实验四 植物中超氧化物歧化酶（SOD）的分离纯化 一、实验目的 1 通过超氧化物歧化酶的分离纯化，了解有机溶剂沉淀蛋白质以及纤维素离子交换柱层 析方法的原理。 2 掌握测定超氧化物歧化酶活性和比活力的方法。 二、实验原理 （一）SOD 的性质 超氧化物歧化酶(superoxide dismutase)简称 SOD，是一种生物活性蛋白质，是人体不 可缺少、重要的氧自由清除剂，也是目前为止发现的唯一的以自由基为底物的酶。 SOD 金属蛋白酶，对 pH、热和蛋白酶水解等反应比一般酶稳定。 它广泛存在于各类生物体内，按其所含金属离子的不同，可分为 3 种：铜锌超氧化物歧 化酶(Cu·Zn—SOD)、锰超氧化物歧化酶(Mn—SOD)和铁超氧化物歧化酶(Fe—SOD)。 SOD 催化如下反应： O2 - + O2 - +2H+一 H202+O2 （二）SOD 的分离提取 蛋白质包括酶的分离纯化方法很多，主要有：①根据蛋白质溶解度不同的分离方法，蛋 白质的盐析、等电点沉淀法、低温有机溶剂沉淀法；②根据蛋白质分子大小的差别的分离方 法，透析与超滤、凝胶过滤法；③根据蛋白质带电性质进行分离，电泳法、离子交换层析法。 ④根据配体特异性的分离方法－亲和色谱法。 1、酶的提取纯化：在分离制备时首先将植物细胞破碎，用提取液制备粗酶液。经加热 变性、有机溶剂沉淀除去大量杂蛋白，再用 DEAE-纤维素柱层析或 DEAE-葡聚糖柱层析纯化， 可得到更纯的酶。经过以上分离纯化步骤后，酶可提纯 100 倍以上。 大部分酶都可溶于水、稀盐、稀酸或碱溶液，少数与脂类结合的蛋白质则溶于乙醇、 丙酮、丁醇等有机溶剂中，因此，可采用水溶液提取分离和纯化酶。稀盐和缓冲系统的水溶 液对酶稳定性好、溶解度大,是提取酶最常用的溶剂，通常用量是原材料体积的 1-5 倍，提 取时需要均匀的搅拌，以利于酶的溶解。提取的温度要视有效成份性质而定。一方面，多数 酶的溶解度随着温度的升高而增大，因此，温度高利于溶解，缩短提取时间。但另一方面， 温度升高会使酶变性失活，因此，基于这一点考虑提取酶时一般采用低温（5℃以下）操作。 由于 SOD 是金属酶,其金属离子对热有稳定的影响,所以 SOD 对热比较稳定.一般情况 下,SOD 表现出短时间的耐热性能,据资料报道当反应温度为 88℃,时间为 15-30 分钟时对酶 活性的影响不大.而一般杂蛋白在 55℃以上时就容易变性。因此，采用热击变性法对粗酶进 行处理,以除去一部分杂蛋白。 极性有机溶剂能引起蛋白质脱去水化层，并降低介电常数而增加带电质点间的相互作 用，致使蛋白质颗粒凝集而沉淀。采用这种方法沉淀蛋白质时，要求在低温下操作，并且需 要尽量缩短处理时间，避免蛋白质变性。为此选用低温有机溶剂沉淀法进一步纯化酶 。 Cu·Zn-SOD 的 pI 为 6.8，将上一步收集的 SOD 丙酮沉淀物溶于蒸馏水中，在 pH7.8 的
实验四 植物中超氧化物歧化酶（SOD）的分离纯化 一、实验目的 1 通过超氧化物歧化酶的分离纯化，了解有机溶剂沉淀蛋白质以及纤维素离子交换柱层 析方法的原理。 2 掌握测定超氧化物歧化酶活性和比活力的方法。 二、实验原理 （一）SOD 的性质 超氧化物歧化酶(superoxide dismutase)简称 SOD，是一种生物活性蛋白质，是人体不 可缺少、重要的氧自由清除剂，也是目前为止发现的唯一的以自由基为底物的酶。 SOD 金属蛋白酶，对 pH、热和蛋白酶水解等反应比一般酶稳定。 它广泛存在于各类生物体内，按其所含金属离子的不同，可分为 3 种：铜锌超氧化物歧 化酶(Cu·Zn—SOD)、锰超氧化物歧化酶(Mn—SOD)和铁超氧化物歧化酶(Fe—SOD)。 SOD 催化如下反应： O2 - + O2 - +2H+一 H202+O2 （二）SOD 的分离提取 蛋白质包括酶的分离纯化方法很多，主要有：①根据蛋白质溶解度不同的分离方法，蛋 白质的盐析、等电点沉淀法、低温有机溶剂沉淀法；②根据蛋白质分子大小的差别的分离方 法，透析与超滤、凝胶过滤法；③根据蛋白质带电性质进行分离，电泳法、离子交换层析法。 ④根据配体特异性的分离方法－亲和色谱法。 1、酶的提取纯化：在分离制备时首先将植物细胞破碎，用提取液制备粗酶液。经加热 变性、有机溶剂沉淀除去大量杂蛋白，再用 DEAE-纤维素柱层析或 DEAE-葡聚糖柱层析纯化， 可得到更纯的酶。经过以上分离纯化步骤后，酶可提纯 100 倍以上。 大部分酶都可溶于水、稀盐、稀酸或碱溶液，少数与脂类结合的蛋白质则溶于乙醇、 丙酮、丁醇等有机溶剂中，因此，可采用水溶液提取分离和纯化酶。稀盐和缓冲系统的水溶 液对酶稳定性好、溶解度大,是提取酶最常用的溶剂，通常用量是原材料体积的 1-5 倍，提 取时需要均匀的搅拌，以利于酶的溶解。提取的温度要视有效成份性质而定。一方面，多数 酶的溶解度随着温度的升高而增大，因此，温度高利于溶解，缩短提取时间。但另一方面， 温度升高会使酶变性失活，因此，基于这一点考虑提取酶时一般采用低温（5℃以下）操作。 由于 SOD 是金属酶,其金属离子对热有稳定的影响,所以 SOD 对热比较稳定.一般情况 下,SOD 表现出短时间的耐热性能,据资料报道当反应温度为 88℃,时间为 15-30 分钟时对酶 活性的影响不大.而一般杂蛋白在 55℃以上时就容易变性。因此，采用热击变性法对粗酶进 行处理,以除去一部分杂蛋白。 极性有机溶剂能引起蛋白质脱去水化层，并降低介电常数而增加带电质点间的相互作 用，致使蛋白质颗粒凝集而沉淀。采用这种方法沉淀蛋白质时，要求在低温下操作，并且需 要尽量缩短处理时间，避免蛋白质变性。为此选用低温有机溶剂沉淀法进一步纯化酶 。 Cu·Zn-SOD 的 pI 为 6.8，将上一步收集的 SOD 丙酮沉淀物溶于蒸馏水中，在 pH7.8 的
条件下，Cu·Zn—SOD 带负电，过 DEAE—32 纤维素阴离子交换柱可得到进一步纯化。 离子交换层析是依据各种离子或离子化合物与离子交换剂的结合力不同而进行分离纯 化的。离子交换层析的固定相是离子交换剂，它是由一类不溶于水的惰性高分子聚合物基质 通过一定的化学反应共价结合上某种电荷基团形成的。离子交换剂可以分为三部分：高分子 聚合物基质、电荷基团和平衡离子。电荷基团与高分子聚合物共价结合，形成一个带电的可 进行离子交换的基团。平衡离子是结合于电荷基团上的相反离子，它能与溶液中其它的离子 基团发生可逆的交换反应。平衡离子带正电的离子交换剂能与带正电的离子基团发生交换作 用，称为阳离子交换剂；平衡离子带负电的离子交换剂与带负电的离子基团发生交换作用， 称为阴离子交换剂。 离子交换剂有阳离子交换剂（如：羧甲基纤维素；CM-纤维素）和阴离子交换剂（二乙 氨基乙基纤维素；DEAE-纤维素），当被分离的蛋白质溶液流经离子交换层析柱时，带有与离 子交换剂相反电荷的蛋白质被吸附在离子交换剂上，随后用改变 pH 或离子强度办法将吸附 的蛋白质洗脱下来。 离子交换柱层析基本装置及操作方法 1）柱层析的基本装置 柱层析的基本装置示意图如图 3－3 所示： 2）柱层析的基本操作 柱层析的基本操作包括以下一些步骤： ⑴ 装柱
条件下，Cu·Zn—SOD 带负电，过 DEAE—32 纤维素阴离子交换柱可得到进一步纯化。 离子交换层析是依据各种离子或离子化合物与离子交换剂的结合力不同而进行分离纯 化的。离子交换层析的固定相是离子交换剂，它是由一类不溶于水的惰性高分子聚合物基质 通过一定的化学反应共价结合上某种电荷基团形成的。离子交换剂可以分为三部分：高分子 聚合物基质、电荷基团和平衡离子。电荷基团与高分子聚合物共价结合，形成一个带电的可 进行离子交换的基团。平衡离子是结合于电荷基团上的相反离子，它能与溶液中其它的离子 基团发生可逆的交换反应。平衡离子带正电的离子交换剂能与带正电的离子基团发生交换作 用，称为阳离子交换剂；平衡离子带负电的离子交换剂与带负电的离子基团发生交换作用， 称为阴离子交换剂。 离子交换剂有阳离子交换剂（如：羧甲基纤维素；CM-纤维素）和阴离子交换剂（二乙 氨基乙基纤维素；DEAE-纤维素），当被分离的蛋白质溶液流经离子交换层析柱时，带有与离 子交换剂相反电荷的蛋白质被吸附在离子交换剂上，随后用改变 pH 或离子强度办法将吸附 的蛋白质洗脱下来。 离子交换柱层析基本装置及操作方法 1）柱层析的基本装置 柱层析的基本装置示意图如图 3－3 所示： 2）柱层析的基本操作 柱层析的基本操作包括以下一些步骤： ⑴ 装柱
柱子装的质量好与差，是柱层析法能否成功分离纯化物质的关键步骤之一。一般要求 柱子装的要均匀，不能分层，柱子中不能有气泡等。否则要重新装柱。 首先选好柱子，根据层析的基质和分离目的而定。一般柱子的直径与长度比为 1:10~50； 凝胶柱可以选 1:100~200，同时将柱子洗涤干净。 将层析用的基质（如吸附剂、树脂、凝胶等）在适当的溶剂或缓冲液中溶胀，加适量 1mol／L NaOH 溶液，搅匀后放置 15min，用 G3 烧结漏斗抽滤，水洗至中性，滤饼悬浮于 1mol ／L HCl 溶液中，搅匀后放置 10min 后用 Gl 烧结漏斗抽滤，水洗至中性，滤饼再悬浮于 1mol ／L NaOH 溶液中，抽滤，水洗至中性，并真空抽气（吸附剂等与溶液混合在一起），以除 去其内部的气泡。最后将滤饼悬浮于层析柱平衡缓冲液中待用。 关闭层析柱出水口，并装入 1/3 柱高的缓冲液，并将处理好的吸附剂等缓慢 地倒入柱中，使其沉降约 3cm 高。 打开出水口，控制适当流速，使吸附剂等均匀沉降，并不断加入吸附剂溶液。（吸附 剂的多少根据分离样品的多少而定。）注意不能干柱、分层，否则必须重新装柱。 最后使柱中基质表面平坦并在表面上留有 2~3cm 高的缓冲液，同时关闭出水口。（可 采用机械化装柱法） ⑵ 平衡 柱子装好后，要用用 pH7.8，2.5mmol／L 磷酸钠缓冲液作层析柱平衡液平衡柱子。用 恒流泵在恒定压力下走柱子（平衡与洗脱时的压力尽可能保持相同）。平衡液体积一般为 3~5 倍柱床体积，以保证平衡后柱床体积稳定及基质充分平衡。如果需要，可用兰色葡聚糖 2000 在恒压下走柱，如色带均匀下降，则说明柱子是均匀的。有时柱子平衡好后，还要进 行转型处理。 ⑶ 加样 加样量的多少直接影响分离的效果。一般讲，加样量尽量少些，分离效果比较好。通 常加样量应少于 20%的操作容量，体积应低于 5%的床体积，对于分析性柱层析，一般不超过 床体积的 1%。当然，最大加样量必须在具体条件下多次试验后才能决定。 应注意的是，加样时应缓慢小心地将样品溶液加到固定相表面，尽量避免冲击基质， 以保持基质表面平坦。 ⑷ 洗脱、收集、鉴定 洗脱条件的选择，也是影响层析效果的重要因素。当我们选定好洗脱液后，洗脱的方 式可分为简单洗脱、分步洗脱和梯度洗脱三种。 简单洗脱：柱子始终用同样的一种溶剂洗脱，直到层析分离过程结束为止。如果被分 离物质对固定相的亲合力差异不大，其区带的洗脱时间间隔（或洗脱体积间隔）也不长，采 用这种方法是适宜的。但选择的溶剂必须很合适方能使各组分的分配系数较大。否则应采用 下面的方法
柱子装的质量好与差，是柱层析法能否成功分离纯化物质的关键步骤之一。一般要求 柱子装的要均匀，不能分层，柱子中不能有气泡等。否则要重新装柱。 首先选好柱子，根据层析的基质和分离目的而定。一般柱子的直径与长度比为 1:10~50； 凝胶柱可以选 1:100~200，同时将柱子洗涤干净。 将层析用的基质（如吸附剂、树脂、凝胶等）在适当的溶剂或缓冲液中溶胀，加适量 1mol／L NaOH 溶液，搅匀后放置 15min，用 G3 烧结漏斗抽滤，水洗至中性，滤饼悬浮于 1mol ／L HCl 溶液中，搅匀后放置 10min 后用 Gl 烧结漏斗抽滤，水洗至中性，滤饼再悬浮于 1mol ／L NaOH 溶液中，抽滤，水洗至中性，并真空抽气（吸附剂等与溶液混合在一起），以除 去其内部的气泡。最后将滤饼悬浮于层析柱平衡缓冲液中待用。 关闭层析柱出水口，并装入 1/3 柱高的缓冲液，并将处理好的吸附剂等缓慢 地倒入柱中，使其沉降约 3cm 高。 打开出水口，控制适当流速，使吸附剂等均匀沉降，并不断加入吸附剂溶液。（吸附 剂的多少根据分离样品的多少而定。）注意不能干柱、分层，否则必须重新装柱。 最后使柱中基质表面平坦并在表面上留有 2~3cm 高的缓冲液，同时关闭出水口。（可 采用机械化装柱法） ⑵ 平衡 柱子装好后，要用用 pH7.8，2.5mmol／L 磷酸钠缓冲液作层析柱平衡液平衡柱子。用 恒流泵在恒定压力下走柱子（平衡与洗脱时的压力尽可能保持相同）。平衡液体积一般为 3~5 倍柱床体积，以保证平衡后柱床体积稳定及基质充分平衡。如果需要，可用兰色葡聚糖 2000 在恒压下走柱，如色带均匀下降，则说明柱子是均匀的。有时柱子平衡好后，还要进 行转型处理。 ⑶ 加样 加样量的多少直接影响分离的效果。一般讲，加样量尽量少些，分离效果比较好。通 常加样量应少于 20%的操作容量，体积应低于 5%的床体积，对于分析性柱层析，一般不超过 床体积的 1%。当然，最大加样量必须在具体条件下多次试验后才能决定。 应注意的是，加样时应缓慢小心地将样品溶液加到固定相表面，尽量避免冲击基质， 以保持基质表面平坦。 ⑷ 洗脱、收集、鉴定 洗脱条件的选择，也是影响层析效果的重要因素。当我们选定好洗脱液后，洗脱的方 式可分为简单洗脱、分步洗脱和梯度洗脱三种。 简单洗脱：柱子始终用同样的一种溶剂洗脱，直到层析分离过程结束为止。如果被分 离物质对固定相的亲合力差异不大，其区带的洗脱时间间隔（或洗脱体积间隔）也不长，采 用这种方法是适宜的。但选择的溶剂必须很合适方能使各组分的分配系数较大。否则应采用 下面的方法
分步洗脱：这种方法按照递增洗脱能力顺序排列的几种洗脱液，进行逐级洗脱。它主 要对混合物组成简单、各组分性质差异较大或需快速分离时适用。每次用一种洗脱液将其中 一种组分快速洗脱下来。 梯度洗脱：当混合物中组分复杂且性质差异较小时，一般采用梯度洗脱。它的洗脱能 力是逐步连续增加的，梯度可以指浓度、极性、离子强度或 pH 值等。最常用的是浓度梯度。 在水溶液中，亦即离子强度梯度。 当对所分离的混合物的性质了解较少时，一般先采用线性梯度洗脱的方式去尝试，但梯 度的斜率要小一些，尽管洗脱时间较长，但对性质相近的组分分离更为有利。 同时还应注意洗脱时的速率。前面我们已经谈到，流速的快慢将影响理论塔板高度，从 而影响分辨率。事实上，速度太快，各组分在固液两相中平衡时间短，相互分不开，仍以混 合组分流出。速度太慢，将增大物质的扩散，同样达不到理想的分离效果。只有多次试验才 会得到合适的流速。总之，我们必须经过反复的试验与调整（可以用正交试验或优选法）， 才能得到最佳的洗脱条件。还应强调的一点是，在整个洗脱过程中，千万不能干柱，否则分 离纯化将会前功尽弃。 在生化实验中，基本上我们都是采用部分收集器来收集分离纯化的样品。由于检测系统 的分辨率有限，洗脱峰不一定能代表一个纯净的组分。因此，每管的收集量不能太多，一般 1ml-5ml / 管。如果分离的物质性质很相近，可低至 0.5ml / 管。这视具体情况而定。在 合并一个峰的各管溶液之前，还要进行鉴定。例如，一个蛋白峰的各管溶液，我们要先用电 泳法对各管进行鉴定。对于是单条带的，认为已达电泳纯，合并在一起。其他的另行处理。 对于不同种类的物质采用相应的鉴定方法，在这里不再叙述。最后，为了保持所得产品的稳 定性与生物活性，我们一般采用透析除盐、超滤或减压薄膜浓缩，再冰冻干燥，得到干粉， 在低温下保存备用。 用 pH7.8，2.5mmol／L(100mL)一 200mmol／L(100mL)的磷酸钠缓冲液进行梯度洗脱。流 速 1mL／min，每管收集 3mL。测定洗脱液的蛋白质含量和酶活，并绘制曲线（用紫外分光光 度计测各管的 OD 280 ， OD 280 数值高的管进行酶活测定 ）。 ⑹ 基质（吸附剂、交换树脂或凝胶等）的再生 许多基质（吸附剂、交换树脂或凝胶等）可以反复使用多次，而且价格昂贵，所以层析 后要回收处理，以备再用，严禁乱倒乱扔。这也是一个科研工作者的科学作风问题。 2、植物组织 SOD 活性测定：超氧化物歧化酶活性测定的方法有多种，其中以化学法应 用 O − 2 ·最为普遍。化学测定法包括两个方面：一方面是产生超氧自由基， 如黄嘌呤氧化酶起作用时会产生 O − 2 ，肾上腺素自氧化和邻苯三酚在碱性条件下自
分步洗脱：这种方法按照递增洗脱能力顺序排列的几种洗脱液，进行逐级洗脱。它主 要对混合物组成简单、各组分性质差异较大或需快速分离时适用。每次用一种洗脱液将其中 一种组分快速洗脱下来。 梯度洗脱：当混合物中组分复杂且性质差异较小时，一般采用梯度洗脱。它的洗脱能 力是逐步连续增加的，梯度可以指浓度、极性、离子强度或 pH 值等。最常用的是浓度梯度。 在水溶液中，亦即离子强度梯度。 当对所分离的混合物的性质了解较少时，一般先采用线性梯度洗脱的方式去尝试，但梯 度的斜率要小一些，尽管洗脱时间较长，但对性质相近的组分分离更为有利。 同时还应注意洗脱时的速率。前面我们已经谈到，流速的快慢将影响理论塔板高度，从 而影响分辨率。事实上，速度太快，各组分在固液两相中平衡时间短，相互分不开，仍以混 合组分流出。速度太慢，将增大物质的扩散，同样达不到理想的分离效果。只有多次试验才 会得到合适的流速。总之，我们必须经过反复的试验与调整（可以用正交试验或优选法）， 才能得到最佳的洗脱条件。还应强调的一点是，在整个洗脱过程中，千万不能干柱，否则分 离纯化将会前功尽弃。 在生化实验中，基本上我们都是采用部分收集器来收集分离纯化的样品。由于检测系统 的分辨率有限，洗脱峰不一定能代表一个纯净的组分。因此，每管的收集量不能太多，一般 1ml-5ml / 管。如果分离的物质性质很相近，可低至 0.5ml / 管。这视具体情况而定。在 合并一个峰的各管溶液之前，还要进行鉴定。例如，一个蛋白峰的各管溶液，我们要先用电 泳法对各管进行鉴定。对于是单条带的，认为已达电泳纯，合并在一起。其他的另行处理。 对于不同种类的物质采用相应的鉴定方法，在这里不再叙述。最后，为了保持所得产品的稳 定性与生物活性，我们一般采用透析除盐、超滤或减压薄膜浓缩，再冰冻干燥，得到干粉， 在低温下保存备用。 用 pH7.8，2.5mmol／L(100mL)一 200mmol／L(100mL)的磷酸钠缓冲液进行梯度洗脱。流 速 1mL／min，每管收集 3mL。测定洗脱液的蛋白质含量和酶活，并绘制曲线（用紫外分光光 度计测各管的 OD 280 ， OD 280 数值高的管进行酶活测定 ）。 ⑹ 基质（吸附剂、交换树脂或凝胶等）的再生 许多基质（吸附剂、交换树脂或凝胶等）可以反复使用多次，而且价格昂贵，所以层析 后要回收处理，以备再用，严禁乱倒乱扔。这也是一个科研工作者的科学作风问题。 2、植物组织 SOD 活性测定：超氧化物歧化酶活性测定的方法有多种，其中以化学法应 用 O − 2 ·最为普遍。化学测定法包括两个方面：一方面是产生超氧自由基， 如黄嘌呤氧化酶起作用时会产生 O − 2 ，肾上腺素自氧化和邻苯三酚在碱性条件下自
氧化都会产生 O − 2 .；另一方面是对 O − 2 ·的检测，多数是利用反应液中能与 O − 2 ·起作用，并 易于被检测的指示物质的浓度变化来测定 SOD 活性。常用的方法有：黄嘌呤-黄嘌呤氧化酶- 细胞色素 C 法，邻苯三酚自氧化法，超氧化钾直接滴定法，氯化硝基氮蓝四唑-核黄素法。 可采用氮蓝四唑(NBT)光还原法。在该反应系统中，核黄素照光产生 02 -，NBT 在光照下 被 02 -还原为蓝甲月替，产物在 560nm 下有吸收峰。通过测定加入酶液后蓝甲月替含量的变 化，可计算出 SOD 的活性。 3、分析方法 蛋白质含量测定：采用紫外线吸收法。 酶纯度用比活力表示。比活力=酶活/蛋白质含量。 三、设备 高速组织捣拌机、电热鼓风干燥箱、LD4-40 离心机、酸度计、恒温水浴锅、天平、冷 冻离心机、可见分光光度计、微量进样器、自动部分收集器、TH-梯度混合器、HL-IS 恒流 泵、紫外可见分光光度计、层析柱、光照箱 四、材料、试剂 1、圆葱 2、硫酸钠（1%）、硝酸钠（1%）、三氯乙酸（0.5%）、乙醇（5%）、乙醚（5%）、无水碳 酸钠、NaOH、CuSO4、酒石酸钠钾、钨酸钠（Na2WO4·2H2O）、钼酸钠（Na2MoO4·2H2O）磷酸溶 液、浓盐酸。硫酸锂、液体溴、NaOH 标准溶液、酚酞、标准牛血清蛋白、Na2HPO4.12H2O、 NaH2PO4.2H2O 氯化硝基氮蓝四唑、乙二胺四乙酸二钠、 核黄素、dl-甲硫氨酸、丙酮（0.5%） 0.5mmol/L NaCl、1mol／L HCl 溶液、1mol／L NaOH 溶液 3、溶剂配制 ⑴50mmol/L PBS 溶液(pH=7.8): ①取 17.9070gNa2HPO4.12H2O 定容至 1000ml; ②取 1.9501gNaH2PO4.2H2O 定容至 250ml.用②滴定①pH 至=7.8,即为 50mmol/L 磷酸缓冲溶液. ⑵2.25mmol/L NBT 溶液:取 0.1840g 氯化硝基氮蓝四唑用 pH 为 7.8 的 50mmol/L PBS
氧化都会产生 O − 2 .；另一方面是对 O − 2 ·的检测，多数是利用反应液中能与 O − 2 ·起作用，并 易于被检测的指示物质的浓度变化来测定 SOD 活性。常用的方法有：黄嘌呤-黄嘌呤氧化酶- 细胞色素 C 法，邻苯三酚自氧化法，超氧化钾直接滴定法，氯化硝基氮蓝四唑-核黄素法。 可采用氮蓝四唑(NBT)光还原法。在该反应系统中，核黄素照光产生 02 -，NBT 在光照下 被 02 -还原为蓝甲月替，产物在 560nm 下有吸收峰。通过测定加入酶液后蓝甲月替含量的变 化，可计算出 SOD 的活性。 3、分析方法 蛋白质含量测定：采用紫外线吸收法。 酶纯度用比活力表示。比活力=酶活/蛋白质含量。 三、设备 高速组织捣拌机、电热鼓风干燥箱、LD4-40 离心机、酸度计、恒温水浴锅、天平、冷 冻离心机、可见分光光度计、微量进样器、自动部分收集器、TH-梯度混合器、HL-IS 恒流 泵、紫外可见分光光度计、层析柱、光照箱 四、材料、试剂 1、圆葱 2、硫酸钠（1%）、硝酸钠（1%）、三氯乙酸（0.5%）、乙醇（5%）、乙醚（5%）、无水碳 酸钠、NaOH、CuSO4、酒石酸钠钾、钨酸钠（Na2WO4·2H2O）、钼酸钠（Na2MoO4·2H2O）磷酸溶 液、浓盐酸。硫酸锂、液体溴、NaOH 标准溶液、酚酞、标准牛血清蛋白、Na2HPO4.12H2O、 NaH2PO4.2H2O 氯化硝基氮蓝四唑、乙二胺四乙酸二钠、 核黄素、dl-甲硫氨酸、丙酮（0.5%） 0.5mmol/L NaCl、1mol／L HCl 溶液、1mol／L NaOH 溶液 3、溶剂配制 ⑴50mmol/L PBS 溶液(pH=7.8): ①取 17.9070gNa2HPO4.12H2O 定容至 1000ml; ②取 1.9501gNaH2PO4.2H2O 定容至 250ml.用②滴定①pH 至=7.8,即为 50mmol/L 磷酸缓冲溶液. ⑵2.25mmol/L NBT 溶液:取 0.1840g 氯化硝基氮蓝四唑用 pH 为 7.8 的 50mmol/L PBS
溶液定容至 100ml. ⑶ 0.003mmol/L EDTA:取 0.0011g 乙二胺四乙酸二钠用 pH 为 7.8 的 50mmol/L PBS 溶 液定容至 1000ml. ⑷60mmol/L 核黄素:取0.0023g核黄素用pH为7.8的50mmol/L PBS溶液定容至100ml. ⑸14.5mmol/L dl-甲硫氨酸:取 0.2163gdl-甲硫氨酸用水定容至 100ml. ⑹1mg/ml 标准牛血清蛋白:准确称取 0.05g 牛血清蛋白定容至 50ml。 ⑺pH7.8，2.0mmol／L 的磷酸钠缓冲液： A 液：2.0mmol／L 磷酸钠（NaH2PO4.H2O 0.287g 定容至 1000ml） B 液：2.0mmol／L 磷酸氢二钠(Na2HPO4.12H2O 0.711g 定容至 1000ml) 按表 1 方法配制不同 pH 值缓冲溶液，取 A 液 x ml 和 B 液 y ml，稀释成 200ml 溶液备 用。 表 1 不同 pH 值缓冲溶液配制 pH X ml Y ml 7.8 8.5 91.5 ⑻pH7.8，200mmol／L 的磷酸钠缓冲液： A 液：0.2mol／L 磷酸钠（NaH2PO4.H2O 28.70g 定容至 1000ml） B 液：0.2mol／L 磷酸氢二钠(Na2HPO4.12H2O 71.1g 定容至 1000ml) 按表 1 方法配制不同 pH 值缓冲溶液，取 A 液 xml 和 B 液 yml，稀释成 200ml 溶液备用。 表 2 不同 pH 值缓冲溶液配制 pH X ml Yml 7.8 8.5 91.5 五、实验步骤 （一）酶的制备 1、粗酶液的提取 将圆葱切至 3cm 左右见方的小块,放入高速组织捣拌机中,捣碎 3-5 分钟,以 0.5 倍的 0.5mmol/LNaCl 于 4℃下浸泡过夜。然后 5000 转/分钟冷冻离心，20 分钟,弃去沉淀,留取上 清液,即为 SOD 抽提液.留样 5ml 测定其酶活和蛋白质含量。注意：冷冻离心瓶相对位置应配 平。 2、热变性 将粗酶液在 55℃下进行处理 30 分钟，然后高速冷冻离心，5000 转/分钟,20 分钟,弃去 沉淀,留取上清液，留样 5ml 测定其酶活和蛋白质含量。 3、丙酮分级沉淀 取经热击处理后的上清液，缓慢加入冷丙酮量为 0.4V/V，然后在冰浴条件下搅拌，冰 浴 2 小时。5000 转/分钟高速冷冻离心，20 分钟，弃去上清夜，沉淀用 5 倍 2.5mmol/L 的磷 酸缓冲溶液溶解，留样 2ml 测定其酶活和蛋白质含量。（此时去除杂蛋白的效果最好。）
溶液定容至 100ml. ⑶ 0.003mmol/L EDTA:取 0.0011g 乙二胺四乙酸二钠用 pH 为 7.8 的 50mmol/L PBS 溶 液定容至 1000ml. ⑷60mmol/L 核黄素:取0.0023g核黄素用pH为7.8的50mmol/L PBS溶液定容至100ml. ⑸14.5mmol/L dl-甲硫氨酸:取 0.2163gdl-甲硫氨酸用水定容至 100ml. ⑹1mg/ml 标准牛血清蛋白:准确称取 0.05g 牛血清蛋白定容至 50ml。 ⑺pH7.8，2.0mmol／L 的磷酸钠缓冲液： A 液：2.0mmol／L 磷酸钠（NaH2PO4.H2O 0.287g 定容至 1000ml） B 液：2.0mmol／L 磷酸氢二钠(Na2HPO4.12H2O 0.711g 定容至 1000ml) 按表 1 方法配制不同 pH 值缓冲溶液，取 A 液 x ml 和 B 液 y ml，稀释成 200ml 溶液备 用。 表 1 不同 pH 值缓冲溶液配制 pH X ml Y ml 7.8 8.5 91.5 ⑻pH7.8，200mmol／L 的磷酸钠缓冲液： A 液：0.2mol／L 磷酸钠（NaH2PO4.H2O 28.70g 定容至 1000ml） B 液：0.2mol／L 磷酸氢二钠(Na2HPO4.12H2O 71.1g 定容至 1000ml) 按表 1 方法配制不同 pH 值缓冲溶液，取 A 液 xml 和 B 液 yml，稀释成 200ml 溶液备用。 表 2 不同 pH 值缓冲溶液配制 pH X ml Yml 7.8 8.5 91.5 五、实验步骤 （一）酶的制备 1、粗酶液的提取 将圆葱切至 3cm 左右见方的小块,放入高速组织捣拌机中,捣碎 3-5 分钟,以 0.5 倍的 0.5mmol/LNaCl 于 4℃下浸泡过夜。然后 5000 转/分钟冷冻离心，20 分钟,弃去沉淀,留取上 清液,即为 SOD 抽提液.留样 5ml 测定其酶活和蛋白质含量。注意：冷冻离心瓶相对位置应配 平。 2、热变性 将粗酶液在 55℃下进行处理 30 分钟，然后高速冷冻离心，5000 转/分钟,20 分钟,弃去 沉淀,留取上清液，留样 5ml 测定其酶活和蛋白质含量。 3、丙酮分级沉淀 取经热击处理后的上清液，缓慢加入冷丙酮量为 0.4V/V，然后在冰浴条件下搅拌，冰 浴 2 小时。5000 转/分钟高速冷冻离心，20 分钟，弃去上清夜，沉淀用 5 倍 2.5mmol/L 的磷 酸缓冲溶液溶解，留样 2ml 测定其酶活和蛋白质含量。（此时去除杂蛋白的效果最好。）
4、DEAE-纤维素柱层析 取经过丙酮沉淀后溶解的上清夜，稀释 10 倍，过 DEAE-纤维素柱（2.6mm*40mm）。先用 2.5mmol/LpH7.8 磷酸缓冲溶液平衡 3-4 个床体积,上样量为 1 毫升，继续用 2.5mmol/LPH7.8 磷酸缓冲溶液冲洗 120ml,然后再分别用 2.5-250mmol/L, pH 为 7.8 的磷酸缓冲液梯度洗脱， 流速为 0.6 ml/min，每 5 分钟收集一管。紫外监测波长 280nm，然后收集有活性的部分，量 取体积，测定蛋白质含量和酶活性。留取少量溶液备用。 （二） 酶活性的测定 2.1 活性的测定 测定前在 54ml14.5mmol/Ldl-甲硫氨酸中分别加入 EDTA,NBT,核黄素溶液各 2ml 混匀， 此为反应混合液。 在盛有 3ml 反应混合液的试管中，加入适量的酶液（以使抑制达 50%左右的酶浓度为 佳），混匀后放在透明的试管架上，于光照培养箱中准确照光 30 分钟，迅速测定 560nm 下的 光密度，以不加酶液的照光管为对照，计算反应被抑制的百分比。或者按照表 1 加入试剂量 进行添加。 表 1 试剂 样管 最大光化管 对照管/ml dl-甲硫氨酸 2.7 2.7 2.7 EDTA 0.1 0.1 0.1 核黄素 0.1 0.1 0.1 NBT 0.1 0.1 0.1 酶液 适量 - - 2.2 活力的计算 以能抑制反应 50%的酶量为一个 SOD 酶活单位。其 SOD 活力可由下式计算 SOD 活力（U/ml）= 样液体积 反应被抑制的百分比 50% ×100%= 100% 50% − 样品体积 最大光化管 最大光化管 样品管 （三） 蛋白质浓度测定——紫外线吸收法 3．1 制备法标准曲线 按照下表分别在以下 8 个比色管中加入标准蛋白溶液、蒸馏水、不同蛋白质浓度的样品 后，摇匀。选用光程为 1cm 的石英比色杯，在 280nm 波长处分别测定各管溶液的吸光值 A280 值，以 A280 值为纵坐标，标准蛋白含量为横坐标，绘制标准曲线。取 16 支试管，分两组按 下表平行操作。 表 2 1 2 3 4 5 6 7 8
4、DEAE-纤维素柱层析 取经过丙酮沉淀后溶解的上清夜，稀释 10 倍，过 DEAE-纤维素柱（2.6mm*40mm）。先用 2.5mmol/LpH7.8 磷酸缓冲溶液平衡 3-4 个床体积,上样量为 1 毫升，继续用 2.5mmol/LPH7.8 磷酸缓冲溶液冲洗 120ml,然后再分别用 2.5-250mmol/L, pH 为 7.8 的磷酸缓冲液梯度洗脱， 流速为 0.6 ml/min，每 5 分钟收集一管。紫外监测波长 280nm，然后收集有活性的部分，量 取体积，测定蛋白质含量和酶活性。留取少量溶液备用。 （二） 酶活性的测定 2.1 活性的测定 测定前在 54ml14.5mmol/Ldl-甲硫氨酸中分别加入 EDTA,NBT,核黄素溶液各 2ml 混匀， 此为反应混合液。 在盛有 3ml 反应混合液的试管中，加入适量的酶液（以使抑制达 50%左右的酶浓度为 佳），混匀后放在透明的试管架上，于光照培养箱中准确照光 30 分钟，迅速测定 560nm 下的 光密度，以不加酶液的照光管为对照，计算反应被抑制的百分比。或者按照表 1 加入试剂量 进行添加。 表 1 试剂 样管 最大光化管 对照管/ml dl-甲硫氨酸 2.7 2.7 2.7 EDTA 0.1 0.1 0.1 核黄素 0.1 0.1 0.1 NBT 0.1 0.1 0.1 酶液 适量 - - 2.2 活力的计算 以能抑制反应 50%的酶量为一个 SOD 酶活单位。其 SOD 活力可由下式计算 SOD 活力（U/ml）= 样液体积 反应被抑制的百分比 50% ×100%= 100% 50% − 样品体积 最大光化管 最大光化管 样品管 （三） 蛋白质浓度测定——紫外线吸收法 3．1 制备法标准曲线 按照下表分别在以下 8 个比色管中加入标准蛋白溶液、蒸馏水、不同蛋白质浓度的样品 后，摇匀。选用光程为 1cm 的石英比色杯，在 280nm 波长处分别测定各管溶液的吸光值 A280 值，以 A280 值为纵坐标，标准蛋白含量为横坐标，绘制标准曲线。取 16 支试管，分两组按 下表平行操作。 表 2 1 2 3 4 5 6 7 8
标准蛋白溶液/ml 0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 4.0 蒸馏水/ml 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 0 蛋白质浓度 （mg/ml） 0 0.15 0.25 0.375 0.5 0.625 0.75 1.0 A280 3．2 样品蛋白质浓度测定 取待测蛋白质溶液 1ml，加入 3ml，摇匀，按上述方法在 280nm 波长处分别测定各管溶 液的 A280 值，并从标准曲线上查出待测蛋白质的浓度。如果样液被稀释，则未知蛋白浓度按 下列公式计算 蛋白质(g)/ml 酶液= 100 A 10 6 640 酶液稀释倍数 测定使用稀释酶液的 数 值对应标准曲线蛋白质浓度 ml 六、结果 总活力和收率按下列公式计算，将结果添于表 3。 总活力（U）= SOD 活力×原液总体积 收率= 粗酶液总活力 纯化后的总活力 ×100% 表 3-SOD 的分离纯化结果表 酶液体 积（ml） 蛋白浓 度 (mg/m) 单位活 力 (U/ml) 总蛋白 （mg) 总 活 力 (U) 比 活 力 (U /mg) 活 性 回 收 （%） 纯 化 倍数 粗 酶 液 热击 丙 酮 沉淀 DEAE 层析 七、思考题 1、超氧化物歧化酶对人体有何生理学意义？ 2、有机溶剂能沉淀超氧化物歧化酶所根据的原理是什么？ 3、离子交换纤维素有何特点？为什么人们常用它来分离纯化酶及其他生物活性大分子 物质？ 4、何为梯度洗脱法？它有何特点？
标准蛋白溶液/ml 0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 4.0 蒸馏水/ml 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 0 蛋白质浓度 （mg/ml） 0 0.15 0.25 0.375 0.5 0.625 0.75 1.0 A280 3．2 样品蛋白质浓度测定 取待测蛋白质溶液 1ml，加入 3ml，摇匀，按上述方法在 280nm 波长处分别测定各管溶 液的 A280 值，并从标准曲线上查出待测蛋白质的浓度。如果样液被稀释，则未知蛋白浓度按 下列公式计算 蛋白质(g)/ml 酶液= 100 A 10 6 640 酶液稀释倍数 测定使用稀释酶液的 数 值对应标准曲线蛋白质浓度 ml 六、结果 总活力和收率按下列公式计算，将结果添于表 3。 总活力（U）= SOD 活力×原液总体积 收率= 粗酶液总活力 纯化后的总活力 ×100% 表 3-SOD 的分离纯化结果表 酶液体 积（ml） 蛋白浓 度 (mg/m) 单位活 力 (U/ml) 总蛋白 （mg) 总 活 力 (U) 比 活 力 (U /mg) 活 性 回 收 （%） 纯 化 倍数 粗 酶 液 热击 丙 酮 沉淀 DEAE 层析 七、思考题 1、超氧化物歧化酶对人体有何生理学意义？ 2、有机溶剂能沉淀超氧化物歧化酶所根据的原理是什么？ 3、离子交换纤维素有何特点？为什么人们常用它来分离纯化酶及其他生物活性大分子 物质？ 4、何为梯度洗脱法？它有何特点？