高效液相色谱化学发光检测法
高效液相色谱化学发光检测法
一.概述高效液相色谱是一种非常有效的分离手段。它已被广泛用于各种复杂混合物的分离和定量分析，高效液相色谱所用的检测器可分为以下几类（选择性）1.紫外-可见（UV-VIs)Detector2.荧光（选择性）（FL) Detector3.化学发光(CL)（选择性）Detector（通用）每一种物质都有不同的4.示差折光检测器折射选择性
一.概述 高效液相色谱是一种非常有效的分离手段。 它 已被广泛用于各种复杂混合物的分离和定量分析。 高效液相色谱所用的检测器可分为以下几类： 1. 紫外-可见（UV-VIS）Detector （选择性） 2. 荧光（FL）Detector （选择性） 3. 化学发光 （CL） Detector （选择性） 4. 示差折光检测器 （通用） 每一种物质都有不同的 折射选择性
安培法选择性5.电化学检测器通用电导法选择性6.放射性检测器化学发光分析具有灵敏度高、线性范围宽、仪器简单的优点，但选择性较差。而高效液相色谱是非常有效的分离手段将两者联用，可克服化学发光分析选择性差的缺点。而化学发光检测器又为高效液相色谱提供了高灵敏度的检测手段
5.电化学检测器 6.放射性检测器 选择性 化学发光分析具有灵敏度高、线性范 围宽、仪器简单的优点，但选择性较差。 而高效液相色谱是非常有效的分离手段， 将两者联用，可克服化学发光分析选择性 差的缺点。而化学发光检测器又为高效液 相色谱提供了高灵敏度的检测手段。 安培法 选择性 电导法 通用
2．仪器injectDumpMobile phaseLC columnPwasteumpCLreagentsObservationPumpcellmixer
2．仪器 Ｐｕｍｐ Ｐｕｍｐ Ｐｕｍｐ Mobile phase LC column CL reagents mixer Observation cell waste inject
3.CL检测法需要考虑的问题化学发光反应必须对某类物质响应，如果仅与某一种物质有关，在HPLC中将有限制的应用化学发光强度对各种环境因素是敏感的.如温度、溶剂、离子强度、pH和其它物质的存在。在发展HPLC分离操作时，这些因素也须加以控制。因此，分离条件和探测条件可能是不兼容的或两者须相互妥协。化学发光反应的发射强度不是常数，而是随时间而变化。发射强度IcL随时间衰变曲线不同的CL反应，有不同的衰变曲线。即使同一反应，在不同的条件其衰变曲线也不同
3. CL检测法需要考虑的问题 ◆ 化学发光反应必须对某类物质响应,如果仅与某一种 物质有关,在HPLC中将有限制的应用。 ◆ 化学发光强度对各种环境因素是敏感的.如温度、溶 剂、离子强度、pH和其它物质的存在。在发展HPLC分 离操作时，这些因素也须加以控制。因此，分离条件 和探测条件可能是不兼容的或两者须相互妥协。 ◆ 化学发光反应的发射强度不是常数，而是随时间而变 化。发射强度ICL随时间衰变曲线不同的CL反应，有不 同的衰变曲线。即使同一反应，在不同的条件其衰变 曲线也不同
ICLICLLucigeninLuminol在流动体系中，整个发射强度随时间的衰变曲线将不被观察，被探测的IcL是反应物流经检测池所需时间间隔内对发光强度的积分。在流动体系中，t由流速和池体积所控制，若V不变，通过调节流速和流路的设计使Im与时间窗口相吻合。如下图：
在流动体系中，整个发射强度随时间的衰变曲线将 不被观察，被探测的ICL是反应物流经检测池所需时间间 隔内对发光强度的积分。 在流动体系中，t由流速和池体积所控制，若V不变， 通过调节流速和流路的设计使Imax与时间窗口相吻合。如下 图： ICL ICL t Lucigenin Luminol t
BcellflowCLtime
cell AB ICL flow time
二.过氧草酸酯化学发光反应在HPLC中的应用1.荧光分析物的测定多环芳烃（PAHS)polycyclic aromatic hydrocarbons氨基多环芳烃（Amino-PAHS）葱、芘、苯并芘、氨基葱、氨基芘2.荧光衍生分析物的测定一些分析物本身没有荧光，因此必须进行荧光衍生反应，一般衍生在柱前完成
二.过氧草酸酯化学发光反应 在HPLC中的应用 1.荧光分析物的测定 多环芳烃（PAHS） polycyclic aromatic hydrocarbons 氨基多环芳烃（Amino-PAHS） 蒽、芘、苯并芘、氨基蒽、氨基芘 2.荧光衍生分析物的测定 一些分析物本身没有荧光，因此必须进 行荧光衍生反应，一般衍生在柱前完成
（1）丹磺酰氯及其衍生物丹磺酰氯是一种非常灵敏的荧光标记试剂，它的分子体积小，已广泛采用。主要用于伯、仲胺和酚羟基化合物。如氨基酸、儿茶酚胺、留二醇以及某些化合物。CH3CH3R1-NH2-→RSO2-NH-R1SO2CI(2)衍生物丹磺酰氯的各种衍生物已经被合成，如下：
(1)丹磺酰氯及其衍生物 丹磺酰氯是一种非常灵敏的荧光标记 试剂，它的分子体积小，已广泛采用。主要用于 伯、仲胺和酚羟基化合物。如氨基酸、儿茶酚胺、 甾二醇以及某些化合物。 （2）衍生物 丹磺酰氯的各种衍生物已经被合成，如 下： N SO2Cl CH3 CH3 + R1 NH2 R SO2 NH R1
CH3CH3RRRRSO2SO2SO2SO2NH -(CH2CH2)nNHRONH -CH2CH2OHSO2tert -Aminescarboxylic acidscarboxylic acidsThiols0RRRRRSO2SO2SO2SO2SO2NHCH2CH20COINH-NH2AlcoholsCarboxylsB(OH)2Cocarboxylic acids1,2-DiolsCH2Br
CH3 CH3 N SO2 O - R SO2 O - R SO2 NH CH2CH2OH R SO2 NH (CH2CH2)nNH2 R SO2 N N R SO2 N N CO R SO2 NH B(OH)2 R SO2 N R SO2 CH2CH2OCOl R SO2 NH NH2 tert Amines carboxylic acids carboxylic acids carboxylic acids CH2Br 1,2 Diols Thiols Alcohols Carboxyls