案例二 根据阿司匹林的合成工艺和结构性质,设计特殊杂质检查项目和测定方法。 合成工艺路线: COoNa COOH COoH ONa OCOCH (CH3CO)2O 乙酰化 Q可能的特殊杂质 根据合成路线,可能存在的特殊杂质有水杨酸、苯酚以及反应副产物等,同时由于阿司匹林具 有酯结构,在药物的贮藏或制剂过程中易引起水解,产生水杨酸。因此原料药和制剂中游离水杨酸 是必须控制的特殊杂质,可利用水杨酸有游离酚羟基,阿司匹林无游离酚羟基,采用三氯化铁(硫 酸铁铵)比色法进行控制;也可采用HPLC法检测 6限量检查方法: (1)比色法—游离水杨酸的检查 取本品0.l0g,加乙醇lml溶解后,加冷水适量使成soml,立即加新制的稀硫酸铁铵溶液lml, 摇匀;30秒钟內如显色,与水杨酸对照液(o.lmg/m)lml同法制得结果比较,不得更深(0.1%)。 药物中游离水杨酸含量未知时,应取水杨酸系列对照液做标准曲线进行半定量,以求得样品中游 离水杨酸的含量范围,然后根据实际样品质量,参考药典限度要求,确定本产品中游离水杨酸限量。 比色法为2005年版《中国药典》方法,其只能检查游离水杨酸的量,不能控制其他有关物质的 量。而且在样品溶解过程中,易发生水解反应,可能导致游离水杨酸含量偏高。2010年版中国药典 改用HPLC法检查。 (2)HPLC法游离水杨酸和有关物质的检查 ①色谱条件初步选择:取合成原料、中间体、粗品、成品适量,分别用含1%冰醋酸的甲醇溶解 配制成0~lmg/ml的溶液(注意:阿司匹林易水解,不能用含水流动相作溶剂)。以ODS柱为分 析柱,检测波长可考虑阿司匹林和水杨酸均有较大吸收的波长处,待流动相条件基本确定后,最根 据检測灵敏度要求进行调整。首先考察流动相中有机相种类,可从最常用的甲醇开始选择,如有必 要,改用乙腈、四氢呋喃,或几种有机溶剂合用。同时选择流动相中有机相比例,对于极性较大的 成分,可从50%的有机相开始,根据色谱峰的保留时间,降低有机相比例或升高有机相比例。一般 有机相比例宜从高到低进行选择,这样样品出峰较快,可以在较短时间内获得较合适的有机相比例。 阿司匹林、水杨酸均具酸性,流动相中宜添加1%~5%的冰醋酸(注意:若用缓冲盐,应添加到水相中, 并测定pH值,常规oDS柱使用p为2~8)。取合成粗品,注入高效液相色谱仪,观察各成分峰形状 保留时间、分离情况,调整流动相成分和比例,使柱效、分离度达到一定要求,保留时间适中。 ②杂质归属与方法专属性考察:取空白溶剂(配制样品溶液的溶剂)、合成原料、中间体、粗品, 品溶液,在上述基本确定的色谱条件下进行分析,比较色谱图,确定样品溶剂峰、水杨酸峰、其 它有关杂质峰,必要时,可将有关杂质添加到样品液中,以确定杂质的归属,同时将成品的色谱图 与粗品色谱图进行比较,分析最后纯化精制工序的效果,如果杂质峰较大,就有必要考虑合成工艺 或精制方法的改进。在这步分析中应尽可能记录较长的层析时间,以便确定合理的色谱图记录时间 同时采用破坏试验,以产生可能的降解产物,考察方法的专属性。取成品,加适宜浓度的酸 碱或过氧化氢溶液,放置一定时间或加热一定时间(视样品稳定性而异),或采用烘箱烘烤、日光照 射等,然后制成一定浓度溶液,进样分析,破坏程度以样品主峰分解20%以内为宜。观察产生的杂 质峰是否完全分离,并同时取破坏用空白试剂进样分析,以排除干扰。根据以上分析情况进一步调 整流动相和检测波长,以达到最佳化 ③检测限和样品测定液浓度的确定:对不同浓度样品液进行测定,比较杂质峰个数,确定合适的 样品液浓度范围。并考察阿司匹林和水杨酸的检测灵敏度。分别取阿司匹林和水杨酸溶液,采取逐步 稀释法,以信噪比等于2~3确定检测限。根据检测限和杂质的限量要求,进一步确定样品测定液浓度 ④限量检查方法的确定:水杨酸可采用外标法,其他有关杂质可采用主成分自身对照法。原料药 中水杨酸限量为0.1%,其它有关杂质总量一般可控制在0.5%。 取阿司匹林成品,根据上述确定浓度配制供试品溶液(如1~5mg/m),取一定量供试品溶液, 稀释200倍,作为自身对照液如5-25ugm);另取水杨酸对照品适量,制成浓度相当于供试液1/1000 倍的溶液(如~5μug/m),作为水杨酸对照液;也可将自身对照液和水杨酸对照液配成混合对照溶液 取混合对照溶液注λ液相色谱仪,调节仪器检测灵敏度,使对照液主成分峰高为满量程的10%~-0%, 两峰分离度达到一定要求,再精密吸取对照液和供试品溶液分别注入液相色谱仪,记录色谱图至主成 分峰保留时间的一定倍数(根据实际考察结果确定记录时间,一般至少为主成分峰保留时间的2倍)。 供试品溶液色谱图中如有与水杨酸峰保留时间一致的色谱峰,不得大于对照液中水杨酸峰面积 (也可采用外标法计算水杨酸含量);其它各杂质峰面积和不得大于对照液中阿司匹林峰面积(也可 规定单个杂质峰面积不得大于对照液中阿司匹林峰面积的12等,以控制单个杂质量) 该案例说明的主要问题 特殊杂质检查方法的建立,包括:色谱条件(流动相、检测波长)的选择、杂质归属、方法学 评价、限量确定等内容。注意以上阿司匹林色谱条件的选择和方法确定仅为举例,主要是介绍方法 设计过程,并非真实测定条件
1 案例二 根据阿司匹林的合成工艺和结构性质，设计特殊杂质检查项目和测定方法。 合成工艺路线: ONa CO2 COONa ONa H+ COOH OH (CH3CO)2O 乙酰化 COOH OCOCH3 + CH3COOH 可能的特殊杂质： 根据合成路线，可能存在的特殊杂质有水杨酸、苯酚以及反应副产物等，同时由于阿司匹林具 有酯结构，在药物的贮藏或制剂过程中易引起水解，产生水杨酸。因此原料药和制剂中游离水杨酸 是必须控制的特殊杂质，可利用水杨酸有游离酚羟基，阿司匹林无游离酚羟基，采用三氯化铁（硫 酸铁铵）比色法进行控制；也可采用 HPLC 法检测。 限量检查方法： （1）比色法——游离水杨酸的检查 取本品 0.10g，加乙醇 1ml 溶解后，加冷水适量使成 50ml，立即加新制的稀硫酸铁铵溶液 1ml， 摇匀；30 秒钟内如显色，与水杨酸对照液（0.1mg/ml）1ml 同法制得结果比较，不得更深（0.1%）。 药物中游离水杨酸含量未知时，应取水杨酸系列对照液做标准曲线进行半定量，以求得样品中游 离水杨酸的含量范围，然后根据实际样品质量，参考药典限度要求，确定本产品中游离水杨酸限量。 比色法为 2005 年版《中国药典》方法，其只能检查游离水杨酸的量，不能控制其他有关物质的 量。而且在样品溶解过程中，易发生水解反应，可能导致游离水杨酸含量偏高。2010 年版中国药典 改用 HPLC 法检查。 （2）HPLC 法——游离水杨酸和有关物质的检查 ①色谱条件初步选择: 取合成原料、中间体、粗品、成品适量，分别用含 1%冰醋酸的甲醇溶解， 配制成 0.1～1mg/ml 的溶液（注意：阿司匹林易水解，不能用含水流动相作溶剂）。以 ODS 柱为分 析柱，检测波长可考虑阿司匹林和水杨酸均有较大吸收的波长处，待流动相条件基本确定后，最根 据检测灵敏度要求进行调整。首先考察流动相中有机相种类，可从最常用的甲醇开始选择，如有必 要，改用乙腈、四氢呋喃，或几种有机溶剂合用。同时选择流动相中有机相比例，对于极性较大的 成分，可从 50%的有机相开始，根据色谱峰的保留时间，降低有机相比例或升高有机相比例。一般 有机相比例宜从高到低进行选择，这样样品出峰较快，可以在较短时间内获得较合适的有机相比例。 阿司匹林、水杨酸均具酸性，流动相中宜添加 1%～5%的冰醋酸（注意：若用缓冲盐，应添加到水相中， 并测定 pH 值，常规 ODS 柱使用 pH 为 2～8）。取合成粗品，注入高效液相色谱仪，观察各成分峰形状、 保留时间、分离情况，调整流动相成分和比例，使柱效、分离度达到一定要求，保留时间适中。 ②杂质归属与方法专属性考察: 取空白溶剂（配制样品溶液的溶剂）、合成原料、中间体、粗品、 成品溶液，在上述基本确定的色谱条件下进行分析，比较色谱图，确定样品溶剂峰、水杨酸峰、其 它有关杂质峰，必要时，可将有关杂质添加到样品液中，以确定杂质的归属，同时将成品的色谱图 与粗品色谱图进行比较，分析最后纯化精制工序的效果，如果杂质峰较大，就有必要考虑合成工艺 或精制方法的改进。在这步分析中应尽可能记录较长的层析时间，以便确定合理的色谱图记录时间。 同时采用破坏试验，以产生可能的降解产物，考察方法的专属性。取成品，加适宜浓度的酸、 碱或过氧化氢溶液，放置一定时间或加热一定时间（视样品稳定性而异），或采用烘箱烘烤、日光照 射等，然后制成一定浓度溶液，进样分析，破坏程度以样品主峰分解 20%以内为宜。观察产生的杂 质峰是否完全分离，并同时取破坏用空白试剂进样分析，以排除干扰。根据以上分析情况进一步调 整流动相和检测波长，以达到最佳化。 ③检测限和样品测定液浓度的确定：对不同浓度样品液进行测定，比较杂质峰个数，确定合适的 样品液浓度范围。并考察阿司匹林和水杨酸的检测灵敏度。分别取阿司匹林和水杨酸溶液，采取逐步 稀释法，以信噪比等于 2～3 确定检测限。根据检测限和杂质的限量要求，进一步确定样品测定液浓度。 ④限量检查方法的确定: 水杨酸可采用外标法，其他有关杂质可采用主成分自身对照法。原料药 中水杨酸限量为 0.1%，其它有关杂质总量一般可控制在 0.5%。 取阿司匹林成品，根据上述确定浓度配制供试品溶液（如 1∼5mg/ml），取一定量供试品溶液， 稀释 200 倍，作为自身对照液(如 5∼25μg/ml)；另取水杨酸对照品适量，制成浓度相当于供试液 1/1000 倍的溶液（如 1∼5μg/ml)，作为水杨酸对照液；也可将自身对照液和水杨酸对照液配成混合对照溶液。 取混合对照溶液注入液相色谱仪，调节仪器检测灵敏度，使对照液主成分峰高为满量程的 10%～20%， 两峰分离度达到一定要求，再精密吸取对照液和供试品溶液分别注入液相色谱仪，记录色谱图至主成 分峰保留时间的一定倍数（根据实际考察结果确定记录时间，一般至少为主成分峰保留时间的 2 倍）。 供试品溶液色谱图中如有与水杨酸峰保留时间一致的色谱峰，不得大于对照液中水杨酸峰面积 （也可采用外标法计算水杨酸含量）；其它各杂质峰面积和不得大于对照液中阿司匹林峰面积（也可 规定单个杂质峰面积不得大于对照液中阿司匹林峰面积的 1/2 等，以控制单个杂质量）。 该案例说明的主要问题： 特殊杂质检查方法的建立，包括：色谱条件（流动相、检测波长）的选择、杂质归属、方法学 评价、限量确定等内容。注意以上阿司匹林色谱条件的选择和方法确定仅为举例，主要是介绍方法 设计过程，并非真实测定条件