高效液相色谱法基本知识 (见第7章) HPLC法分类与定义 正相高效液相色谱法( NP- HPLO)——固定相极性大于流动相极性。常用色谱柱有硅 胶柱、氰基柱、氨基柱:流动相为烷烃加适量极性溶剂,如正己烷-异丙醇、正己烷-乙醇等 主要用于分离溶于有机溶剂的极性至中等极性的分子型化合物,如维生素A、维生素D、维 生素K1的含量测定 反相高效液相色谱法( RP-HPLC)——流动相极性大于固定相极性。常用色谱柱为十 八烷基硅烷键合硅胶(OυS)柱:流动相主要成分为甲醇-水或乙腈-水(添加适量酸或缓冲 盐),用于大多数非极性、弱极性药物的分离分析。 系统适用性试验内容与要求 理论板数(n)=16(1/W)2或n=5.54(1/Wh)2,计算n时应指明测定物质。当 测定结果有异议时,应以峰宽(W)计算结果为准。 2(tg2 分离度(R)=2(1n-1a或R=17ONW2M2) 一般要求待测组分与相邻共 存物之间的R应大于1.5。当测定结果有异议时,应以峰宽(W)计算结果为准。 盦复性:用于评价连续进样中,色谱系统响应值的重复性能。取同一溶液连续进样5 次,其峰面积的相对标准偏差(RSD)应不大于20% 拖尾因子(T)=W0A,峰高法定量时T应在095~105之间。 ●测定方法 内标法:按规定,取被测物对照品和内标物质一定量,混合,配制成校正因子测定用的 对照溶液,注λ高效液相色谱仪,记录色谱峰面积。根据对照溶液色谱图中对照品和内标物 质的峰面积或峰高,以及对照品和内标物的浓度,按下式计算校正因子(∫ Au/C 另取被测物适量,加一定量内标溶液,混合,制成供试品溶液,注入高效液相色谱仪, 记录色谱峰面积。根据供试品溶液色谱图中待测成分和内标物质的峰面积或峰高,按下式计 算供试品溶液中待测成分的浓度(C样) C样=f 外标法:按规定,精密称取对照品和供试品,分别配制成溶液,注入高效液相色谱仪, 记录各自色谱图,测量对照品溶液和供试品溶液中待测成分的峰面积(或峰高),按下式计 算供试品溶液中待测成分的浓度(Cn)
10 高效液相色谱法基本知识 （见第7章） uHPLC 法分类与定义 正相高效液相色谱法（NPHPLC）——固定相极性大于流动相极性。常用色谱柱有硅 胶柱、氰基柱、氨基柱；流动相为烷烃加适量极性溶剂，如正己烷异丙醇、正己烷乙醇等。 主要用于分离溶于有机溶剂的极性至中等极性的分子型化合物，如维生素 A、维生素 D、维 生素 K1的含量测定。 反相高效液相色谱法（RPHPLC）——流动相极性大于固定相极性。常用色谱柱为十 八烷基硅烷键合硅胶（ODS）柱；流动相主要成分为甲醇水或乙腈水（添加适量酸或缓冲 盐），用于大多数非极性、弱极性药物的分离分析。 v系统适用性试验内容与要求 理论板数（n）＝16（tR/W）2或 n＝5.54（tR/Wh/2）2 ，计算 n 时应指明测定物质。当 测定结果有异议时，应以峰宽（W）计算结果为准。 分离度（R） W W t R t R 1 2 2( ) 2 1 + - = 或 1. 70( ) 2( ) 1, / 2 2, / 2 2 1 h h R R W W t t R + - = ，一般要求待测组分与相邻共 存物之间的 R 应大于 1.5。当测定结果有异议时，应以峰宽（W）计算结果为准。 重复性：用于评价连续进样中，色谱系统响应值的重复性能。取同一溶液连续进样 5 次，其峰面积的相对标准偏差（RSD）应不大于 2.0％。 拖尾因子（T） 1 0 .05 2 d W h = ，峰高法定量时 T 应在 0.95～1.05 之间。 w测定方法 内标法：按规定，取被测物对照品和内标物质一定量，混合，配制成校正因子测定用的 对照溶液，注入高效液相色谱仪，记录色谱峰面积。根据对照溶液色谱图中对照品和内标物 质的峰面积或峰高，以及对照品和内标物的浓度，按下式计算校正因子（f）： 对 对 内 内 A C A C f / / = 另取被测物适量，加一定量内标溶液，混合，制成供试品溶液，注入高效液相色谱仪， 记录色谱峰面积。根据供试品溶液色谱图中待测成分和内标物质的峰面积或峰高，按下式计 算供试品溶液中待测成分的浓度（C样 ）： ' ' 内 / 内 样 样 A C A C = f ¥ 外标法：按规定，精密称取对照品和供试品，分别配制成溶液，注入高效液相色谱仪， 记录各自色谱图，测量对照品溶液和供试品溶液中待测成分的峰面积（或峰高），按下式计 算供试品溶液中待测成分的浓度（C样 ）： 对 样 样 对 A A C = C