项目2发酵工业菌种操作技术 菌种的扩大培养就是把保藏的菌种，即砂土管，冷冻干燥管中处于休眠状态 的生产菌种接入试管斜面活化，再经过扁瓶或药瓶和种子罐，逐级扩大培养后达 到一定的数量和质量的纯种培养过程。这些纯种的培养物称为种子。 工业规模的发酵罐体积越来越大，目前己达到几十立方米至几百立方米。若 按5~10%的接种量计算，就要接入几立方到几十立方米的种子。这单靠试管里 的种子直接接入是不可能达到必需的数量和质量的，必须从试管中的微生物菌种 逐级扩大为生产使用的种子。这是一个从实验室制备到车间生产的过程。然而 菌种种类不同，生产产品品种不同，其生产方法和生产条件均有所差别，如营养、 温度、酸碱度、氧等条件。因此，种子扩大培养应根据菌种的生理特性，选择合 适的培养条件来获得代谢旺盛和数量足够的种子。这种种子接入发酵罐后，会使 发酵生产周期缩短，设备利用率提高，对杂菌的抵抗能力增加，对发酵生产起到 了关键性的作用。所以种子质量的好坏至关重要。 种子必须具备的条件：①菌种细胞的生长活力强，接种后在发酵罐中能迅速 生长：②生理性状稳定：③菌体总量和浓度能满足大容量发酵罐的要求：④无杂 菌污染（不带杂菌）：⑤生产能力稳定。 第一节种子制备 种子制备过程可分为两大阶段（如图）： a、 摇瓶 砂土管（冷冻杆燥管）→斜面 、固体斜面 b、 摇瓶、 →种子罐→发酵罐 固体一 ①实验室种子制备阶段：琼脂斜面至固体培养基扩大培养（如茄子瓶斜面培养等 或液体摇瓶培养。 ②生产车间种子制备阶段：种子罐扩大培养
项目 2 发酵工业菌种操作技术 菌种的扩大培养就是把保藏的菌种，即砂土管，冷冻干燥管中处于休眠状态 的生产菌种接入试管斜面活化，再经过扁瓶或药瓶和种子罐，逐级扩大培养后达 到一定的数量和质量的纯种培养过程。这些纯种的培养物称为种子。 工业规模的发酵罐体积越来越大，目前已达到几十立方米至几百立方米。若 按 5～10％的接种量计算，就要接入几立方到几十立方米的种子。这单靠试管里 的种子直接接入是不可能达到必需的数量和质量的，必须从试管中的微生物菌种 逐级扩大为生产使用的种子。这是一个从实验室制备到车间生产的过程。然而， 菌种种类不同，生产产品品种不同，其生产方法和生产条件均有所差别，如营养、 温度、酸碱度、氧等条件。因此，种子扩大培养应根据菌种的生理特性，选择合 适的培养条件来获得代谢旺盛和数量足够的种子。这种种子接入发酵罐后，会使 发酵生产周期缩短，设备利用率提高，对杂菌的抵抗能力增加，对发酵生产起到 了关键性的作用。所以种子质量的好坏至关重要。 种子必须具备的条件：①菌种细胞的生长活力强，接种后在发酵罐中能迅速 生长；②生理性状稳定；③菌体总量和浓度能满足大容量发酵罐的要求；④无杂 菌污染（不带杂菌）；⑤生产能力稳定。 第一节 种子制备 种子制备过程可分为两大阶段（如图）： a、 砂土管（冷 冻干燥管） 斜 面 摇 瓶 固 体斜 面 b、 摇 瓶 固 体 种 子 罐 发酵 罐 ①实验室种子制备阶段：琼脂斜面至固体培养基扩大培养（如茄子瓶斜面培养等 或液体摇瓶培养。 ②生产车间种子制备阶段：种子罐扩大培养
一 实验室种子制备 在砂土管或冷冻干燥管内保藏的菌种以无菌的方式接至适合的斜面培养基 上，培养成熟后挑选正常的菌落再接一次试管斜面。对那些产孢能力强、孢子发 芽生长繁殖快的菌种可以采取在固体培养基上培养的方法，孢子可直接接入种子 罐，从而简化了操作，减少了操作步骤，同时也减少了染菌的机会。例如生产青 霉素的产黄青莓菌，采用大米或小米作为固体培养基，取一定量装入250ml茄子 瓶中进行灭菌，米粒含水量一定要控制好，米粒不能粘也不能散，灭菌冷却后接 入孢子悬浮液，在25~28℃培养4~14天。培养期间，还要经常翻动，保持通 气均匀。培养结束后，或接入种子罐，或以真空抽去水分至10%以下，于4℃冰 箱中保存备用。 对于产孢子能力不强或孢子发芽慢的菌种，如产链霉素的灰色链霉菌，产卡 那霉素的卡那链霉菌都是以摇瓶液体培养法。孢子接入含液体培养基的摇瓶中， 在摇床上恒温振荡培养，生长出的菌丝体作为种子。 不产孢子的细菌，如生产谷氨酸的棒状杆菌属，短杆菌属，以32℃培养18~ 24小时的斜面移入250ml茄子瓶斜面培养基上，或摇瓶培养基上，32℃培养， 12小时后可接入种子罐。 生产啤酒的酵母菌一般保存在麦芽汁琼脂培养基斜面上，4℃冰箱保藏。3~ 4个月移种一次，再接种至10m1麦芽汁试管中，25~27℃保温培养2~3天后， 扩大至含250ml麦芽汁的500ml三角瓶或含500ml麦芽汁的1000ml三角瓶中。 25℃培养2天，再移至含5~10L麦芽汁的卡氏罐中，15~20℃培养3~5天， 再接入发酵罐，因是好氧性菌（菌体增殖期间），所以要通气。具体流程如下： 斜面+ 10m试管25-509二10m三角瓶255-10L麦芽汁 2-30(250ml-50m麦芽升)20 15发酵睡 二。生产车间种子制备 实验室制备的孢子斜面或摇瓶种子移接到种子罐进行扩大培养。种子罐培养 一方面使菌种获得足够的数量，另一方面种子罐中的培养基更接近发酵罐培养的 醪液成分和培养条件，譬如通无菌空气，搅拌形式等等，以使菌体适应发酵环境
一． 实验室种子制备 在砂土管或冷冻干燥管内保藏的菌种以无菌的方式接至适合的斜面培养基 上，培养成熟后挑选正常的菌落再接一次试管斜面。对那些产孢能力强、孢子发 芽生长繁殖快的菌种可以采取在固体培养基上培养的方法，孢子可直接接入种子 罐，从而简化了操作，减少了操作步骤，同时也减少了染菌的机会。例如生产青 霉素的产黄青霉菌，采用大米或小米作为固体培养基，取一定量装入 250ml 茄子 瓶中进行灭菌，米粒含水量一定要控制好，米粒不能粘也不能散，灭菌冷却后接 入孢子悬浮液，在 25～28℃ 培养 4～14 天。培养期间，还要经常翻动，保持通 气均匀。培养结束后，或接入种子罐，或以真空抽去水分至 10％以下，于 4℃冰 箱中保存备用。 对于产孢子能力不强或孢子发芽慢的菌种，如产链霉素的灰色链霉菌，产卡 那霉素的卡那链霉菌都是以摇瓶液体培养法。孢子接入含液体培养基的摇瓶中， 在摇床上恒温振荡培养，生长出的菌丝体作为种子。 不产孢子的细菌，如生产谷氨酸的棒状杆菌属，短杆菌属，以 32℃培养 18～ 24 小时的斜面移入 250ml 茄子瓶斜面培养基上，或摇瓶培养基上，32℃培养， 12 小时后可接入种子罐。 生产啤酒的酵母菌一般保存在麦芽汁琼脂培养基斜面上，4℃ 冰箱保藏。3～ 4 个月移种一次，再接种至 10ml 麦芽汁试管中，25～27℃ 保温培养 2～3 天后， 扩大至含 250ml 麦芽汁的 500ml 三角瓶或含 500ml 麦芽汁的 1000ml 三角瓶中。 25℃培养 2 天，再移至含 5～10L 麦芽汁的卡氏罐中，15～20℃ 培养 3～5 天， 再接入发酵罐，因是好氧性菌（菌体增殖期间），所以要通气。具体流程如下： 斜 面 10ml 试 管 25 27oc 2 3d 500 1000ml 三角 瓶 (250ml 500ml麦 芽 汁) 25 2d 5 10 L 麦 芽 汁 15 20 3 5d 发酵 罐 oc oc 二． 生产车间种子制备 实验室制备的孢子斜面或摇瓶种子移接到种子罐进行扩大培养。种子罐培养 一方面使菌种获得足够的数量，另一方面种子罐中的培养基更接近发酵罐培养的 醪液成分和培养条件，譬如通无菌空气，搅拌形式等等，以使菌体适应发酵环境
种子罐的接种方法一般根据菌种种类而异。孢子悬浮液一般用微孔接种法接种 摇瓶悬浮液种子可在火焰保护下接入种子罐，也可以用差压法接入。种子罐之间 或种子罐与发酵罐之间的移种，主要用差压法，通过种子接种管道进行移种，移 种过程中要防止接受罐表压降为零，因为无压会引起染菌。 1.种子罐级数的确定 种子罐的级数是指制备种子需逐级扩大培养的次数，这要根据菌种生长的特 性、孢子发芽速度和菌体繁殖速度，以及发酵罐的容积而定。对于生长快的细胞， 种子用量的比例少，即需要的接种量少，所以相应的种子罐也少。如谷氨酸生产 中，茄子瓶斜面或摇瓶种子接入种子罐于32℃培养7~10小时，菌体浓度达到 10~10°个/1，即可作为种子接入发酵罐，这称为一级种子罐扩大培养，也可 叫作二级发酵。生长较慢的菌种，如青霉素生产菌，就需要二级种子罐扩大培养 也可称为三级发酵。一般50m发酵罐都采取三级发酵。如果是实验室的中试(5~ 30L),可以通过直接孢子或菌体接入罐中发酵，即一级发酵。 种子罐级数越少，越有利于简化工艺，便于控制，而且可以减少多次移种可 能发生的染菌机会。当然，也要考虑尽可能地延长菌体在发酵罐中生产产物的时 间，缩短种子增殖的非生产时间，提高发酵罐的生产率（产物/ml·h)。 此外，种子罐的级数的减少也可通过改善工艺条件，改变种子培养条件，加 速菌体的增殖。 2。接种种龄和接种量 ①接种龄： 接种龄是指种子罐中培养的菌体从开始移入下一级种子罐或发酵罐时的培 养时间。在种子罐中，随着培养时间的延长，菌体量增加，基质消耗和代谢产物 积累，菌体量不再增加，逐渐老化。因此，选择适当的种龄接种量是一个至关重 要的因素。接种龄一般以菌体处于生长旺盛期，即对数生长期最合适。如果种子 过于年幼。接入发酵罐后，会出现前期生长缓慢，整个发酵周期拉长，产物开始 形成的时间推迟，而过老的种子也会出现使生产能力下降而使菌体自溶的现象。 对于不同菌种，不同产品品种，不同工艺条件，其接种龄也不相同，具体的 生产，接种龄要进行多次试验，从发酵产品产量的多少，即产率大小来确定最适 接种龄
种子罐的接种方法一般根据菌种种类而异。孢子悬浮液一般用微孔接种法接种， 摇瓶悬浮液种子可在火焰保护下接入种子罐，也可以用差压法接入。种子罐之间 或种子罐与发酵罐之间的移种，主要用差压法，通过种子接种管道进行移种，移 种过程中要防止接受罐表压降为零，因为无压会引起染菌。 1. 种子罐级数的确定 种子罐的级数是指制备种子需逐级扩大培养的次数，这要根据菌种生长的特 性、孢子发芽速度和菌体繁殖速度，以及发酵罐的容积而定。对于生长快的细胞， 种子用量的比例少，即需要的接种量少，所以相应的种子罐也少。如谷氨酸生产 中，茄子瓶斜面或摇瓶种子接入种子罐于 32℃培养 7～10 小时，菌体浓度达到 108～109 个/ml，即可作为种子接入发酵罐，这称为一级种子罐扩大培养，也可 叫作二级发酵。生长较慢的菌种，如青霉素生产菌，就需要二级种子罐扩大培养， 也可称为三级发酵。一般 50m3发酵罐都采取三级发酵。如果是实验室的中试（5～ 30L），可以通过直接孢子或菌体接入罐中发酵，即一级发酵。 种子罐级数越少，越有利于简化工艺，便于控制，而且可以减少多次移种可 能发生的染菌机会。当然，也要考虑尽可能地延长菌体在发酵罐中生产产物的时 间，缩短种子增殖的非生产时间，提高发酵罐的生产率（产物/ml·h）。 此外，种子罐的级数的减少也可通过改善工艺条件，改变种子培养条件，加 速菌体的增殖。 2. 接种种龄和接种量 ① 接种龄： 接种龄是指种子罐中培养的菌体从开始移入下一级种子罐或发酵罐时的培 养时间。在种子罐中，随着培养时间的延长，菌体量增加，基质消耗和代谢产物 积累，菌体量不再增加，逐渐老化。因此，选择适当的种龄接种量是一个至关重 要的因素。接种龄一般以菌体处于生长旺盛期，即对数生长期最合适。如果种子 过于年幼。接入发酵罐后，会出现前期生长缓慢，整个发酵周期拉长，产物开始 形成的时间推迟，而过老的种子也会出现使生产能力下降而使菌体自溶的现象。 对于不同菌种，不同产品品种，不同工艺条件，其接种龄也不相同，具体的 生产，接种龄要进行多次试验，从发酵产品产量的多少，即产率大小来确定最适 接种龄
②接种量 接种量指的是移入的种子悬浮液体积和接种后培养液体的体积的比例。抗生 素的工业生产，大多数发酵的最适接种量为7一15%或更多。啤酒生产发酵的接 种量为5~10%，谷氨酸发酵接种量仅为1%。 接种量大小取决于生产菌的生长繁殖速度。大接种量可以缩短发酵罐中菌体 数达到高峰的时间，可以提早形成产物。这是因为种子液中含有胞外水解酶类， 种子量大，酶量也多，有利于对基质的作用和利用，同时菌体量多，占有绝对生 长优势，可以相对减少杂菌的污染生长机会。但接种量太大，也会造成菌体生长 过速，溶氧跟不上，从而影响产物的合成。 3.种子质量的判断 由于菌种在种子罐中的培养时间较短，使种子的质量不容易控制，因为可分 析的参数不多。一般，在培养过程中要定期取样，测定其中的部分参数来观察基 质的代谢变化以及菌体形态是否正常。例如酒精酵母的种子罐，一般定时测酸度 变化、还原糖含量、耗糖率、镜检等，镜检内容包括测酵母细胞数、酵母出芽率、 酵母形态（整齐、大小均匀、椭圆形或圆形入、是否有杂闲等。 三.影响种子质量的因素 原材料质量 生产过程中有时会出现种子的质量不稳定现象，这主要是由于原材料的质量 不一致造成的。有些原材料如麸皮，是用来配制产孢子斜面培养基的。制备霉菌 培养基的大米、小米等会因产地、品种、加工方法及颗粒大小不同而使孢子质量 受到影响：蛋白胨、琼脂的质量、水质的硬度、污染程度等对生产均会产生不同 程度的影响。 2.培养条件 培养条件对种子质量的影响最直观，最显著。如培养温度高于或低于种子的 培养温度范围，会使菌种生长过快或过慢，造成菌体过早衰老自溶或拉长培养时 间，而影响生产。所以要控制菌体的培养温度在最适的范围内。湿度对产孢子的 菌种影响很大，这一湿度是指培养基的湿度，有时也包括空气湿度。如制白酒酒 曲时，空气湿度会影响曲中各种不同微生物的生长。在生产抗生素菌种时，孢子 就会受湿度的影响而使其生长快慢不一。通气量对于好气性菌体的生长和质量是
② 接种量 接种量指的是移入的种子悬浮液体积和接种后培养液体的体积的比例。抗生 素的工业生产，大多数发酵的最适接种量为 7～15％或更多。啤酒生产发酵的接 种量为 5～10％，谷氨酸发酵接种量仅为 1％。 接种量大小取决于生产菌的生长繁殖速度。大接种量可以缩短发酵罐中菌体 数达到高峰的时间，可以提早形成产物。这是因为种子液中含有胞外水解酶类， 种子量大，酶量也多，有利于对基质的作用和利用，同时菌体量多，占有绝对生 长优势，可以相对减少杂菌的污染生长机会。但接种量太大，也会造成菌体生长 过速，溶氧跟不上，从而影响产物的合成。 3. 种子质量的判断 由于菌种在种子罐中的培养时间较短，使种子的质量不容易控制，因为可分 析的参数不多。一般，在培养过程中要定期取样，测定其中的部分参数来观察基 质的代谢变化以及菌体形态是否正常。例如酒精酵母的种子罐，一般定时测酸度 变化、还原糖含量、耗糖率、镜检等，镜检内容包括测酵母细胞数、酵母出芽率、 酵母形态（整齐、大小均匀、椭圆形或圆形）、是否有杂菌等。 三． 影响种子质量的因素 1． 原材料质量 生产过程中有时会出现种子的质量不稳定现象，这主要是由于原材料的质量 不一致造成的。有些原材料如麸皮，是用来配制产孢子斜面培养基的。制备霉菌 培养基的大米、小米等会因产地、品种、加工方法及颗粒大小不同而使孢子质量 受到影响；蛋白胨、琼脂的质量、水质的硬度、污染程度等对生产均会产生不同 程度的影响。 2．培养条件 培养条件对种子质量的影响最直观，最显著。如培养温度高于或低于种子的 培养温度范围，会使菌种生长过快或过慢，造成菌体过早衰老自溶或拉长培养时 间，而影响生产。所以要控制菌体的培养温度在最适的范围内。湿度对产孢子的 菌种影响很大，这一湿度是指培养基的湿度，有时也包括空气湿度。如制白酒酒 曲时，空气湿度会影响曲中各种不同微生物的生长。在生产抗生素菌种时，孢子 就会受湿度的影响而使其生长快慢不一。通气量对于好气性菌体的生长和质量是
一个很重要的影响因素。有些菌种的通气量甚至可能影响到它们的代谢途径。如 酒精酵母，在通入足够的空气时会利用培养基中的糖合成自身细胞物质，而在通 气不足或完全不通气时，则使糖代谢进入无氧代谢(EMP)途径，合成酒精成分。 青霉素的菌种在培养时必须通过足够的空气，否则就会影响他们的数量和活力， 从而减少发酵液的产率。所以不同的菌种，对通气量的要求是不同的。 3.斜面保藏时间 斜面的保藏时间对菌种的质量具有一定的影响。如抗生素中土霉素生产菌的 孢子斜面在培养4天后放入4℃冰箱保藏，在7~8天时就开始自溶了，而培养 了5天后再冷藏，20天都未发生自溶。此外，冷藏时间过长会使菌体的活力下 降。 第二节种子质量的控制措施 种子质量的优劣是通过它在发酵罐中所表示的生产率体现的。因此必须保证 生产菌种的稳定性，在种子培养期间保证提供适宜的环境条件，保证无杂菌浸入， 从而获得优良的种子。 1.菌种稳定性的检查 生产中所用的菌种必须保持稳定的生产能力，不能有变异种。尽管变异的可 能性很小，但不能完全排除这一危险。所以，定期检查和挑选稳定菌株是必不可 少的一项工作。方法是：将保藏菌株溶于无菌的生理盐水中，逐级稀释，然后在 培养皿琼脂固体培养基上划线培养，长出菌落，选择形态优良的菌落接入三角瓶 进行液体摇瓶培养，检测出生产率高的菌种备用。 这一分离方法适用于所有的保藏菌种，并且一年左右必须做一次。 2. 杂菌检查 在种子制备过程中，每移种一次都需要进行杂菌检查。一般的方法是：显微 镜观察，或平板培养试验，即将种子液涂在平板培养皿上划线培养，观察有无异 常菌落，定时检查，防止漏检。此外，也可对种子液的生化特性进行分析，如取 样测其营养消耗速度、pH变化、溶氧利用情况、色泽、气味是否异常等等
一个很重要的影响因素。有些菌种的通气量甚至可能影响到它们的代谢途径。如 酒精酵母，在通入足够的空气时会利用培养基中的糖合成自身细胞物质，而在通 气不足或完全不通气时，则使糖代谢进入无氧代谢（EMP）途径，合成酒精成分。 青霉素的菌种在培养时必须通过足够的空气，否则就会影响他们的数量和活力， 从而减少发酵液的产率。所以不同的菌种，对通气量的要求是不同的。 3．斜面保藏时间 斜面的保藏时间对菌种的质量具有一定的影响。如抗生素中土霉素生产菌的 孢子斜面在培养 4 天后放入 4℃冰箱保藏，在 7～8 天时就开始自溶了，而培养 了 5 天后再冷藏，20 天都未发生自溶。此外，冷藏时间过长会使菌体的活力下 降。 第二节 种子质量的控制措施 种子质量的优劣是通过它在发酵罐中所表示的生产率体现的。因此必须保证 生产菌种的稳定性，在种子培养期间保证提供适宜的环境条件，保证无杂菌浸入， 从而获得优良的种子。 1. 菌种稳定性的检查 生产中所用的菌种必须保持稳定的生产能力，不能有变异种。尽管变异的可 能性很小，但不能完全排除这一危险。所以，定期检查和挑选稳定菌株是必不可 少的一项工作。方法是：将保藏菌株溶于无菌的生理盐水中，逐级稀释，然后在 培养皿琼脂固体培养基上划线培养，长出菌落，选择形态优良的菌落接入三角瓶 进行液体摇瓶培养，检测出生产率高的菌种备用。 这一分离方法适用于所有的保藏菌种，并且一年左右必须做一次。 2． 杂菌检查 在种子制备过程中，每移种一次都需要进行杂菌检查。一般的方法是：显微 镜观察，或平板培养试验，即将种子液涂在平板培养皿上划线培养，观察有无异 常菌落，定时检查，防止漏检。此外，也可对种子液的生化特性进行分析，如取 样测其营养消耗速度、pH 变化、溶氧利用情况、色泽、气味是否异常等等