化能够逆转药物所诱导的行为适应性 改变［32］。 光遗传学技术从分子水平、细胞水平以及空间 和时间特异性上给成瘾机制的研究带来了新的机 遇，对这项技术的不断改进，可能使这项技术从目前 的研究手段发展成为未来的治疗手段。 3． 2 学习记忆 光遗传技术在学习记忆研究中的应用主要集中 在奖赏与惩罚记忆、恐惧记忆、记忆的巩固以及长期 记忆的机制研究等方面。Cohen 等人采用光遗传技 术发现，VTA 脑区存在三种类型的神经元，当动物 得到预期奖赏时，第一类神经元处于阶段性的兴奋 状态; 而在奖赏延迟出现时，第二类神经元和第三类 神经元则处于持续的激活状态。进一步研究发现， VTA 脑区所有标记的多巴胺能神经元属于第一类 神经元，具有奖赏作用，而 GABA 能神经元属于第 二类神经元，具有抑制作用［33］。Haubensak 等人采 用 ChＲ2 在研究恐惧记忆的学习过程中发现，激活 外侧杏仁核中 GABA 能神经元内的 PKC － δ 过表达 可以抑制内侧杏仁核的神经输出，从而达到控制恐 惧记忆中的不动行为［34］。Liu 等人的研究也发现， 海马的 DG 脑区至 CA3 脑区的神经输入，介导了恐 惧记忆的唤起［35］。Goshen 等人的研究发现，表达 eNpHＲ3． 1 蛋 白 的 小 鼠，利 用 光 刺 激 抑 制 其 海 马 CA1 区神经元，可以可逆性地消除条件性恐惧记忆 唤起，进而发现恐惧记忆的长期效应由从海马依赖 性转变为非海马依赖性的记忆所介导，并揭示了海 马 CA1 区至扣带回的神经环路在长期记忆唤起中 的重要作用［36］。Ｒolls 等人将光遗传学技术应用在 记忆巩固过程的研究中，发现表达 ChＲ2 的小鼠在 睡眠的不同阶段激活 hypocretin 和 orexin 两种神经 元( 它们在睡眠的觉醒系统中有着重要作用) ，而不 破坏睡眠的整体水平，结果显示，小鼠在新颖物体识 别的学习模式中记忆能力下降，从而揭示了睡眠的 连续性在记忆巩固中的重要作用［37］。 3． 3 抑郁和焦虑样行为 长时间暴露于恐惧或焦虑的环境下会导致焦虑 症、创伤后应激障碍或抑郁症等。虽然传统的药理 学手段已描绘出形成恐惧的神经环路，但对此环路 的功能结构还不是很清楚。科学家们利用光遗传学 技术从神经解剖结构上对参与恐惧和焦虑样行为的 神经环路进行深入分析，确定了其发生功能改变的 神经机制。Tye 等人的研究发现，当使用 eNpHＲ3． 0 进行光刺激，可以抑制基底外侧杏仁核在中央杏仁 核的突触终端，使得小鼠在高架十字迷宫的开臂时 间减少，表明其具有焦虑样行为; 而使用 ChＲ2 进行 光刺激激活它们之间的突触连接，小鼠的开臂时间 增多，则表明降低了其焦虑样行为，提示基底外侧杏 仁核至中央杏仁核之间的突触联系在焦虑症的发病 机制中具有重要作用［38］。 抑郁症是目前亟待解决的医学难题之一，并引 起了广泛的社会关注。虽然药物治疗可以暂时缓解 症状，但其带来的不良反应往往与疗效同等，并且无 法治愈。另外一种方法是深部脑刺激( DBS) 治疗， DBS 用于治疗多种精神疾病，但其具体机制仍不明 确。斯坦福大学 Deisseroth 教授带领的研究小组在 利用 DBS 刺激丘脑底核时发现，其影响的不仅仅是 局部的神经元细胞，而是刺激了多个区域的细 胞［39］。利用光遗传技术发现中间前额叶皮质 ( mPFC) 在抑郁症的发病机制中起到重要作用，在 社会交往失败模型小鼠中，发现 PFC 脑区的即早基 因表达降低，而对这种小鼠的 mPFC 脑区进行光刺 激则可以恢复正常的社会交往能力和糖水偏爱［40］。 最近的一项研究发现，给予 VTA 脑区光刺激，可引 发该脑区多巴胺能神经元的位相型放电，小鼠表现 出社会交往失败行为; 进一步研究发现，在促进应激 易感的神经环路上可表现出多种模式: VTA 脑区的 位相型激活投射至 NAc 脑区( 而不是 mPFC) ，导致 社会交往失败应激的易感性; 而 VTA 至 mPFC 的抑 制性神经元投射则介导了社会交往失败应激抵抗。 这些研究都为抑郁症的发病机制提供了新的证 据［41］。 3． 4 其他 光遗传技术还应用到帕金森症、精神分裂症的 机制研究中。例如，Kravitz 等人的研究发现，激活中 间棘突神经元中的间接通路，可使小鼠产生帕金森 样症状，即运动迟缓，活动力下降，而激活中间棘突 神经元的直接通路，则产生相反的作用。其中，帕金 森的间接通路与多巴胺的 D2 受体有关，直接通路 与 D1 受体有关，这就从机制上解释了基底神经节 两条通路在帕金森症状中的不同作用［14］。目前认 为，精神分裂主要是由于神经微环路的兴奋和抑制 比例( E /I) 失衡，而利用光遗传技术，科学家们可以 评估 mPFC 脑区的 E /I 比例，为精神分裂的机制研 究提供了有效的依据［42］。 另外，光遗传学还应用在一些常见的神经元功 能以及胶质细胞的研究中。例如，Ｒen 等人的研究 中国药物依赖性杂志( Chin J Drug Depend) 2014，23( 2) : 81 － 85 ·83·
·84· 中国药物依赖性杂志(Chin J Drug Depend)2014,23(2):81-85 发现，给予脚间核内胆碱能神经元短暂的光刺激，可 而影响到细胞内钙离子浓度和二氧化碳分压，最终 引起谷氨酸的释放，而给予强直性的光刺激则引起 影响小鼠的呼吸功能。这些为光遗传技术在神 乙酰胆碱的释放，这就打破了以往的一种神经元只 经科学领域的研究开辟了新的方向。 释放一种神经递质的说法Da:而English等人的研 究还利用光遗传技术复制出胆碱能神经元同步兴奋 4展望 和间歇兴奋的模式，发现胆碱能中间神经元可以激 本文概括总结了光遗传技术的基本原理和应用 活γ-氨基丁酸能的神经环路，并分别于体外和体 进展，目前，新的光敏感蛋白和病毒载体仍在研究 内实验证明了这种模式介导了纹状体神经投射的抑 中，而光遗传与电生理的结合使我们可以通过体外 制作用网。胶质细胞对神经元有营养支持作用，参 和在体实验实时观察到神经元的放电。光遗传技术 与神经系统的再生和修复，Alexander等人在胶质细 在时间和空间上的优越性使得该项技术在多种动物 胞中的研究发现，给予小鼠腹侧延髓质的胶质细胞 模型中广泛应用，我们期待这项技术的进一步发展， 相应的光刺激，可引起胶质细胞内PH值的变化，进 应用到更广阔的领域，去揭示更多神经系统的奥秘。 5参考文献 Deisseroth K,Feng G,Majewska AK,et al.Next-generation optical technologies for illuminating genetically targeted brain circuits).J Neurosci,2006,26(41):10380-10386 2]Deisseroth K.Controlling the brain with light []Sci Am,2010,303(5):48-55 B3]Deisseroth K.Optogenetics].Nat Methods,2011,8(1):26-29 4]Boyden ES,Zhang F,Bamberg E,et al.Millisecond-timescale,genetically targeted optical control of neural activity].Nat Neurosci,2005,8(9):1263-1268 5]Oesterhelt D,Stoeckenius W.Rhodopsin-like protein from the purple membrane of Halobacterium halobium ]Nat New Biol,1971,233(39):149-152 6]Nagel G,Szellas T,Huhn W,et al.Channelrhodopsin-2,a directly light-gated cation-selective membrane channel ] Proc Natl Acad Sci U S A,2003,100(24):13940-13945 Zhang F,Wang LP,Brauner M,et al.Multimodal fast optical interrogation of neural circuitry ]Nature,2007,446(7136): 633-639 8]Zhang F,Prigge M,Beyriere F,et al.Red-shifted optogenetic excitation:a tool for fast neural control derived from Volvox carteri ]Nat Neurosci,2008,11(6):631 -633 9]Gunaydin LA,Yizhar O,Berndt A,et al.Ultrafast optogenetic control []Nat Neurosci,2010,13(3):387-392 [10]Lin JY,Lin MZ,Steinbach P,et al.Characterization of engineered channelrhodopsin variants with improved properties and kinetics ]Biophys J,2009,96(5):1803-1814 [11]Gradinaru V,Zhang F,Ramakrishnan C,et al.Molecular and cellular approaches for diversifying and extending optogenetics 0].Cell,2010,141(1):154-165 [12]Chow BY,Han X,Dobry AS,et al.High-performance genetically targetable optical neural silencing by light-driven proton pumps].Nature,2010,463(7277):98-102 [13]Atasoy D,Aponte Y,Su HH,et al.A FLEX switch targets Channelrhodopsin-2 to multiple cell types for imaging and long- range circuit mapping ]J Neurosci,2008,28(28):7025-7030 14]Kravitz AV,Freeze BS,Parker PR,et al.Regulation of parkinsonian motor behaviours by optogenetic control of basal ganglia circuitry).Nature,2010,466(7306):622-626 [15]Cardin JA,Carlen M,Meletis K,et al.Targeted optogenetic stimulation and recording of neurons in vivo using cell-type- specific expression of Channelrhodopsin-2[].Nat Protoc,2010,5(2):247-254 [16]Ren J,Qin C,Hu F,et al.Habenula "cholinergic"neurons co-release glutamate and acetylcholine and activate postsynaptic neurons via distinct transmission modes ]Neuron,2011,69(3):445-452 [17]Zhao S,Ting JT,Atallah HE,et al.Cell type-specific channelrhodopsin-2 transgenic mice for optogenetic dissection of neural circuitry function ]Nat Methods,2011,8 (9):745-752 [18]Wang H,Peca J,Matsuzaki M,et al.High-speed mapping of synaptic connectivity using photostimulation in Channelrhodopsin- 2 transgenic mice ]Proc Natl Acad Sci U S A,2007,104(19)8143-8148 [19]Zhang F,Gradinaru V,Adamantidis AR,et al.Optogenetic interrogation of neural circuits:technology for probing mammalian brain structures []Nat Protoc,2010,5(3):439-456 ?1994-2014 China Academic Journal Electronic Publishing House.All rights reserved.http://www.cnki.net
发现，给予脚间核内胆碱能神经元短暂的光刺激，可 引起谷氨酸的释放，而给予强直性的光刺激则引起 乙酰胆碱的释放，这就打破了以往的一种神经元只 释放一种神经递质的说法［16］; 而 English 等人的研 究还利用光遗传技术复制出胆碱能神经元同步兴奋 和间歇兴奋的模式，发现胆碱能中间神经元可以激 活 γ － 氨基丁酸能的神经环路，并分别于体外和体 内实验证明了这种模式介导了纹状体神经投射的抑 制作用［43］。胶质细胞对神经元有营养支持作用，参 与神经系统的再生和修复，Alexander 等人在胶质细 胞中的研究发现，给予小鼠腹侧延髓质的胶质细胞 相应的光刺激，可引起胶质细胞内 PH 值的变化，进 而影响到细胞内钙离子浓度和二氧化碳分压，最终 影响小鼠的呼吸功能［44］。这些为光遗传技术在神 经科学领域的研究开辟了新的方向。 4 展望 本文概括总结了光遗传技术的基本原理和应用 进展，目前，新的光敏感蛋白和病毒载体仍在研究 中，而光遗传与电生理的结合使我们可以通过体外 和在体实验实时观察到神经元的放电。光遗传技术 在时间和空间上的优越性使得该项技术在多种动物 模型中广泛应用，我们期待这项技术的进一步发展， 应用到更广阔的领域，去揭示更多神经系统的奥秘。 5 参考文献 ［1］Deisseroth K，Feng G，Majewska AK，et al． Next － generation optical technologies for illuminating genetically targeted brain circuits［J］． J Neurosci，2006，26( 41) : 10380 － 10386 ［2］Deisseroth K． Controlling the brain with light［J］． Sci Am，2010，303( 5) : 48 － 55 ［3］Deisseroth K． Optogenetics［J］． Nat Methods，2011，8( 1) : 26 － 29 ［4］Boyden ES，Zhang F，Bamberg E，et al． Millisecond － timescale，genetically targeted optical control of neural activity［J］． Nat Neurosci，2005，8( 9) : 1263 － 1268 ［5］Oesterhelt D，Stoeckenius W． Ｒhodopsin － like protein from the purple membrane of Halobacterium halobium［J］． Nat New Biol，1971，233( 39) : 149 － 152 ［6］Nagel G，Szellas T，Huhn W，et al． Channelrhodopsin － 2，a directly light － gated cation － selective membrane channel［J］． Proc Natl Acad Sci U S A，2003，100( 24) : 13940 － 13945 ［7］Zhang F，Wang LP，Brauner M，et al． Multimodal fast optical interrogation of neural circuitry［J］． Nature，2007，446( 7136) : 633 － 639 ［8］Zhang F，Prigge M，Beyriere F，et al． Ｒed － shifted optogenetic excitation: a tool for fast neural control derived from Volvox carteri［J］． Nat Neurosci，2008，11( 6) : 631 － 633 ［9］Gunaydin LA，Yizhar O，Berndt A，et al． Ultrafast optogenetic control［J］． Nat Neurosci，2010，13( 3) : 387 － 392 ［10］Lin JY，Lin MZ，Steinbach P，et al． Characterization of engineered channelrhodopsin variants with improved properties and kinetics［J］． Biophys J，2009，96( 5) : 1803 － 1814 ［11］Gradinaru V，Zhang F，Ｒamakrishnan C，et al． Molecular and cellular approaches for diversifying and extending optogenetics ［J］． Cell，2010，141( 1) : 154 － 165 ［12］Chow BY，Han X，Dobry AS，et al． High － performance genetically targetable optical neural silencing by light － driven proton pumps［J］． Nature，2010，463( 7277) : 98 － 102 ［13］Atasoy D，Aponte Y，Su HH，et al． A FLEX switch targets Channelrhodopsin － 2 to multiple cell types for imaging and long － range circuit mapping［J］． J Neurosci，2008，28( 28) : 7025 － 7030 ［14］Kravitz AV，Freeze BS，Parker PＲ，et al． Ｒegulation of parkinsonian motor behaviours by optogenetic control of basal ganglia circuitry［J］． Nature，2010，466( 7306) : 622 － 626 ［15］Cardin JA，Carlen M，Meletis K，et al． Targeted optogenetic stimulation and recording of neurons in vivo using cell － type － specific expression of Channelrhodopsin － 2［J］． Nat Protoc，2010，5( 2) : 247 － 254 ［16］Ｒen J，Qin C，Hu F，et al． Habenula“cholinergic" neurons co － release glutamate and acetylcholine and activate postsynaptic neurons via distinct transmission modes［J］． Neuron，2011，69( 3) : 445 － 452 ［17］Zhao S，Ting JT，Atallah HE，et al． Cell type － specific channelrhodopsin － 2 transgenic mice for optogenetic dissection of neural circuitry function［J］． Nat Methods，2011，8( 9) : 745 － 752 ［18］Wang H，Peca J，Matsuzaki M，et al． High － speed mapping of synaptic connectivity using photostimulation in Channelrhodopsin － 2 transgenic mice［J］． Proc Natl Acad Sci U S A，2007，104( 19) : 8143 － 8148 ［19］Zhang F，Gradinaru V，Adamantidis AＲ，et al． Optogenetic interrogation of neural circuits: technology for probing mammalian brain structures［J］． Nat Protoc，2010，5( 3) : 439 － 456 ·84· 中国药物依赖性杂志( Chin J Drug Depend) 2014，23( 2) : 81 － 85
中国药物依赖性杂志(Chin J Drug Depend)2014,23(2):81-85 ·85· 20]Sparta DR,Stamatakis AM,Phillips JL,et al.Construction of implantable optical fibers for long-term optogenetic manipulation of neural circuits].Nat Protoc,2012,7(1):12-23 21]Lin L,Chen G,Xie K,et al.Large-scale neural ensemble recording in the brains of freely behaving mice ]J Neurosci Methods,2006,155(1):28-38 2]Adamantidis AR,Zhang F,Aravanis AM,et al.Neural substrates of awakening probed with optogenetic control of hypocretin neurons].Nature,2007,450(7168):420-424 3]Lee JH,Durand R,Gradinaru V,et al.Global and local fMRI signals driven by neurons defined optogenetically by type and wiring].Nature,2010,465(7299):788-792 24]Tsai HC,Zhang F,Adamantidis A,et al.Phasic firing in dopaminergic neurons is sufficient for behavioral conditioning ] Science,2009,324(5930):1080-1084 5]Lobo MK,Covington HE,3rd,Chaudhury D,et al.Cell type-specific loss of BDNF signaling mimics optogenetic control of cocaine reward []Science,2010,330(6002):385-390 26]Lammel S,Lim BK,Ran C,et al.Input-specific control of reward and aversion in the ventral tegmental area ]Nature, 2012,491(7423):212-217 27]Xia Y,Driscoll JR,Wilbrecht L,et al.Nucleus accumbens medium spiny neurons target non -dopaminergic neurons in the ventral tegmental area ]J Neurosci,2011,31(21)7811-7816 28]Tan KR,Yvon C,Turiault M,et al.GABA neurons of the VTA drive conditioned place aversion ]Neuron,2012,73(6): 1173-1183 9]Tecuapetla F,Patel JC,Xenias H,et al.Glutamatergic signaling by mesolimbic dopamine neurons in the nucleus accumbens.J Neurosci,2010,30(20):7105-7110 0]Koos T,Tecuapetla F,Tepper JM,Glutamatergic signaling by midbrain dopaminergic neurons:recent insights from optogenetic, molecular and behavioral studies ]Curr Opin Neurobiol,2011,21(3):393-401 B1]Witten IB,Lin SC,Brodsky M,et al.Cholinergic intemeurons control local circuit activity and cocaine conditioning] Science,2010,330(6011):1677-1681 B2]Vincent R,Klyatskaya S,Ruben M,et al.Electronic read-out of a single nuclear spin using a molecular spin transistor ] Nature,2012,488(7411):357-360 3]Cohen JY,Haesler S,Vong L,et al.Neuron-type-specific signals for reward and punishment in the ventral tegmental area ] Nature.,2012,482(7383):85-88 4]Haubensak W,Kunwar PS,Cai H,et al.Genetic dissection of an amygdala microcircuit that gates conditioned fear]. Nature,2010,468(7321):270-276 B5]Liu X,Ramirez S,Pang PT,et al.Optogenetic stimulation of a hippocampal engram activates fear memory recall ]Nature, 2012,484(7394):381-385 B6]Goshen I,Brodsky M,Prakash R,et al.Dynamics of retrieval strategies for remote memories].Cell,2011,147(3):678- 689 7]Rolls A,Colas D,Adamantidis A,et al.Optogenetic disruption of sleep continuity impairs memory consolidation].Proc Natl Acad Sci U S A,2011,108(32):13305-13310 38]Tye KM,Prakash R,Kim SY,et al.Amygdala circuitry mediating reversible and bidirectional control of anxiety Nature, 2011,471(7338):358-362 9]Gradinaru V,Mogri M,Thompson KR,et al.Optical deconstruction of parkinsonian neural eircuitry.Science,2009,324 (5925)：354-359 40]Covington HE,3rd,Lobo MK,Maze I,et al.Antidepressant effect of optogenetic stimulation of the medial prefrontal cortex].J Neurosci,2010,30(48):16082-16090 [41]Chaudhury D,Walsh JJ,Friedman AK,et al.Rapid regulation of depression-related behaviours by control of midbrain dopamine neurons []Nature,2013,493(7433):532-536 [42]Yizhar O,Fenno LE,Prigge M,et al.Neocortical excitation/inhibition balance in information processing and social dysfunction Nature,2011,477(7363):171-178 43]English DF,Ibanez-Sandoval 0,Stark E,et al.GABAergic circuits mediate the reinforcement-related signals of striatal cholinergic interneurons []Nat Neurosci,2012,15(1):123-130 44]Gourine AV,Kasymov V,Marina N,et al.Astrocytes control breathing through pH-dependent release of ATP ]Science, 2010,329(5991):571-575 收稿日期：2013-08-20 修回日期：2013-09-28 ?1994-2014 China Academic Journal Electronic Publishing House.All rights reserved.http://www.cnki.net
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