一、组织学发展概况及研究内容与意义 组织学(histology)与胚胎学(embryology)是相互关联的两门学科，我国医学教育习惯 地将它们列为一门基础课程。组织学是研究机体微细结构及其相关功能的科学，它是以显微镜 观察组织切片为基本方法的，故又称显微解剖学(microanatomy)。从细胞的发现和细胞学说 的建立起始，组织学发展迄今为已有300余年历史。英国人Hooke(1635~1703)用放大镜观察 软木塞薄片，首先描述了细胞壁所成的小室，称之为“cel。意大利人Malpighi((1628~1694) 用放大镜观察了脾、肺、肾等的组织结构，荷兰人Leeuwenhoek(1632~1723)用较高倍的放大 镜发现了精子、红细胞、肌细胞、神经细胞等，荷兰人Graaf(1641~1673)观察报道了卵 泡。法国人Bichat(1771~1822)用放大镜观察肉眼解剖的组织，并于1801年发表的“膜的研 究”一文，首次提出“组织”（法文ss山，原意为编织物）一词，还将人体的组织分为21种。德 国人Meyer(1819)又将组织重新分类为8种，并创用Histology一词。Brown(1831)进而发现了细 胞核，对细胞的结构有了初步的认识。在有机体结构长期研究和争议的基础上，德国学者 Schleiden(1804~1881)和Schwannt(1810~1882)于1838~1839年分别指出细胞是一切植物和动 物的结构、功能和发生的重要单位，创立了细胞学说，成为组织学、胚胎学、生理学、病理学 等生命科学发展的重要里程碑，被誉为是19世纪自然科学的三大发现（细胞学说、物质和能量 守恒定律、达尔文进化论)之一。此后不久，德国学者Virchow(1821~1902)于1858指出细胞 只源于细胞，细胞损害是一切疾病的基础，建立了细胞病理学说，使细胞学说更趋完善。19世纪 中期以后，随着光学显微镜、切片技术及染色方法的不断改进与充实，推进组织学的继续发 展。本世纪初至中期，陆续制成相差显微镜、偏光显微镜、暗视野显微镜、荧光显微镜、紫外 光显微镜等特殊显微镜，并用之于组织学研究：与此同时，组织化学、组织培养、放射自显影 等技术也渐建立和完善并广泛应用，组织学研究更趋深入，资料日益丰富。本世纪40年代电子 显微镜问世，并不断改进，至今已广泛用于观察细胞和组织的微细结构及其不同状态下的变化， 使人类对生命现象结构基础的认识深入到更微细的境界，其中许多重要资料已列为现代组织学 的基本内容。 我国组织学研究起始于本世纪之初，组织学是从人体解剖学分化出来的一门较年轻的科 学。我国老一辈组织学家如马文昭(1886~1965)、鲍鉴清(1893~1982)、王有琪(1899 ~)、张作干(1907~1969)、李肇特(1913~)、薜社普(1917~)等，他们在学科建 设、科学研究和人才培养等方面做出了历史性贡献。 近30年科学技术发展更为迅猛，许多新技术、新设备不断涌现并用之于细胞学和组织学的 研究，诸如免疫细胞化学术、单克隆技术、细胞分离术、细胞融合术、显微分光光度计、图像 分析仪与立体计量术、同位素示踪术、流式细胞术、蛋白质和核酸的分离提取及原位检测、原 位杂交等核酸分子杂交术、X~射线衍射技术、X~射线显微分析术，以及分子重组与基因工 程等。这些新技术大多与计算机技术相结合，对细胞进行微观和微量的定性和定量分析，使组 织学的研究进入更深入而广阔的境地
一、组织学发展概况及研究内容与意义 组织学（histology）与胚胎学（embryology）是相互关联的两门学科，我国医学教育习惯 地将它们列为一门基础课程。组织学是研究机体微细结构及其相关功能的科学，它是以显微镜 观察组织切片为基本方法的，故又称显微解剖学（microanatomy）。从细胞的发现和细胞学说 的建立起始，组织学发展迄今为已有300余年历史。英国人Hooke(1635～1703)用放大镜观察 软木塞薄片，首先描述了细胞壁所成的小室，称之为“cell”。意大利人Malpighi(1628～1694) 用放大镜观察了脾、肺、肾等的组织结构，荷兰人Leeuwenhoek(1632～1723)用较高倍的放大 镜发现了精子、红细胞、肌细胞、神经细胞等，荷兰人Graaf（1641～1673）观察报道了卵 泡。法国人Bichat(1771～1822)用放大镜观察肉眼解剖的组织，并于1801年发表的“膜的研 究”一文，首次提出“组织”（法文tissu，原意为编织物）一词，还将人体的组织分为21种。德 国人Meyer(1819)又将组织重新分类为8种，并创用Histology一词。Brown(1831)进而发现了细 胞核，对细胞的结构有了初步的认识。在有机体结构长期研究和争议的基础上，德国学者 Schleiden(1804～1881)和Schwann(1810～1882)于1838～1839年分别指出细胞是一切植物和动 物的结构、功能和发生的重要单位，创立了细胞学说，成为组织学、胚胎学、生理学、病理学 等生命科学发展的重要里程碑，被誉为是19世纪自然科学的三大发现（细胞学说、物质和能量 守恒定律、达尔文进化论）之一。此后不久，德国学者Virchow(1821～1902)于1858指出细胞 只源于细胞,细胞损害是一切疾病的基础，建立了细胞病理学说，使细胞学说更趋完善。19世纪 中期以后，随着光学显微镜、切片技术及染色方法的不断改进与充实，推进组织学的继续发 展。本世纪初至中期，陆续制成相差显微镜、偏光显微镜、暗视野显微镜、荧光显微镜、紫外 光显微镜等特殊显微镜，并用之于组织学研究；与此同时，组织化学、组织培养、放射自显影 等技术也渐建立和完善并广泛应用，组织学研究更趋深入，资料日益丰富。本世纪40年代电子 显微镜问世，并不断改进,至今已广泛用于观察细胞和组织的微细结构及其不同状态下的变化， 使人类对生命现象结构基础的认识深入到更微细的境界，其中许多重要资料已列为现代组织学 的基本内容。 我国组织学研究起始于本世纪之初，组织学是从人体解剖学分化出来的一门较年轻的科 学。我国老一辈组织学家如马文昭（1886～1965）、鲍鉴清（1893～1982）、王有琪（1899 ～）、张作干（1907～1969）、李肇特（1913～）、薜社普（1917～）等，他们在学科建 设、科学研究和人才培养等方面做出了历史性贡献。 近30年科学技术发展更为迅猛，许多新技术、新设备不断涌现并用之于细胞学和组织学的 研究，诸如免疫细胞化学术、单克隆技术、细胞分离术、细胞融合术、显微分光光度计、图像 分析仪与立体计量术、同位素示踪术、流式细胞术、蛋白质和核酸的分离提取及原位检测、原 位杂交等核酸分子杂交术、X－射线衍射技术、X－射线显微分析术，以及分子重组与基因工 程等。这些新技术大多与计算机技术相结合，对细胞进行微观和微量的定性和定量分析，使组 织学的研究进入更深入而广阔的境地
组织(tissue)是由细胞(cell)和细胞间质(intercellular substance)组成，众多细胞由细 胞间质组合在一起构成一细胞群体。细胞是组织的结构和功能单位，高等动物和人体的细胞有 成百上干种类型，各种细胞具有一定的形态结构特点，合成与功能相关的特殊蛋白质，表达某 种代谢特点和功能活动，即为细胞的表现型(phenotype)。细胞间质是由细胞产生的非细跑 物质，包括纤维、基质和不断流动的体液（血浆、淋巴、组织液等），它们参与构成细胞生存 的微环境(microenvironment),起支持、联系、营养和保护细胞的作用，对细胞的分化、运 动、信息沟通也有重要影响。组织微环境的稳定是保持细胞增殖、分化、代谢和功能活动的重 要条件，微环境成分的异常变动也可使细胞发生病理变化。组织有多种类型，每种组织具有某 些共同的形态结构特点和相关的功能。一般传统性将组织分为四种，即上皮组织、结缔组织、 肌组织和神经组织，称为基本组织(primary tissue)·但现代组织学的研究愈来愈多地发现， 一种组织内的细胞结构和功能往往是多种多样的，它们的起源也不同；因此应认识到，组织分 类是一种归纳性的相对意义的概念，不能机械僵化地理解。几种组织相互结合，组成器官 (organ)和系统(system),人体的组成包括神经、内分泌、免疫、循环、皮肤、感官、消 化、呼吸、泌尿、生殖等系统。 医学组织学的研究对象是人体，但人体材料来源受限，尤其是许多实验性研究的开展，需 选用实验动物为材料。应用显微镜观察机体的组织结构及其形态演变，称为描述组织学。一般 光学显微镜下所见的结构，称光镜结构；电子显微镜下显示的结构，称超微结构 (ultrastructure)研究不同动物种系的组织结构和功能的，称为比较组织学。应用实验方法研 究组织结构与功能的动态变化、理化因子或生物因子的调节或影响，以及致病、致癌等机理， 秒为实验组织学。从分子水平探讨细胞和组织的功能及其异常变化的机理，则属分子生物学。 不言而喻，学习医学科学必须首先熟悉人体的结构、组成及其基本生命现象，组织学、从 微观水平阐明机体的结构与相关功能，无疑是医学教育的重要入门课程之一，它为生理学、生 物化学、免疫学、病理学以及临床医学等的学习奠定坚实基础。组织学是以微细结构的形态描 述为其基本内容，但随着生命科学的研究不断深入，现代组织学的内容与60年代相比已发生巨 大变化。它的内容不断充实、更新和扩展，不仅形态观察更微细深入，而且涉及的领域更为广 阔，从整体水平、细胞水平和分子水平探索许多复杂生命现象的物质基础以及环境与生物体的 相互关系；不仅与现代生物学和医学的许多重大理论进展相关，而且与人类社会面临的众多实 际问题和疾病防治密切相关。诸如：细胞增殖与分化的调控，细胞突变、癌变与逆转，细胞运 动与迁移，细胞识别与通讯，细胞与组织的移植，细胞与组织的衰老，细胞与免疫、组织与器 官的再生，神经调节与体液调节，环境污染与组织病变等等。这些问题的研究与解决，都需要 多学科的密切协作和高技术的综合应用，组织学也处于当代生命科学各学科相互交叉的网络 中，与分子生物学、细胞生物学、生理学、生物化学、生物物理学、免疫学、病理学、肿瘤 学、环境毒理学等，理论上相互关联渗透，技术上相互引用促进，关系日益密切。在基础医学 各门课程的教学中，处处可看到现代医学的这种发展势头
组织（tissue）是由细胞(cell)和细胞间质（intercellular substance）组成，众多细胞由细 胞间质组合在一起构成一细胞群体。细胞是组织的结构和功能单位，高等动物和人体的细胞有 成百上千种类型，各种细胞具有一定的形态结构特点，合成与功能相关的特殊蛋白质，表达某 种代谢特点和功能活动，即为细胞的表现型（phenotype）。细胞间质是由细胞产生的非细胞 物质，包括纤维、基质和不断流动的体液（血浆、淋巴、组织液等），它们参与构成细胞生存 的微环境（microenvironment），起支持、联系、营养和保护细胞的作用，对细胞的分化、运 动、信息沟通也有重要影响。组织微环境的稳定是保持细胞增殖、分化、代谢和功能活动的重 要条件，微环境成分的异常变动也可使细胞发生病理变化。组织有多种类型，每种组织具有某 些共同的形态结构特点和相关的功能。一般传统性将组织分为四种，即上皮组织、结缔组织、 肌组织和神经组织，称为基本组织（primary tissue）。但现代组织学的研究愈来愈多地发现， 一种组织内的细胞结构和功能往往是多种多样的，它们的起源也不同；因此应认识到，组织分 类是一种归纳性的相对意义的概念，不能机械僵化地理解。几种组织相互结合，组成器官 （organ）和系统（system），人体的组成包括神经、内分泌、免疫、循环、皮肤、感官、消 化、呼吸、泌尿、生殖等系统。 医学组织学的研究对象是人体，但人体材料来源受限，尤其是许多实验性研究的开展，需 选用实验动物为材料。应用显微镜观察机体的组织结构及其形态演变，称为描述组织学。一般 光 学 显 微 镜 下 所 见 的 结 构 ， 称 光 镜 结 构 ； 电 子 显 微 镜 下 显 示 的 结 构 ， 称 超 微 结 构 （ultrastructure）研究不同动物种系的组织结构和功能的，称为比较组织学。应用实验方法研 究组织结构与功能的动态变化、理化因子或生物因子的调节或影响，以及致病、致癌等机理， 秒为实验组织学。从分子水平探讨细胞和组织的功能及其异常变化的机理，则属分子生物学。 不言而喻，学习医学科学必须首先熟悉人体的结构、组成及其基本生命现象，组织学、从 微观水平阐明机体的结构与相关功能，无疑是医学教育的重要入门课程之一，它为生理学、生 物化学、免疫学、病理学以及临床医学等的学习奠定坚实基础。组织学是以微细结构的形态描 述为其基本内容，但随着生命科学的研究不断深入，现代组织学的内容与60年代相比已发生巨 大变化。它的内容不断充实、更新和扩展，不仅形态观察更微细深入，而且涉及的领域更为广 阔，从整体水平、细胞水平和分子水平探索许多复杂生命现象的物质基础以及环境与生物体的 相互关系；不仅与现代生物学和医学的许多重大理论进展相关，而且与人类社会面临的众多实 际问题和疾病防治密切相关。诸如：细胞增殖与分化的调控，细胞突变、癌变与逆转，细胞运 动与迁移，细胞识别与通讯，细胞与组织的移植，细胞与组织的衰老，细胞与免疫、组织与器 官的再生，神经调节与体液调节，环境污染与组织病变等等。这些问题的研究与解决，都需要 多学科的密切协作和高技术的综合应用，组织学也处于当代生命科学各学科相互交叉的网络 中，与分子生物学、细胞生物学、生理学、生物化学、生物物理学、免疫学、病理学、肿瘤 学、环境毒理学等，理论上相互关联渗透，技术上相互引用促进，关系日益密切。在基础医学 各门课程的教学中，处处可看到现代医学的这种发展势头
二、组织学研究方法 (一)一般光学显微镜术 应用一般光学显微镜（简称光镜）观察组织切片是组织学研究的最基本方法。取动物或人 体的新鲜组织块，先用固定剂(fixative)固定(fixation),使组织中的蛋白质迅速凝固，防 止细胞自溶和组织腐败。常用的固定剂如洒精、甲醛、醋酸、苦味酸、四氧化锇等，一般常将 几种固定剂配制成混合固定液，以抵消或减弱单种固定剂对组织的收缩或膨胀等缺点，达到更 好固定效果。固定后的组织块（约3~5mm3大小）用石蜡、火棉胶或树脂等包埋 (embedding)成硬块，以切片机(microtome)切成5~l0μm厚的组织切片(tissue section)，切片贴在载玻片上经脱蜡等步骤后进行染色。组织块也可立即投入液氮(- 196℃)内快速冻结，用恒冷箱切片机(cryostat)制成冷冻切片(frozen section),这种方法 制片迅速，细胞内酶活性保存较好，常用于酶组织化学染色。血细胞和分离培养的细胞可直接 涂在玻片上，制成涂片(smear)。疏松结缔组织和肠系膜等软组织可撕成薄片铺在玻片上 (铺片)，牙和骨等坚硬组织可磨成薄片（磨片）。组织切片等标本经染色、透明后，以封固 剂和盖片封固，即可长期保存，镜下观察。 CH3:CH: CH:CH CH: 0,cH( )so OH c1- N(CH3): 亚甲蓝 图1·1坚牢绿（酸性染料）与亚甲蓝（碱性染料）的化学结构及其染色反应示意 染色(staining)是用染料使组织切片着色，便于镜下观察。天然和人工合成的染料甚多 它们都是含发色团的有机化合物，当染料具有助色团成为盐类物质，即可溶解于水并具电荷， 与组织有亲合力，使组织着色。含氨基（-NH2)、二甲氨基〔-N(CH3)2】等碱性助色团 的染料，称碱性染料(basic dye),它的盐溶液具阳电荷；含羧基(-C0OH)、羟基(- OH)或磺基(·SO3H)等酸性助色团的染料，称酸性染料(acid dye),它的溶液具阴电荷 (图1·)。组织的染色原理一般认为基于化学结合或物理吸附作用。细胞和组织的酸性物质 或结构与碱性染料亲合力强者，称嗜碱性(basophilia);而碱性物质或结构与酸性染料亲合 力强者，称嗜酸性(acidophilia);若与两种染料的亲合力均不强者，称中性(neutrophilia)。 组织的基本成分是蛋白质，构成蛋白质的氨基酸常是即有含氨基的，也有含羧基的，是两性电 解质。各种蛋白质的等电点因氨基酸成分的不同而异，其电荷性质又与溶液的H值相关，根据 研究目的选用合适的染色方法，调整好染液的H值，即可取得良好染色效果。常用的酸性染料
二、组织学研究方法 （一）一般光学显微镜术 应用一般光学显微镜（简称光镜）观察组织切片是组织学研究的最基本方法。取动物或人 体的新鲜组织块，先用固定剂（fixative）固定（fixation），使组织中的蛋白质迅速凝固，防 止细胞自溶和组织腐败。常用的固定剂如洒精、甲醛、醋酸、苦味酸、四氧化锇等，一般常将 几种固定剂配制成混合固定液，以抵消或减弱单种固定剂对组织的收缩或膨胀等缺点，达到更 好 固 定 效 果 。 固 定 后 的 组 织 块 （ 约 3 ～ 5mm 3 大 小 ） 用 石 蜡 、 火 棉 胶 或 树 脂 等 包 埋 （ embedding ） 成 硬 块 ， 以 切 片 机 （ microtome ） 切 成 5 ～ 10μm 厚 的 组 织 切 片 （ tissue section），切片贴在载玻片上经脱蜡等步骤后进行染色。组织块也可立即投入液氮（－ 196℃）内快速冻结，用恒冷箱切片机（cryostat）制成冷冻切片（frozen section），这种方法 制片迅速，细胞内酶活性保存较好，常用于酶组织化学染色。血细胞和分离培养的细胞可直接 涂在玻片上，制成涂片（smear）。疏松结缔组织和肠系膜等软组织可撕成薄片铺在玻片上 （铺片），牙和骨等坚硬组织可磨成薄片（磨片）。组织切片等标本经染色、透明后，以封固 剂和盖片封固，即可长期保存，镜下观察。 图1－1 坚牢绿（酸性染料）与亚甲蓝（碱性染料）的化学结构及其染色反应示意 染色（staining）是用染料使组织切片着色，便于镜下观察。天然和人工合成的染料甚多, 它们都是含发色团的有机化合物，当染料具有助色团成为盐类物质，即可溶解于水并具电荷， 与组织有亲合力，使组织着色。含氨基（－NH2）、二甲氨基〔－N（CH3）2〕等碱性助色团 的染料，称碱性染料（basic dye），它的盐溶液具阳电荷；含羧基（－COOH）、羟基（－ OH）或磺基（－SO3H）等酸性助色团的染料，称酸性染料（acid dye），它的溶液具阴电荷 （图1－1）。组织的染色原理一般认为基于化学结合或物理吸附作用。细胞和组织的酸性物质 或结构与碱性染料亲合力强者，称嗜碱性（basophilia）；而碱性物质或结构与酸性染料亲合 力强者，称嗜酸性（acidophilia）；若与两种染料的亲合力均不强者，称中性(neutrophilia)。 组织的基本成分是蛋白质，构成蛋白质的氨基酸常是即有含氨基的，也有含羧基的，是两性电 解质。各种蛋白质的等电点因氨基酸成分的不同而异，其电荷性质又与溶液的pH值相关，根据 研究目的选用合适的染色方法，调整好染液的pH值，即可取得良好染色效果。常用的酸性染料
如伊红、坚牢绿、橙黄G等，碱性染料如苏木精、亚甲蓝、碱性品红等。组织学中最常用的是 苏木精(hematoxylin)和伊红(cosin)染色法，简称HE染色法。苏木精使细胞核和胞质内的 嗜碱性物质着蓝紫色，伊红使细胞质基质和间质内的胶原纤维等着红色， 物理吸附作用的染色方法，如用苏丹染料显示脂肪组织，染料溶于脂肪内，使细胞内的脂 滴显色。又如用硝酸银、氯化金等重金属盐显示细胞和组织的某些结构，则是使金属微粒附着 在结构表面而呈棕黑色或棕黄色。银染法中有些组织结构可直接使硝酸银还原而显示，称此为 亲银性(argentaffin);有些结构无直接还原作用，需加入还原剂方能显色，则称为嗜银性 (argyrophilia)。还有些组织成分如结缔组织和软骨基质中的糖氨多糖，当用甲苯胺蓝 (toluidine blue)等碱性染料染色后呈紫红色，这种现象称为异染性(metachromasia),其原理 可能是该染料在溶液中呈单体状态时显蓝色，当它与多阴离子的高分子物质耦合后，染料分子 聚合成多聚体而显红色（图1·2）。还有些染色方法的原理至今还不清楚。 染料分子 美老制质染料分子聚合 异染性（红色）正染性（蓝色） 图1-2异染性示意图 (二)几种特殊显微镜的应用 I.荧光显微镜荧光显微镜(fluorescence microscope)是用来观察标本中的自发荧光物 质或以荧光素染色或标记的细胞和结构。荧光显微镜是以高压汞灯产生的短波紫外线为光源， 并配有激发、阻断、吸热和吸收紫外线等滤片系统，标本中的荧光物质在紫外线激发下产生各 种颜色的荧光，借以研究该荧光物质在细胞和组织内的分布。组织中的自发性荧光物质如神经 细胞和心肌细胞等内的脂褐素呈棕黄色荧光，肝贮脂细胞和视网膜色素上皮细胞内的维生素A 呈绿色荧光，某些神经内分泌细胞和神经纤维内的单胺类物质（儿茶酚胺、5-羟色胺、组胺 等)在甲醛作用下呈不同颜色的荧光，组织内含有的奎宁、四环素等药物也呈现一定的荧光。 细胞内的某些成分可与荧光素结合而显荧光，如溴化乙锭与吖啶橙可与DNA综合，进行细胞内 DNA含量测定。荧光显微镜更广泛用于免疫细胞化学研究，即以异硫氰酸或罗丹明等荧光素标 记抗体（一抗或二抗），用该标记抗体直接或间接地与细胞内的相应抗原结合，以检测该抗原 的存在与分布
如伊红、坚牢绿、橙黄G等，碱性染料如苏木精、亚甲蓝、碱性品红等。组织学中最常用的是 苏木精（hematoxylin）和伊红（eosin）染色法，简称HE染色法。苏木精使细胞核和胞质内的 嗜碱性物质着蓝紫色，伊红使细胞质基质和间质内的胶原纤维等着红色。 物理吸附作用的染色方法，如用苏丹染料显示脂肪组织，染料溶于脂肪内，使细胞内的脂 滴显色。又如用硝酸银、氯化金等重金属盐显示细胞和组织的某些结构，则是使金属微粒附着 在结构表面而呈棕黑色或棕黄色。银染法中有些组织结构可直接使硝酸银还原而显示，称此为 亲银性（argentaffin）；有些结构无直接还原作用，需加入还原剂方能显色，则称为嗜银性 （argyrophilia）。还有些组织成分如结缔组织和软骨基质中的糖氨多糖，当用甲苯胺蓝 （toluidine blue）等碱性染料染色后呈紫红色，这种现象称为异染性(metachromasia)，其原理 可能是该染料在溶液中呈单体状态时显蓝色，当它与多阴离子的高分子物质耦合后，染料分子 聚合成多聚体而显红色（图1－2）。还有些染色方法的原理至今还不清楚。 图1－2 异染性示意图 (二)几种特殊显微镜的应用 1．荧光显微镜 荧光显微镜（fluorescence microscope）是用来观察标本中的自发荧光物 质或以荧光素染色或标记的细胞和结构。荧光显微镜是以高压汞灯产生的短波紫外线为光源， 并配有激发、阻断、吸热和吸收紫外线等滤片系统，标本中的荧光物质在紫外线激发下产生各 种颜色的荧光，借以研究该荧光物质在细胞和组织内的分布。组织中的自发性荧光物质如神经 细胞和心肌细胞等内的脂褐素呈棕黄色荧光，肝贮脂细胞和视网膜色素上皮细胞内的维生素A 呈绿色荧光，某些神经内分泌细胞和神经纤维内的单胺类物质（儿茶酚胺、5－羟色胺、组胺 等）在甲醛作用下呈不同颜色的荧光，组织内含有的奎宁、四环素等药物也呈现一定的荧光。 细胞内的某些成分可与荧光素结合而显荧光，如溴化乙锭与吖啶橙可与DNA综合，进行细胞内 DNA含量测定。荧光显微镜更广泛用于免疫细胞化学研究，即以异硫氰酸或罗丹明等荧光素标 记抗体（一抗或二抗），用该标记抗体直接或间接地与细胞内的相应抗原结合，以检测该抗原 的存在与分布
2.相差显微镜相差显微镜(phase contrast microscope)是用于观察组织培养中活细胞形 态结构的。活细胞无色透明，一般光镜下不易分辨细胞轮廓及其结构。相差显微镜的特点是将 活细胞不同厚度及细胞内各种结构对光产生的不同折射作用，转换为光密度差异（明暗差）， 使镜下结构反差明显，影像清楚。组织培养研究常用的是倒置相差显微镜(inverted phase contrast microscope),它的光源和聚光器在载物台的上方，物镜在载物台的下方，便于观察 贴附在培养器皿底壁上的活细胞. 3.暗视野显微镜暗视野显微镜(dark-field microscope)主要用于观察因反差或分辨力不 足的微小颗粒。此种显微镜主要是有一个暗视野集光器，使光线不直接进入物境，故呈暗视 野。而标本内的小颗粒产生的衍射光或散射光进入物镜，暗视野中的颗粒呈明亮小点，如同在 暗室可见一束光线中的微小尘粒一般。普通通光镜最大分辨率为0.2μm,暗视野显微镜则可分 辨0.004~0.2μm的微粒，适用于观察细胞内线粒体运动及标本中细菌等微粒的运动等。 4,.共集激光扫描显微镜共焦激光扫描显微镜（confocal laser scanning microscope,.CLSM)是近10年研制成的高光敏度、高分辨率的新型仪器。它以激光为光源，光 束经聚焦后落在样品（组织厚片或细跑）不同深度的微小一点，并作移动扫描，通过电信号彩 色显像，经过微机图像分析系统进行二维和三维分析处理。CLSM可对细胞进行三维结构图像 分析，细胞内各种荧光标记物的微量分析，细胞内C+、pH值等的动态分析测定，细胞的受 体移动、膜电位变化、酶活性和物质转运的测定，并以激光对细胞及其染色体进行切割、分 离、筛选和克隆。因此，CLSM是一种高技术产品，可对细胞的多种功能进行全自动、高效、 快速的微量定性和定量测定。 其他如偏光显微镜用于研究组织晶体物质及纤维等的光学性质，紫外光显微镜用于研究细 胞内核酸的分布与定量等】 (三)组织化学和细胞化学术 组织化学(histochemistry)和细胞化学(cytochemistry)技术是通过化学或物理反应原理 显示组织切片细胞内某种化学成分，进行定位、定量及其与功能相关的研究。如糖类、脂类、 酶、核酸等与试剂发生化学物理反应，形成有色终末产物，在光镜下观察，有的可在电镜下观 察。 I.糖类显示多糖和蛋白多糖的常用方法是过碘酸-雪夫反应(periodic acid Schiff reaction,.PAS反应)·基本原理是过碘酸的氧化作用先使糖分子的乙二醇基变为乙二醛基，后 者继而与Schiffi试剂（无色亚硫酸品红复合物）结合，形成紫红色反应产物（图1-3）·颜色 反应的深浅取决于组织内多糖的乙二醇分子的多寡
2．相差显微镜 相差显微镜（phase contrast microscope）是用于观察组织培养中活细胞形 态结构的。活细胞无色透明，一般光镜下不易分辨细胞轮廓及其结构。相差显微镜的特点是将 活细胞不同厚度及细胞内各种结构对光产生的不同折射作用，转换为光密度差异（明暗差）， 使镜下结构反差明显，影像清楚。组织培养研究常用的是倒置相差显微镜（inverted phase contrast microscope），它的光源和聚光器在载物台的上方，物镜在载物台的下方，便于观察 贴附在培养器皿底壁上的活细胞。 3．暗视野显微镜 暗视野显微镜（dark-field microscope）主要用于观察因反差或分辨力不 足的微小颗粒。此种显微镜主要是有一个暗视野集光器，使光线不直接进入物境，故呈暗视 野。而标本内的小颗粒产生的衍射光或散射光进入物镜，暗视野中的颗粒呈明亮小点，如同在 暗室可见一束光线中的微小尘粒一般。普通通光镜最大分辨率为0.2μm，暗视野显微镜则可分 辨0.004～0.2μm的微粒，适用于观察细胞内线粒体运动及标本中细菌等微粒的运动等。 4 ． 共 集 激 光 扫 描 显 微 镜 共 焦 激 光 扫 描 显 微 镜 （ confocal laser scanning microscope,CLSM）是近10年研制成的高光敏度、高分辨率的新型仪器。它以激光为光源，光 束经聚焦后落在样品（组织厚片或细胞）不同深度的微小一点，并作移动扫描，通过电信号彩 色显像，经过微机图像分析系统进行二维和三维分析处理。CLSM可对细胞进行三维结构图像 分析，细胞内各种荧光标记物的微量分析，细胞内Ca 2+、pH值等的动态分析测定，细胞的受 体移动、膜电位变化、酶活性和物质转运的测定，并以激光对细胞及其染色体进行切割、分 离、筛选和克隆。因此，CLSM是一种高技术产品，可对细胞的多种功能进行全自动、高效、 快速的微量定性和定量测定。 其他如偏光显微镜用于研究组织晶体物质及纤维等的光学性质，紫外光显微镜用于研究细 胞内核酸的分布与定量等。 （三）组织化学和细胞化学术 组织化学（histochemistry）和细胞化学（cytochemistry）技术是通过化学或物理反应原理 显示组织切片细胞内某种化学成分，进行定位、定量及其与功能相关的研究。如糖类、脂类、 酶、核酸等与试剂发生化学物理反应，形成有色终末产物，在光镜下观察，有的可在电镜下观 察。 1 ． 糖 类 显 示 多 糖 和 蛋 白 多 糖 的 常 用 方 法 是 过 碘 酸 － 雪 夫 反 应 （ periodic acid Schiff reaction,PAS反应）。基本原理是过碘酸的氧化作用先使糖分子的乙二醇基变为乙二醛基，后 者继而与Schiff试剂（无色亚硫酸品红复合物）结合，形成紫红色反应产物（图1－3）。颜色 反应的深浅取决于组织内多糖的乙二醇分子的多寡
CH.OH CHOH o CIL.OH 11 F(S0:I为 (亚所酸品红》 敦红色物) 图1-3PAS反应原理示意图 2,脂类脂类物质包括脂肪和类脂。标本用甲醛固定，冷冻切片，脂类保存较好。多用苏 丹染料、油红0、尼罗蓝等溶于脂类的染料染色，使脂质呈色。也可用四氧化饿(OsO4)染 色，脂肪酸或胆碱可使0s04还原为0s02而呈黑色， 3.酶细胞内的酶种类甚多，有氧化还原酶、水解酶、合成酶、转移酶等几类，目前已有 100多种酶组织化学染色法。酶组化反应的基本原理是利用酶对其相应底物的水解、氧化等作 用，然后再使底物的反应产物与某种捕获剂发生反应，形成沉淀或有色的最终产物，借此检测 该酶在组织切片或细胞内的分布及活性强弱。如细胞的磷酸酶是一种重要的水解酶，碱性磷酸 酶(ALP)和酸性磷酸酶(ACP)在合适的pH条件下可水解有机磷酸脂。小肠上皮细胞表面的 纹状缘和肾近曲小管表面的刷状缘处，微绒毛含有丰富的ALP,与物质的吸收和转运功能相 关；许多细胞的溶酶体内则含大量ACP,参与细胞内物质代谢。这两种酶均可以B-甘油磷酸 钠为底物，底物被水解产生磷酸根，再以Ca2+、C02+(显示ALP)或Pb2+(显示ACP)捕获磷酸 根，最后用硫化铵处理，即形成硫化钴或硫化铅黑色最终产物，出现在组织切片中该酶存在的 部位。因此，酶组化染色不是酶本身的直接显色，而是酶作用底物的化学反应产物显色的。 4.核酸显示DNA的传统方法是Feulgen反应，切片先用稀盐酸处理，使DNA分子中脱氧 核糖与嘌呤之间的连接键打开，形成醛基，再与Schiff试剂作用，原理同PAS反应，使细胞核 DNA显紫红色。还可用甲基绿-焦宁染色法同时显示DNA和RNA,这两种染料都是碱性，甲 基绿使细胞核内的DNA呈蓝绿色，焦宁使细胞质和核仁内的RNA呈红色
图1－3 PAS反应原理示意图 2．脂类脂类物质包括脂肪和类脂。标本用甲醛固定，冷冻切片，脂类保存较好。多用苏 丹染料、油红O、尼罗蓝等溶于脂类的染料染色，使脂质呈色。也可用四氧化锇（OSO4）染 色，脂肪酸或胆碱可使OSO4还原为OSO2而呈黑色。 3．酶细胞内的酶种类甚多，有氧化还原酶、水解酶、合成酶、转移酶等几类，目前已有 100多种酶组织化学染色法。酶组化反应的基本原理是利用酶对其相应底物的水解、氧化等作 用，然后再使底物的反应产物与某种捕获剂发生反应，形成沉淀或有色的最终产物，借此检测 该酶在组织切片或细胞内的分布及活性强弱。如细胞的磷酸酶是一种重要的水解酶，碱性磷酸 酶（ALP）和酸性磷酸酶（ACP）在合适的pH条件下可水解有机磷酸脂。小肠上皮细胞表面的 纹状缘和肾近曲小管表面的刷状缘处，微绒毛含有丰富的ALP，与物质的吸收和转运功能相 关；许多细胞的溶酶体内则含大量ACP，参与细胞内物质代谢。这两种酶均可以β－甘油磷酸 钠为底物，底物被水解产生磷酸根，再以Ca 2+、Co 2+ (显示ALP)或Pb 2+（显示ACP）捕获磷酸 根，最后用硫化铵处理，即形成硫化钴或硫化铅黑色最终产物，出现在组织切片中该酶存在的 部位。因此，酶组化染色不是酶本身的直接显色，而是酶作用底物的化学反应产物显色的。 4．核酸 显示DNA的传统方法是Feulgen反应，切片先用稀盐酸处理，使DNA分子中脱氧 核糖与嘌呤之间的连接键打开，形成醛基，再与Schiff 试剂作用，原理同PAS反应，使细胞核 DNA显紫红色。还可用甲基绿－焦宁染色法同时显示DNA和RNA，这两种染料都是碱性，甲 基绿使细胞核内的DNA呈蓝绿色，焦宁使细胞质和核仁内的RNA呈红色
抗原 抗情 光 巴+一 被过化物 铁蛋白 图1·4免疫细胞化学术示意图 图1·5人呼吸道分离上皮细胞粘蛋白免疫荧光像 (美国戴维斯加州大学吴忍教授供图) (四)免疫细胞化学术 免疫细胞化学(immunocytochemistry)术是应用抗原与抗体结合的免疫学原理，检测细 胞内多肽、蛋白质及膜表面抗原和受体等大分子物质的存在与分布。这种方法特异性强，敏感 度高，进展迅速，应用广泛，成为生物学和医学众多学科的重要研究手段。近年随着纯化抗原 和制备单克隆抗体的广泛开展以及标记技术不断提高，免疫细胞化学的进展更是日新月异，不 仅用于许多基本理论的研究，并取得重大突破，而且也用于疾病的早期快速诊断等临床实际。 组织的多肽和蛋白质种类繁多，具有抗原性。分离纯化人或动物组织某种蛋白质，作为抗原注 入另一种动物体内，后者即产生相应的特异性抗体（免疫球蛋白）。从被免疫动物的血清中提 取出该抗体，再以荧光素、酶、铁蛋白或胶体金标记，用这种标记抗体处理组织切片或细胞， 标记抗体即与细胞的相应蛋白质（抗原）发生特异性结合（图14）。常用的荧光素是异硫氰酸 荧光素(FITC)和四甲基异硫氰酸罗丹明(TRITC)，在荧光显微镜下可观察荧光抗体抗原复
图1－4 免疫细胞化学术示意图 图1－5 人呼吸道分离上皮细胞粘蛋白免疫荧光像 （美国戴维斯加州大学 吴忍教授供图） （四）免疫细胞化学术 免疫细胞化学（immunocytochemistry）术是应用抗原与抗体结合的免疫学原理，检测细 胞内多肽、蛋白质及膜表面抗原和受体等大分子物质的存在与分布。这种方法特异性强，敏感 度高，进展迅速，应用广泛，成为生物学和医学众多学科的重要研究手段。近年随着纯化抗原 和制备单克隆抗体的广泛开展以及标记技术不断提高，免疫细胞化学的进展更是日新月异，不 仅用于许多基本理论的研究，并取得重大突破，而且也用于疾病的早期快速诊断等临床实际。 组织的多肽和蛋白质种类繁多，具有抗原性。分离纯化人或动物组织某种蛋白质，作为抗原注 入另一种动物体内，后者即产生相应的特异性抗体（免疫球蛋白）。从被免疫动物的血清中提 取出该抗体，再以荧光素、酶、铁蛋白或胶体金标记，用这种标记抗体处理组织切片或细胞， 标记抗体即与细胞的相应蛋白质（抗原）发生特异性结合（图1-4)。常用的荧光素是异硫氰酸 荧光素（FITC)和四甲基异硫氰酸罗丹明（TRITC），在荧光显微镜下可观察荧光抗体抗原复
合物（图1-5）。常用的酶是辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase,.HRP,从辣根菜中提取 的)，它的底物是3,3-二氨基、联苯胺(DAB)和H2O2,HRP使DAB氧化形成棕黄色产物， 可在光镜和电镜下观察（图1-6）。铁蛋白和胶体金标记抗体与抗原的结合，也可在光镜和电 镜下观察（图1·7）。 图1-6大鼠腺垂体免疫组织化学(PAS法)示生长激素细胞 (上海医科大赵培林教授供图) 图17免疫细胞化学（蛋白A-胶体金法）和原位杂交术示大鼠垂体 催乳素细胞电镜像N催乳素细胞核 ↑分泌颗粒内显示金粒 粗面内质网(RER)显示银粒 (加拿大Douglas医院研究中心童毅爱博士赠图)
合物（图1－5）。常用的酶是辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase,HRP,从辣根菜中提取 的），它的底物是3，3 '－二氨基、联苯胺（DAB）和H2O2 ,HRP使DAB氧化形成棕黄色产物， 可在光镜和电镜下观察（图1－6）。铁蛋白和胶体金标记抗体与抗原的结合，也可在光镜和电 镜下观察（图1－7）。 图1－6 大鼠腺垂体免疫组织化学（PAS法）示生长激素细胞 （上海医科大赵培林教授供图） 图1-7 免疫细胞化学（蛋白A-胶体金法）和原位杂交术示大鼠垂体 催乳素细胞电镜像 N催乳素细胞核 ↑分泌颗粒内显示金粒 粗面内质网（RER）显示银粒 （加拿大Douglas医院研究中心童毅爱博士赠图）
标记抗体民被检抗原的结合方式有两种。一是直接法，即如上述用标记抗体与样品中的抗 原直接结合（图1~8）。这种方法操作简便，但敏感度不及间接法。间接法是将分离的抗体 (第一抗体简称一抗)再作为抗原免疫另一种动物，制备该抗体（抗原）的抗体（第二抗体简 称二抗)，再以标记物标记二抗。先后以一抗和标记二抗处理样品，最终形成抗原一抗·标记 二抗复合物（图1~8）。间接法中的一个抗原分子可通过一抗与多个标记二抗相结合，因此它 的敏感度较高，而且目前国内外均有多种标记二抗商品供应，使用方便。间接法中较常用的是 一种称之为过氧化物酶·抗过氧化物酶复合物法（peroxidase-antiperoxidase complexmethod,PAS法)，该法除需一抗和二抗外，还需制备HRP标记的抗酶抗体，即以HRP 作为抗原免疫动物，制成抗HRP抗体，再以HRP标记该抗体制成由3个酶分子与2个抗酶抗体组 成的相当稳定的环形PAP复合物。标本先后以一抗、二抗和PAP复合物处理后，再以DAB显 色，即可检测抗原的分布。此法由于细胞内的抗原通过抗体的层层放大而与多个酶分子结合 因此敏感性很强（图1-9）。 标记抗体 十·第抗体 标本 图抗原 图1-8免疫细胞化学直接法(A)与间接法(B)示意图 -PAP合物 第二抗体---心 一一第二抗休 -·-一第-拉 图1-9免疫细胞化学PAP法示意图 免疫细胞化学术近10年来又有新进展，如生物素·亲合素等新颖试剂的应用，为检测微量 抗原、受体、抗体开辟了新途径。生物素(biotir)又称维生素H,是从卵黄和肝中提取的一种 小分子物质（分子量244.3l);亲合素(avidin)又称卵白素，是从卵白中提取的一种糖蛋白 (分子量68kD)。每个亲合素分子有生物素结合的4个位点，二者可牢固结合成不可逆的复合 物。生物素-亲合素的应用大致有三种方法。①标记亲合素-生物素法(labelled avidin- biotin method,LAB法)：将亲合素与标记物(HRP)结合，一个亲合素可结合多个HRP;将 生物素与抗体（一抗与二抗）结合，一个抗体分子可连接多个生物素分子，抗体的活性不受影 响。细胞的抗原（或通过一抗）先与生物素化的抗体结合，继而将标记亲合素结合在抗体的生 物素上，如此多层放大提高了检测抗原的敏感性（图1~10）。②桥连亲合素~生物素法
标记抗体民被检抗原的结合方式有两种。一是直接法，即如上述用标记抗体与样品中的抗 原直接结合（图1－8）。这种方法操作简便，但敏感度不及间接法。间接法是将分离的抗体 （第一抗体简称一抗）再作为抗原免疫另一种动物，制备该抗体（抗原）的抗体（第二抗体简 称二抗），再以标记物标记二抗。先后以一抗和标记二抗处理样品，最终形成抗原一抗－标记 二抗复合物（图1－8）。间接法中的一个抗原分子可通过一抗与多个标记二抗相结合，因此它 的敏感度较高，而且目前国内外均有多种标记二抗商品供应，使用方便。间接法中较常用的是 一 种 称 之 为 过 氧 化 物 酶 － 抗 过 氧 化 物 酶 复 合 物 法 （ peroxidase-antiperoxidase complexmethod,PAS法），该法除需一抗和二抗外，还需制备HRP标记的抗酶抗体，即以HRP 作为抗原免疫动物，制成抗HRP抗体，再以HRP标记该抗体制成由3个酶分子与2个抗酶抗体组 成的相当稳定的环形PAP复合物。标本先后以一抗、二抗和PAP复合物处理后，再以DAB显 色，即可检测抗原的分布。此法由于细胞内的抗原通过抗体的层层放大而与多个酶分子结合， 因此敏感性很强（图1－9）。 图1－8 免疫细胞化学直接法（A）与间接法（B）示意图 图1－9 免疫细胞化学PAP法示意图 免疫细胞化学术近10年来又有新进展，如生物素－亲合素等新颖试剂的应用，为检测微量 抗原、受体、抗体开辟了新途径。生物素（biotin）又称维生素H，是从卵黄和肝中提取的一种 小分子物质（分子量244.31）；亲合素（avidin）又称卵白素，是从卵白中提取的一种糖蛋白 （分子量68kD）。每个亲合素分子有生物素结合的4个位点，二者可牢固结合成不可逆的复合 物。生物素－亲合素的应用大致有三种方法。①标记亲合素－生物素法（labelled avidinbiotin method,LAB法）：将亲合素与标记物（HRP）结合，一个亲合素可结合多个HRP；将 生物素与抗体（一抗与二抗）结合，一个抗体分子可连接多个生物素分子，抗体的活性不受影 响。细胞的抗原（或通过一抗）先与生物素化的抗体结合，继而将标记亲合素结合在抗体的生 物素上，如此多层放大提高了检测抗原的敏感性（图1－10）。②桥连亲合素－生物素法
(bridged avidin-biotin method,BAB法)：先使抗原与生物素化的抗体结合，再以游离亲合素 将生物素化的抗体与酶标生物素搭桥连接，也达到多层放大效果（图1·10）。③亲合素·生 物素-过氧化物酶复合物法(avidin--biotin--peroxidase complexmethod,ABC法)；此法是前两 种方法的改进，即先按一定比例将亲合素与酶标生物素结合在一起，形成亲合素~生物素·过 氧化物酶复合物(ABC复合物)，标本中的抗原先后与一抗、生物素化二抗、ABC复合物结 合，最终形成晶格样结构的复合体，其中网络了大量酶分子，从而大大提高了检测抗原的灵敏 度（图1·I0)。现有配制现成的ABC药盒商品供应，操作简便，是目前广泛应用的一种方 法。 一过策化物酶 合 图1-10生物素-亲合素免疫细胞化学示意图 (1)标记亲合素-生物素法 (2)桥连亲合素·生物素法 (3)亲合素-生物素-过氧化物酶复合物法(ABC法) (五)同位素示踪术
（bridged avidin-biotin method,BAB法)：先使抗原与生物素化的抗体结合，再以游离亲合素 将生物素化的抗体与酶标生物素搭桥连接，也达到多层放大效果（图1－10）。③亲合素－生 物素－过氧化物酶复合物法（avidin-biotin-peroxidase complexmethod,ABC法）；此法是前两 种方法的改进，即先按一定比例将亲合素与酶标生物素结合在一起，形成亲合素－生物素－过 氧化物酶复合物（ABC复合物），标本中的抗原先后与一抗、生物素化二抗、ABC复合物结 合，最终形成晶格样结构的复合体，其中网络了大量酶分子，从而大大提高了检测抗原的灵敏 度（图1－10）。现有配制现成的ABC药盒商品供应，操作简便，是目前广泛应用的一种方 法。 图1－10 生物素－亲合素免疫细胞化学示意图 （1）标记亲合素－生物素法 （2）桥连亲合素－生物素法 （3）亲合素－生物素－过氧化物酶复合物法（ABC法） （五）同位素示踪术
