【南开大学】【案例】【胡萝卜汁经选定的双岐杆菌发酵后其中微生物数量和某些有机成分的变化_微生物发酵工程】.doc_大学文库

微生物发酵工程案例教学胡萝卜汁经选定的双岐杆菌发酵后其中微生物数量和某些有机成分的变化 Szila'rd Kun,Judit M.Rezessy-Szabo',Quang D.Nguyen *A'goston Hoschke Corvinus University of Budapest,Faculty of Food Science,Department of Brewing and Distilling,H-1118 Budapest,Me'nesi u't 45,Hungary 文章相关信息文章历史：收到于2007年8月5日经修订后收到于2008年3月25日接受于2008年3月27日 (何迪翻译) 摘要：益生菌在许多方面都对人类的健康有利。绝大多数的益生菌食品是日常食品，他们不能被对牛奶蛋白过敏或有严重的乳糖不耐症的人所使用。在寻找替代食品的过程中，未经加工过的胡萝卜汁通过双岐杆菌(B.lactis Bb-12,B.bifidum B7.1andB3.2)的作用作为益生菌产品而被尝试。把新鲜的胡萝卜汁通过80℃20分钟的巴氏杀菌法，减少微生物的数量使其低于要求的限度(10 colony-forming unit (cu)/ml)。所有测试的双岐杆菌在没有添加其他营养的纯胡萝卜汁中都能良好的生长。在六个小时的培养后，10'cfu/m1的初始细胞浓度增加到了10cfu/ml,并且一直到发酵结束(24h)都保持了良好的活力。单位体积的B.1 actis Bb-12,B.bifidum B7.1和B.bifidum B3.2产生的产品体积分别为2.16*1010cfu/1 h,4.65*1010cfu/1h,and3.85*1010cfu/1h。由于菌种的剧烈代谢，胡萝卜汁的pH值小于4.5。在发酵的过程中，葡萄糖和蔗糖的含量都显著的下降。与此同时，果糖的浓度却没有改变。胡萝卜素 (a-carotene and b-carotene)含量由于菌株的不同而在15-45%之间。生产的乳糖和醋酸的浓度分别在 14.8-16.7mg/ml和3.3-5.3mg/ml系列浓度之间。关键词：双歧杆菌益生菌胡萝卜汁有机酸发酵类胡萝卜素 1、前沿益生菌在人类的健康方面有多方面的优势。由于大多数益生菌食品是乳制品，它们不能被对牛奶蛋白过敏或对乳糖有严重无耐受力的人所消耗。寻找替代食品来源的同时，是否适宜用双歧杆菌株（湾乳白僵菌12湾双歧杆菌B7.1和B3.2)以胡萝卜汁为原料的生产益生菌食品已经展开研究。巴氏灭菌的新鲜胡萝卜汁80℃20分钟后微生物种群减少至低于检测限(10集落形成单位(cfu)/ml)。所有测试的双歧杆菌株能在纯胡萝卜汁中良好生长而不用补充营养。此外，在培养6个小时后，10'cfu/ml的初始细胞浓度变为10CFU/ml,并保持活力至发酵结束(24小时)。B.1 actis Bb-12,B.bifidum B7.1和B.bifidum 1

微生物发酵工程案例教学 1 胡萝卜汁经选定的双岐杆菌发酵后其中微生物数量和某些有机成分的变化 Szila′ rd Kun, Judit M. Rezessy-Szabo′ , Quang D. Nguyen *, A′ goston Hoschke Corvinus University of Budapest, Faculty of Food Science, Department of Brewing and Distilling, H-1118 Budapest, Me′nesi u′t 45, Hungary 文章相关信息文章历史：收到于2007年8月5日经修订后收到于2008年3月25日接受于2008年3月27日（何迪翻译）摘要：益生菌在许多方面都对人类的健康有利。绝大多数的益生菌食品是日常食品，他们不能被对牛奶蛋白过敏或有严重的乳糖不耐症的人所使用。在寻找替代食品的过程中，未经加工过的胡萝卜汁通过双岐杆菌(B. lactis Bb-12, B. bifidum B7.1 and B3.2)的作用作为益生菌产品而被尝试。把新鲜的胡萝卜汁通过80℃20分钟的巴氏杀菌法，减少微生物的数量使其低于要求的限度(10 colony-forming unit (cfu)/ml)。所有测试的双岐杆菌在没有添加其他营养的纯胡萝卜汁中都能良好的生长。在六个小时的培养后，107 cfu/m l的初始细胞浓度增加到了108 cfu /ml，并且一直到发酵结束（24h）都保持了良好的活力。单位体积的B. lactis Bb-12, B. bifidum B7.1和 B.bifidum B3.2产生的产品体积分别为2.16*1010 cfu/l h, 4.65 *1010 cfu/l h, and 3.85*1010 cfu/l h。由于菌种的剧烈代谢，胡萝卜汁的pH值小于4.5。在发酵的过程中，葡萄糖和蔗糖的含量都显著的下降。与此同时，果糖的浓度却没有改变。胡萝卜素（a-carotene and b-carotene）含量由于菌株的不同而在15-45%之间。生产的乳糖和醋酸的浓度分别在 14.8–16.7 mg/ml 和 3.3–5.3 mg/ml系列浓度之间。关键词：双歧杆菌益生菌胡萝卜汁有机酸发酵类胡萝卜素 1、前沿益生菌在人类的健康方面有多方面的优势。由于大多数益生菌食品是乳制品，它们不能被对牛奶蛋白过敏或对乳糖有严重无耐受力的人所消耗。寻找替代食品来源的同时，是否适宜用双歧杆菌株（湾乳白僵菌 12 湾双歧杆菌 B7.1 和 B3.2 ）以胡萝卜汁为原料的生产益生菌食品已经展开研究。巴氏灭菌的新鲜胡萝卜汁 80℃20 分钟后微生物种群减少至低于检测限（ 10 集落形成单位（cfu） /ml）。所有测试的双歧杆菌株能在纯胡萝卜汁中良好生长而不用补充营养。此外，在培养 6 个小时后，107 cfu/ml 的初始细胞浓度变为 108 CFU/ ml，并保持活力至发酵结束（24 小时）。B. lactis Bb-12, B. bifidum B7.1 和 B.bifidum

微生物发酵工程案例教学 B3.2的单位体积产率分别为是2.16*10°cfu/1h,4.65*10cfu/1h和3.85*10cfu/1h。由于菌种的激烈代谢，胡萝卜汁培养基被酸化至pH值小于4.5。在发酵过程中，葡萄糖和蔗糖含量显著下降。与此同时，果糖浓度没有改变。根据使用菌种的不同，类胡萝卜素(-胡萝卜素和b-胡萝卜素)的降解介于1545%之间。乳酸和醋酸产量分别为14.716.7毫克/毫升和3.35.3毫克/毫升。最近的社会和经济发展可能会导致严重的健康问题。人们的压力和繁忙的生活方式导致所谓的文明病，如心脏病，高血压，肠道疾病，以及各种癌症.不适当的营养摄入可能会导致结肠癌并对免疫系统产生不利影响，而一个平衡的营养摄入可以保证健康长寿。一个防止或消除这些疾病的有希望的解决方案是设计和食用的益生菌食品含有活的微生物有机体[1]。临床证据表明，益生菌食品可以通过维持或改善其肠道微生物的平衡造福人类[2]。这些微生物有许多健康促进效果，如减轻乳糖不耐症[3]，预防肠道感染和结肠癌[4]，加强免疫系统[5]，降低血清胆固醇水平[6]，刺激钙的吸收，合成维生素（维生素B,烟酸和叶酸）[7]，加强蛋白质消化率。他们还充当经由食物传染的病原体的拮抗剂 [8]。大多数被人们食用的益生菌食品主要包括乳酸菌和/或双歧杆菌，有些产品甚至包含肠球菌或酵母菌如啤酒酵母菌[9]。其中，双歧杆菌在人类肠道微生物生态系统中有一个突出的重要性[10]。历史上，双歧杆菌在1899年由亨利勒蒂舍尔在法国巴黎的巴斯德研究所分离和描述。它是一种革兰氏阳性菌，DNA中具有高G+C含量(>55mol%)[11],并栖息在人类和动物的肠道内。形态上，双歧杆菌是不静止不动，不产孢子，多型棒状外观，稍微弯曲和呈棒状，并往往带分枝.双歧杆菌属根据酶系统能够利用各种单糖和寡糖。不同于乳酸菌或其他微生物，双歧杆菌的葡萄糖（己糖）代谢是独特的，它常常被称为'双歧途径。这一途径的关键酶是果糖-6-磷酸酮酶(F6PPK),它使克里弗斯磷酸果糖裂解为4-磷酸赤藓糖和乙酰磷酸[12]。从理论上说，通过双歧通路，1mo1的葡萄糖发酵生成1mol乳酸和 1.5mol醋酸[13]。然而，在实践中，由于丙酮酸的加磷酸裂解，可能会有一些偏离这个比例。而且，许多双歧杆菌的种类正被用于工业生产益生菌乳制品如B.animalis,subsp.lactis,B. bifidum,B.longum,和B.breve。上述细菌的潜在应用高度依赖于他们的生理和工艺特性，包括生长和发育，氧和耐酸性，糖类的利用和代谢物，临床试验结果等，不同的菌种有不同的特性。其中一个最普遍的工业用双歧杆菌菌株是B.lactis Bb-12(Chr.汉森A/S公司，丹麦)，因为这株有许多生理和技术优势，如临床证明生理特性[14]，氧和耐酸性[15,16]，尽管它并不源自人类.绝大多数的商用益生菌是牛奶的发酵产品，然而它却不能被正在遭受乳糖不耐症和/或对牛奶过敏的人们食用。近年来，消费者对非基于牛奶益生菌产品的需求有所增加[17]，并且益生菌食品被并入饮料的范围，也作为片剂，胶囊剂或冻干药剂的补充供应市场[18]。胡萝卜（胡萝卜L)是一种日常厨房中最常用的和众所周知的蔬菜之一，含丰富的功能性食品成分，如维生素(A,D,B,E,C和K)和矿物质（钙，钾，磷，钠，铁）。有人指出，100克的胡萝卜含有6毫克到 2

微生物发酵工程案例教学 2 B3.2 的单位体积产率分别为是 2.16 *1010cfu/l h， 4.65 *1010cfu/l h 和 3.85 * 1010cfu/l h。由于菌种的激烈代谢，胡萝卜汁培养基被酸化至 pH 值小于 4.5 。在发酵过程中，葡萄糖和蔗糖含量显著下降。与此同时，果糖浓度没有改变。根据使用菌种的不同，类胡萝卜素（a-胡萝卜素和 b-胡萝卜素）的降解介于 15~45％之间。乳酸和醋酸产量分别为 14.7~16.7 毫克/毫升和 3.3~5.3 毫克/毫升。最近的社会和经济发展可能会导致严重的健康问题。人们的压力和繁忙的生活方式导致所谓的文明病，如心脏病，高血压，肠道疾病，以及各种癌症.不适当的营养摄入可能会导致结肠癌并对免疫系统产生不利影响，而一个平衡的营养摄入可以保证健康长寿。一个防止或消除这些疾病的有希望的解决方案是设计和食用的益生菌食品含有活的微生物有机体[ 1 ] 。临床证据表明，益生菌食品可以通过维持或改善其肠道微生物的平衡造福人类[ 2 ] 。这些微生物有许多健康促进效果，如减轻乳糖不耐症[ 3 ] ，预防肠道感染和结肠癌[ 4 ] ，加强免疫系统[ 5 ] ，降低血清胆固醇水平[ 6 ] ，刺激钙的吸收，合成维生素（维生素 B ，烟酸和叶酸） [ 7 ] ，加强蛋白质消化率。他们还充当经由食物传染的病原体的拮抗剂 [ 8 ] 。大多数被人们食用的益生菌食品主要包括乳酸菌和/或双歧杆菌，有些产品甚至包含肠球菌或酵母菌如啤酒酵母菌[ 9 ] 。其中，双歧杆菌在人类肠道微生物生态系统中有一个突出的重要性[ 10 ] 。历史上，双歧杆菌在 1899 年由亨利勒蒂舍尔在法国巴黎的巴斯德研究所分离和描述。它是一种革兰氏阳性菌，DNA 中具有高 G + C 含量（>55mol％） [ 11 ]，并栖息在人类和动物的肠道内。形态上，双歧杆菌是不静止不动，不产孢子，多型棒状外观，稍微弯曲和呈棒状，并往往带分枝.双歧杆菌属根据酶系统能够利用各种单糖和寡糖。不同于乳酸菌或其他微生物，双歧杆菌的葡萄糖（己糖）代谢是独特的，它常常被称为'双歧途径。这一途径的关键酶是果糖-6-磷酸酮酶（ F6PPK ），它使克里弗斯磷酸果糖裂解为 4-磷酸赤藓糖和乙酰磷酸[ 12 ] 。从理论上说，通过双歧通路，1mol 的葡萄糖发酵生成 1mol 乳酸和 1.5mol 醋酸[ 13 ] 。然而，在实践中，由于丙酮酸的加磷酸裂解，可能会有一些偏离这个比例。而且，许多双歧杆菌的种类正被用于工业生产益生菌乳制品如 B.animalis， subsp. lactis, B. bifidum, B. longum, 和 B. breve。上述细菌的潜在应用高度依赖于他们的生理和工艺特性，包括生长和发育，氧和耐酸性，糖类的利用和代谢物，临床试验结果等，不同的菌种有不同的特性。其中一个最普遍的工业用双歧杆菌菌株是 B. lactis Bb-12（ Chr.汉森 A / S 公司，丹麦），因为这株有许多生理和技术优势，如临床证明生理特性[ 14 ] ，氧和耐酸性[ 15,16 ] ，尽管它并不源自人类.绝大多数的商用益生菌是牛奶的发酵产品，然而它却不能被正在遭受乳糖不耐症和/或对牛奶过敏的人们食用。近年来，消费者对非基于牛奶益生菌产品的需求有所增加[ 17 ] ，并且益生菌食品被并入饮料的范围，也作为片剂，胶囊剂或冻干药剂的补充供应市场[ 18 ] 。胡萝卜（胡萝卜 L）是一种日常厨房中最常用的和众所周知的蔬菜之一,含丰富的功能性食品成分，如维生素（A，D，B,E,C 和 K ）和矿物质（钙，钾，磷，钠，铁）。有人指出，100 克的胡萝卜含有 6 毫克到

微生物发酵工程案例教学 15毫克的类胡萝卜素，其中主要是B-胡萝卜素(2~10毫克)[19]。因此，增加胡萝卜的摄入量可能促进维生素A的大规模合成。此外，存在于胡萝卜中的类胡萝卜素和其他抗氧化剂对抑制和/或中断氧化过程以及在平衡自由基活动中发挥重要作用[20]。因此，胡萝卜可保护人类远离某些类型的癌症和心血管疾病.此外胡萝卜的过敏作用非常低或没有.因此，胡萝卜可以被正在遭受牛奶蛋白过敏和乳糖不耐症的人群所使用。处理发酵胡萝卜汁产物的研究可以在文献中[21,22]找到，但研究人员使用的是乳酸菌。在这项研究中，微生物数量和一些主要化学物质在胡萝卜汁双歧杆菌发酵过程中的变化被研究。我们进一步调查的目的是确定胡萝卜汁作为生产非牛奶为基础的益生菌饮品的原料的适应能力。 (陈少隆翻译) 2.材料和方法 2.1胡萝卜汁胡萝卜采购自当地的商店。在充分的洗净了以后，他们被去皮并且再一次的被冲洗。通过使用Santos 的榨汁机而被榨汁。这中间没有补充养分，也没有添加水。 2.2培养基 Trypticase-Phytone-Yeast medium(TPY)包含有(per litre)分解胰胨(BBL)l0g,phytone(BBL) 5g,糖5g,酵母提取物(Difco)2.5g,Tween801ml,L-半胱氨酸HC10.5g,K2HP042g,MgC12·6H20 0.5g,ZnS04·7H200.25g,CaC120.15g,FeC130.03g.它的pH约在6.0[12]. RCM medium包含有(per litre)酵母提取物(Difco)3g,牛肉提取物(BBL)10g,蛋白胨10g,糖 5g,可溶性淀粉1g,NaC15g,CH3C02Na3g,L-半胱氨酸HC10.5g.pH通过1NNa0H被调整到6.8 [23]. Beeren的琼脂培养基包含有(per1itre)哥伦比亚琼脂(0 xoid CM.33l)44g,糖5g,L-半胱氨酸 HC10.5g,琼脂5g,丙酸5ml.丙酸在灭菌后的培养基中被加入，并且最终使pH通过1 N NaOH被调整到5.0[24]. TPY琼脂是TPY培养基通过琼脂达到浓度15g/1. 2.3微生物及其保存两株双岐杆菌菌种是从人类粪便中分离出来的并且被鉴定为B.bifidum(B3.2andB7.1)[25].B. lactis Bb-12购买于Chr.Hansen A/S(Hosholm,丹麦).双岐杆菌是先在厌氧条件（在Bugbox厌氧条件， Ruskinn技术)在TPY培养基中在37℃大约24h. 2.4测定细胞浓度 2.4.1双岐杆菌 3

微生物发酵工程案例教学 3 15 毫克的类胡萝卜素，其中主要是β -胡萝卜素（ 2 ~1 0 毫克） [ 19 ] 。因此，增加胡萝卜的摄入量可能促进维生素 A 的大规模合成。此外，存在于胡萝卜中的类胡萝卜素和其他抗氧化剂对抑制和/或中断氧化过程以及在平衡自由基活动中发挥重要作用[ 20 ] 。因此，胡萝卜可保护人类远离某些类型的癌症和心血管疾病.此外胡萝卜的过敏作用非常低或没有.因此，胡萝卜可以被正在遭受牛奶蛋白过敏和乳糖不耐症的人群所使用。处理发酵胡萝卜汁产物的研究可以在文献中[ 21,22 ]找到，但研究人员使用的是乳酸菌。在这项研究中，微生物数量和一些主要化学物质在胡萝卜汁双歧杆菌发酵过程中的变化被研究. 我们进一步调查的目的是确定胡萝卜汁作为生产非牛奶为基础的益生菌饮品的原料的适应能力。（陈少隆翻译） 2.材料和方法 2.1胡萝卜汁胡萝卜采购自当地的商店。在充分的洗净了以后，他们被去皮并且再一次的被冲洗。通过使用Santos 的榨汁机而被榨汁。这中间没有补充养分，也没有添加水。 2.2培养基 Trypticase–Phytone–Yeast medium (TPY) 包含有(per litre) 分解胰胨 (BBL)10 g, phytone (BBL) 5 g, 糖 5 g, 酵母提取物 (Difco) 2.5 g, Tween 80 1 ml, L-半胱氨酸HCl 0.5 g, K2HPO4 2 g, MgCl2·6H2O 0.5 g, ZnSO4·7H2O 0.25 g, CaCl2 0.15 g,FeCl3 0.03 g.它的pH约在 6.0 [12]. RCM medium 包含有 (per litre) 酵母提取物(Difco) 3 g, 牛肉提取物 (BBL)10 g, 蛋白胨 10 g, 糖 5 g, 可溶性淀粉 1 g, NaCl 5 g, CH3CO2Na 3 g, L-半胱氨酸HCl 0.5 g. pH 通过1N NaOH被调整到 6.8 [23]. Beeren的琼脂培养基包含有 (per litre) 哥伦比亚琼脂 (Oxoid CM331) 44 g,糖 5 g, L-半胱氨酸 HCl 0.5 g, 琼脂 5 g, 丙酸 5 ml. 丙酸在灭菌后的培养基中被加入，并且最终使pH 通过1N NaOH被调整到 5.0 [24]. TPY 琼脂是 TPY 培养基通过琼脂达到浓度15 g/l. 2.3微生物及其保存两株双岐杆菌菌种是从人类粪便中分离出来的并且被鉴定为B.bifidum (B3.2 and B 7.1) [25]. B. lactis Bb-12购买于 Chr. Hansen A/S(Hosholm, 丹麦). 双岐杆菌是先在厌氧条件 (在Bugbox 厌氧条件, Ruskinn 技术) 在 TPY 培养基中在 37℃ 大约24 h. 2.4测定细胞浓度 2.4.1双岐杆菌

微生物发酵工程案例教学 Beeren琼脂培养基被用作选择培养基，TPY琼脂被用来确定双岐杆菌的浓度。发酵液样品被稀释lO倍后被均等的转移到培养皿中，并通过合适的培养基混合。在凝固后，培养板在厌氧条件下在厌氧罐+GasPak 体系下或Bugbox.厌氧室中在37℃下培养。菌群在48h或72h的培养后进行计数。 2.4.2微生物数量总的需氧的嗜温菌，亚硫酸盐还原梭状芽孢杆菌，肠细菌，大肠杆菌，假单胞菌，乳酸菌，酵母菌，霉菌数量特性是由不同培养基平板的不同的蔬菜培养基底物来决定的，还有培养的温度和时间。一般来说，所有的样本在培养前都连续的稀释了十倍。在总的需氧的嗜温菌的情况下，胰蛋白胨，葡萄糖，酵母琼脂（胰蛋白胨0.5%，葡萄糖0.1%，酵母膏0.25%，琼脂1.5%)的培养基被使用。在培养样品后，平板在30℃需氧的条件下培育24-48小时。亚硫酸盐还原梭状芽孢杆菌在铁硫酸钠琼脂(IS015213)上计数。培养皿在厌氧的条件下在厌氧+ GasPak系统中在37℃进行24-48小时的培养。其中所含的氧通过AnaeroGenTM sachet(OxoidAN225)去除。在大肠杆菌的情况下，实验在大肠杆菌琼脂(Scharlau01-287)并辅助以rosolic酸(Scharlau 06-O85CASE)的条件下进行。在计数前，平板在厌氧条件下37℃进行24小时的培养。假单胞菌的数量和肠细菌的数量通过假单胞菌选择性琼脂(Oxoid CM559)来确定，分别辅助以假单胞菌选择性助剂(Oxoid SRO103E)和紫红胆汁葡萄糖琼脂培养基(Merck)。菌群在37℃厌氧条件下24小时后被计数。乳酸菌在Man-Rogosa-Sharpe琼脂(Scharlau)培养基上厌氧条件下在30℃下48-96小时后进行计数。酵母和霉菌的浓度是在Rose Bengal chloramphenicol3琼脂培养基(Merck)上测定的。平板是在厌氧条件下在25℃下培养的，不同的是酵母菌培养48-72小时，而霉菌培养72-140小时。 2.5发酵过程胡萝卜汁(150ml培养基/250mlf1ask三角瓶)接种双岐杆菌，并且在厌氧条件下在37℃下通过厌氧 +GasPak.系统(OXOID)或Bugbox厌氧室。样品定期采样，并且记录双岐杆菌的CFU和由微生物污染物的数量。同时，还要进行H的测定。此外，碳水化合物，乳酸和醋酸，以及类胡萝卜素的含量都被测定。 2.6碳水化合物，乙醇，有机酸和类胡萝卜素的分析在胡萝卜汁的上清液中，糖，有机酸和乙醇的含量决定于所采用的不同的高压液相色谱的方法 [26,27]。为了确定糖，乙醇和有机酸的含量，在2ml的样品中加入了2ml的0.5mol/1H2S04,充分混合 30秒，并且离心(14,000转，10min)。上清液用0.45微米的膜(Waters,Mi1ford,MA,USA)来过滤。分析 4

微生物发酵工程案例教学 4 Beeren琼脂培养基被用作选择培养基， TPY琼脂被用来确定双岐杆菌的浓度。发酵液样品被稀释10倍后被均等的转移到培养皿中，并通过合适的培养基混合。在凝固后，培养板在厌氧条件下在厌氧罐+ GasPak 体系下或Bugbox厌氧室中在37℃下培养。菌群在48h或72h的培养后进行计数。 2.4.2微生物数量总的需氧的嗜温菌，亚硫酸盐还原梭状芽孢杆菌，肠细菌，大肠杆菌，假单胞菌，乳酸菌，酵母菌，霉菌数量特性是由不同培养基平板的不同的蔬菜培养基底物来决定的，还有培养的温度和时间。一般来说，所有的样本在培养前都连续的稀释了十倍。在总的需氧的嗜温菌的情况下，胰蛋白胨，葡萄糖，酵母琼脂（胰蛋白胨0.5 ％，葡萄糖0.1 ％，酵母膏0.25 ％，琼脂1.5 ％）的培养基被使用。在培养样品后，平板在30℃需氧的条件下培育24-48小时。亚硫酸盐还原梭状芽孢杆菌在铁硫酸钠琼脂（ISO15213）上计数。培养皿在厌氧的条件下在厌氧+ GasPak系统中在37℃进行24-48小时的培养。其中所含的氧通过AnaeroGenTM sachet (OxoidAN25)去除。在大肠杆菌的情况下，实验在大肠杆菌琼脂(Scharlau 01-287)并辅助以rosolic酸(Scharlau 06-085CASE)的条件下进行。在计数前，平板在厌氧条件下37℃进行24小时的培养。假单胞菌的数量和肠细菌的数量通过假单胞菌选择性琼脂(Oxoid CM559)来确定，分别辅助以假单胞菌选择性助剂(Oxoid SR0103E)和紫红胆汁葡萄糖琼脂培养基(Merck)。菌群在37℃厌氧条件下24小时后被计数。乳酸菌在Man–Rogosa–Sharpe琼脂(Scharlau)培养基上厌氧条件下在30℃下48-96小时后进行计数。酵母和霉菌的浓度是在Rose Bengal chloramphenicol琼脂培养基(Merck)上测定的。平板是在厌氧条件下在25℃下培养的，不同的是酵母菌培养48-72小时，而霉菌培养72-140小时。 2.5发酵过程胡萝卜汁(150 ml 培养基/250 ml flask三角瓶)接种双岐杆菌，并且在厌氧条件下在37℃下通过厌氧 + GasPak系统(OXOID)或Bugbox厌氧室。样品定期采样，并且记录双岐杆菌的CFU和由微生物污染物的数量。同时，还要进行pH的测定。此外，碳水化合物，乳酸和醋酸，以及类胡萝卜素的含量都被测定。 2.6碳水化合物，乙醇，有机酸和类胡萝卜素的分析在胡萝卜汁的上清液中，糖，有机酸和乙醇的含量决定于所采用的不同的高压液相色谱的方法 [26,27]。为了确定糖，乙醇和有机酸的含量，在2ml的样品中加入了2 ml的0.5 mol/l H2SO4，充分混合 30秒，并且离心(14,000转，10 min)。上清液用0.45微米的膜(Waters,Milford, MA, USA)来过滤。分析

微生物发酵工程案例教学的进行利用了W610泵的高压液相色谱，高压液相色谱的控制器，717plus的自动加样，W410的折射指数(RI) 和光电二极管阵列(PDA)探测器。恒温控制室的温度设定在45℃，通过Aminex HPX-87H离子排斥色谱柱，用5mMH2S04作为流动相流速为0.5ml/min。数据的采集与处理使用Mi11 enniumTM4.0软件包。每个样品被测定3次。样品中的标准有机酸（乳酸，乙酸，苹果，柠檬酸，琥珀酸，硫酸和草酸）和糖（葡萄糖，果糖，蔗糖，麦芽糖，半乳糖，麦芽三糖，maltotetraose和棉子糖)以及乙醇被鉴定并且定量的测定含量。为了确定类胡萝卜素的含量，下面的高压液相色谱方法被使用[28]。10mi11 itres的甲醇添加到锥形瓶的5ml的胡萝卜汁中并充分摇匀。在此之后，加入40ml的5：35的甲醇：1,2-二氯乙烷，并且充分摇匀。然后加入几滴双蒸馏水入上述混合物来确保相之间的分离。把混合物加入到分液漏斗中，收集底层的含有胡萝卜素的溶剂，通过把上层的溶剂一滴滴的移出并且把剩下的溶剂在真空中蒸发。残留物被溶解到5ml 高压液相色谱程度的丙酮中。用一个Nucleosi1100C18(240mm_4.6mmi.d.)的柱来梯度洗脱，洗脱液用A液（甲醇）和B液 (60:25:15的异丙醇：丙酮：水)溶剂。流速为1ml/min并且用450nm的二极管列阵检测器来检测存在的类胡萝卜素的含量。b-anda-carotenes的标准都来自Sigma.。在所有的液相色谱分析中，采用国内的标准来审计测量方法。 2.7统计分析结果的平均值，标准偏差的三份测定值及方差分析使用了在MS Windows version 12下的SPSS软件包 (SPSS Inc.,USA)。 3.结果和讨论 3.1胡萝卜汁的热处理的影响在发酵过程的监控中，实验的设立采用了传统的微生物学的方法。热处理（巴氏杀菌，消毒）通常用于消除或减少来自于土壤，水或手上的微生物污染物。最主要的处理要求是确保产品的微生物方面的安全性。然而，这一技术也导致了许多的胡萝卜汁培养基的变化，如维生素和酶的降解和诱导的Maillard反应。这就减少了生物对碳水化合物和游离氨基酸的利用。考虑到含有若干不稳定成分的胡萝卜汁的营养价值，轻微的热处理是可行的。在本研究中，巴氏杀菌对微生物数量的影响，糖（蔗糖，葡萄糖和果糖）的含量，以及胡萝卜汁的H都进行了测定。巴氏消毒是在80℃下进行15-20分钟。糖和类胡萝卜素的含量在测定中并没有显著的变化，pH值也是（数据没有显示）.在没有杀菌的情况下，需氧嗜温菌的总含量约为106cfu/ml。这一结果远高于由Nagy-Gasztonyi et al报道的结果(3*103cfu/ml)[29]。但是他同Song et al的数据相吻合[30]。亚硫酸盐还原梭状芽孢杆菌低于检测限度(102cfu/ml)。肠杆菌的细胞浓度，大肠杆菌，假 5

微生物发酵工程案例教学 5 的进行利用了W610泵的高压液相色谱，高压液相色谱的控制器，717 plus的自动加样，W410的折射指数(RI) 和光电二极管阵列(PDA)探测器。恒温控制室的温度设定在45℃，通过Aminex HPX-87H离子排斥色谱柱，用5mM H2SO4作为流动相流速为0.5 ml/min。数据的采集与处理使用MillenniumTM 4.0软件包。每个样品被测定3次。样品中的标准有机酸（乳酸，乙酸，苹果，柠檬酸，琥珀酸，硫酸和草酸）和糖（葡萄糖，果糖，蔗糖，麦芽糖，半乳糖，麦芽三糖， maltotetraose 和棉子糖）以及乙醇被鉴定并且定量的测定含量。为了确定类胡萝卜素的含量，下面的高压液相色谱方法被使用[28]。10 millitres的甲醇添加到锥形瓶的5ml的胡萝卜汁中并充分摇匀。在此之后，加入40ml的5：35的甲醇：1，2-二氯乙烷，并且充分摇匀。然后加入几滴双蒸馏水入上述混合物来确保相之间的分离。把混合物加入到分液漏斗中，收集底层的含有胡萝卜素的溶剂，通过把上层的溶剂一滴滴的移出并且把剩下的溶剂在真空中蒸发。残留物被溶解到5ml 高压液相色谱程度的丙酮中。用一个Nucleosil 100C 18 (240 mm _ 4.6 mm i.d.)的柱来梯度洗脱，洗脱液用A液（甲醇）和B液（60:25:15的异丙醇：丙酮：水）溶剂。流速为1 ml/min并且用450 nm的二极管列阵检测器来检测存在的类胡萝卜素的含量。b- and a-carotenes的标准都来自Sigma。在所有的液相色谱分析中，采用国内的标准来审计测量方法。 2.7统计分析结果的平均值，标准偏差的三份测定值及方差分析使用了在MS Windows version 12下的SPSS软件包 (SPSS Inc., USA)。 3.结果和讨论 3.1胡萝卜汁的热处理的影响在发酵过程的监控中，实验的设立采用了传统的微生物学的方法。热处理（巴氏杀菌，消毒）通常用于消除或减少来自于土壤，水或手上的微生物污染物。最主要的处理要求是确保产品的微生物方面的安全性。然而，这一技术也导致了许多的胡萝卜汁培养基的变化，如维生素和酶的降解和诱导的Maillard反应。这就减少了生物对碳水化合物和游离氨基酸的利用。考虑到含有若干不稳定成分的胡萝卜汁的营养价值，轻微的热处理是可行的。在本研究中，巴氏杀菌对微生物数量的影响，糖（蔗糖，葡萄糖和果糖）的含量，以及胡萝卜汁的pH都进行了测定。巴氏消毒是在80℃下进行15-20分钟。糖和类胡萝卜素的含量在测定中并没有显著的变化，pH值也是（数据没有显示）.在没有杀菌的情况下，需氧嗜温菌的总含量约为106 cfu/ml。这一结果远高于由Nagy-Gasztonyi et al报道的结果(3 *103 cfu/ml) [29]。但是他同Song et al的数据相吻合[30]。亚硫酸盐还原梭状芽孢杆菌低于检测限度(102 cfu/ml)。肠杆菌的细胞浓度，大肠杆菌，假

微生物发酵工程案例教学单胞菌，乳酸菌和酵母菌的含量在103cfu/ml和105cfu/ml之间。霉菌的数量少于103cfu/ml。在所有被调查的微生物污染物中，仅仅有一些需氧的嗜温菌和大肠杆菌在胡萝卜汁的80℃15分钟的巴氏消毒后被检测出来。当巴氏消毒的时序时间增加到20分钟（在80℃下），所有调查的微生物污染物的细胞数低于了检测限度(101cfu/ml)。由于没有主要的化学成分的改变被观察到，，从保持相关的食品安全的角度上，上述的巴氏消毒法的参数被认为是一个适当的方法用以减少微生物污染物到一个可以接受的水平。 3.2初期双岐杆菌细胞数量对胡萝卜汁发酵能力和污染物微生物的影响大多数的双岐杆菌菌株不适合生长在人工培养基中，而需要如牛奶乳清或酵母提取物的混合含氮培养基中[3l]。Laine et al.[32]在观察了双岐杆菌在以麦片为基础的培养基中的表现后，报道了B.lactis B-12是不能生长的，即使加入了1%的大豆蛋白后。一种包含6%胡萝卜汁，12%白菜汁和3%洋葱汁的蔬菜培养基被报道说适合B.breve and B.bifidum[33]的繁殖。两种初始浓度(106cfu/ml和107cfu/ml)的B.1 actis Bb-12,B.bifidum B7.1,和B.bifidum B3.2 被用来提供给胡萝卜汁发酵。所有被测试的双岐杆菌被发现在没有营养添加剂的纯胡萝卜汁中能生长的很好。在初始细胞浓度为106cfu/ml的情况下，双岐杆菌的数量在发酵24小时后达到了108cfu/ml,并且到 32小时还保持了良好的活力，pH值也有高于6.0降低到了低于5.0。不幸的是，需氧嗜温菌的数量也成倍的增加，并达到了5*104cfu/ml和8*105cfu/ml之间。大肠杆菌的数量高出了检出限。在初始细胞浓度为107cfu/ml的情况下，6个小时的发酵酒足够让双岐杆菌的浓度达到108cfu/ml 的水平，并且仅能检测出低的需氧嗜温菌（约102cfu/ml)和大肠杆菌(101cfu/ml)的群落单位。在发酵 12小时后达到最大细胞浓度（高于108cfu/ml),并且细菌在24消失的发酵过程中保持了其活力。值得注意的是这种价值满足了我们在益生菌产品中对活细胞浓度的期望。同样，一些文献报道到[32,34,35]，关于蔬菜汁或果汁的初始发酵细胞浓度在107cfu/ml附近可以加快发酵过程并确保了自然的保存。 (李侃翻译) 3.3双歧杆菌和酸性产物在胡萝卜汁中的生长和产生益生菌的生长能力对发酵过程的成功进行是很重要的。此外，这些细菌的生存能力对有机产物的质量和稳定性是至关重要的。国际标准中描述说，那些声称有保健作用的发酵产物必须在其被购买时每克产品含有10？个活性益生菌。对在不同的实验室培养基和食物基质，如牛奶、豆奶和蔬菜等中双歧杆菌的生长和产生率都有过报道[36,37,38]。在胡萝卜汁的发酵中，双歧杆菌的细胞数的变化被列在表格一中，对B. lactis Bb-12菌株来说，在发酵十二小时时达到了最大细胞计数，8.221 og cfu,/ml,而B7.1而B3.2菌 6

微生物发酵工程案例教学 6 单胞菌，乳酸菌和酵母菌的含量在103 cfu/ml和105 cfu/ml之间。霉菌的数量少于103 cfu/ml。在所有被调查的微生物污染物中，仅仅有一些需氧的嗜温菌和大肠杆菌在胡萝卜汁的80℃15分钟的巴氏消毒后被检测出来。当巴氏消毒的时序时间增加到20分钟（在80℃下），所有调查的微生物污染物的细胞数低于了检测限度(101 cfu/ml)。由于没有主要的化学成分的改变被观察到，，从保持相关的食品安全的角度上，上述的巴氏消毒法的参数被认为是一个适当的方法用以减少微生物污染物到一个可以接受的水平。 3.2初期双岐杆菌细胞数量对胡萝卜汁发酵能力和污染物微生物的影响大多数的双岐杆菌菌株不适合生长在人工培养基中，而需要如牛奶乳清或酵母提取物的混合含氮培养基中[31]。Laine et al. [32] 在观察了双岐杆菌在以麦片为基础的培养基中的表现后，报道了B. lactis Bb-12是不能生长的，即使加入了1%的大豆蛋白后。一种包含6%胡萝卜汁，12%白菜汁和3%洋葱汁的蔬菜培养基被报道说适合B. breve and B. bifidum [33]的繁殖。两种初始浓度(106 cfu/ml 和 107 cfu/ml)的B. lactis Bb-12, B. bifidum B7.1,和 B. bifidum B3.2 被用来提供给胡萝卜汁发酵。所有被测试的双岐杆菌被发现在没有营养添加剂的纯胡萝卜汁中能生长的很好。在初始细胞浓度为106 cfu/ml的情况下，双岐杆菌的数量在发酵24小时后达到了108 cfu/ml，并且到 32小时还保持了良好的活力，pH值也有高于6.0降低到了低于5.0。不幸的是，需氧嗜温菌的数量也成倍的增加，并达到了5*104 cfu/ml 和8*105 cfu/ml之间。大肠杆菌的数量高出了检出限。在初始细胞浓度为 107 cfu/ml 的情况下，6 个小时的发酵酒足够让双岐杆菌的浓度达到 108 cfu/ml 的水平，并且仅能检测出低的需氧嗜温菌(约 102 cfu/ml)和大肠杆菌(101 cfu/ml)的群落单位。在发酵 12 小时后达到最大细胞浓度（高于 108 cfu/ml），并且细菌在 24 消失的发酵过程中保持了其活力。值得注意的是这种价值满足了我们在益生菌产品中对活细胞浓度的期望。同样，一些文献报道到[32,34,35]，关于蔬菜汁或果汁的初始发酵细胞浓度在 107 cfu/ml 附近可以加快发酵过程并确保了自然的保存。（李侃翻译） 3.3 双歧杆菌和酸性产物在胡萝卜汁中的生长和产生益生菌的生长能力对发酵过程的成功进行是很重要的。此外，这些细菌的生存能力对有机产物的质量和稳定性是至关重要的。国际标准中描述说，那些声称有保健作用的发酵产物必须在其被购买时每克产品含有 107 个活性益生菌。对在不同的实验室培养基和食物基质，如牛奶、豆奶和蔬菜等中双歧杆菌的生长和产生率都有过报道[36,37,38]。在胡萝卜汁的发酵中，双歧杆菌的细胞数的变化被列在表格一中，对 B. lactis Bb-12 菌株来说，在发酵十二小时时达到了最大细胞计数，8.22 log cfu/ml，而 B7.1 而 B3.2 菌

微生物发酵工程案例教学株的计数则分别为8.961 og cfu/ml和8.541 og cfu/ml。在短暂的迟滞期之后，全部三个菌株早在发酵进行六个小时的时候浓度就达到了103cfu/ml。B.lactis Bb-12、B.bifidum B7.1和B.bifidum B3.2 的单位体积生产力分别是2.16×10°cfu/1h,4.65×10°cfu/1h,and3.85×10°cfu/1h。与在文献中发表的数据相比较[39,40,41]，这些结果在10cfu/1h到10cfu/1h的值域内。Ventling和Mistry[39] 研究了在牛奶和超过滤牛奶中的双歧杆菌生长特征，表明在牛奶中长双歧杆菌的最大生产量为发酵第24 小时时的6.2×10cfu/ml,和单位体积生产力2.6×10°cfu/1h相符。虽然牛奶中含有双歧杆菌生长所需的所有必要成分，但由于牛奶中的营养并不总是处在可利用的形式或最理想的浓度，细菌在牛奶中一般生长缓慢[42]。不同的作者对双歧杆菌在豆奶中的生长也做过集中的研究[43,40]，且最大的细胞浓度在 107cfu/ml到109cfu/ml间不等。一般的，即使用同一菌株，在豆奶中双歧杆菌的单位体积生产力会比在牛奶中少。Heenan等人[36]培养益生菌的不同生长基质（不同的乳酸菌和两种益生菌菌株），报告说当使用MRS培养基时，B.lactis Bb-12的最大细胞数量was2.6×10cfu/ml。当研究B.1 actis Bb-12菌株在胡萝卜汁中的生长行为时，没有观察到迟滞期，而当使用如RCM和TPY等实验室培养基培养时，可记录到大约六个小时的迟滞期（未显示在数据中）。根据以上结果，胡萝卜汁看起来是双歧杆菌很有前景的一种培养基。 Table 1. Change of cell numbers of B.lactis Bb-12,B.bifidum B3.2,B.bifidum B7.1,inherent microbes,pH,ethanol,and total sugar concentrations during fermentation B.lactis Bb-12 B.bifidum B3.2 B.bifidum B7.1 Fermentation time(h) 0 6 12 24 0 6 1224 0 12 24 Bifidobacteria(og cfu/ml) 7.21±0268.17±0.14822±0.107.88±0.117.64±0.208.44±0.788.54±0.198.71±0.27714±0.248.47±0.548.96±0.398.82±0.38 Mesophilc aerobes (log cfu/ml)n.d. 1.00±0213.50±0.88222±0.86nd. n.d. 1.30±0211.54±028n.d. n.d. 1.00±0221.78±0.55 Coliforms (log cfu/ml) n.d. n.d. 1.68±0.47n.d. n.d. 197±0.821.85±0.46n.d.n.d. n.d. 124±0.17n.d p时 8.4 4.9 3 424 6.4 4.85 42 4.1564 4.9 42 4.15 Total sugars (wN,% 4.36±0214.12±0.813.91±0.773.81±0.52436±0.213.92±0.143.83±0.913.80±0.444.36±021414±0.413.94±0.823.88±0.31 Ethanol(mM) nd 1.11±0.121.64±0.243.07±023nd 189±0253.28±0.45549±0.58nd 1.44±0.01291±0.354.14±0.07 表格一：发酵过程中B.lactis Bb-12,B.bifidum B3.2,B.bifidum B7.1细胞数、固有微生物、pH、乙醇和总糖浓度的变化。纵向为发酵时间、双歧杆菌、中温需氧菌、大肠菌、H、总糖、乙醇。在所用被研究过的污染性微生物中，只有中温需氧菌和大肠杆菌在发酵中被发现。在发酵胡萝卜汁中 (24小时)，大肠杆菌的细胞浓度在检测极限以下，而中温需氧菌的浓度在10cfu/ml或更少。由于酸性代谢产物产生，胡萝卜汁的pH值从最初的6.4下降到4.2（表格一）。对所有被检测的胡萝卜汁中的双歧杆菌来说，开始六个小时中的酸性代谢产物都很浓。CCC14633婴儿双歧杆菌在豆奶中的生 7

微生物发酵工程案例教学 7 株的计数则分别为 8.96 log cfu/ml 和 8.54 log cfu/ml。在短暂的迟滞期之后，全部三个菌株早在发酵进行六个小时的时候浓度就达到了 108 cfu/ml。B. lactis Bb-12、B. bifidum B7.1 和 B. bifidum B3.2 的单位体积生产力分别是 2.16 ×1010cfu/l h, 4.65×1010cfu/l h, and 3.85×1010cfu/l h。与在文献中发表的数据相比较[39,40,41]，这些结果在 108 cfu/l h 到 1012cfu/l h 的值域内。Ventling 和 Mistry [39] 研究了在牛奶和超过滤牛奶中的双歧杆菌生长特征，表明在牛奶中长双歧杆菌的最大生产量为发酵第 24 小时时的 6.2×108 cfu/ml，和单位体积生产力 2.6 ×1010cfu/l h 相符。虽然牛奶中含有双歧杆菌生长所需的所有必要成分，但由于牛奶中的营养并不总是处在可利用的形式或最理想的浓度，细菌在牛奶中一般生长缓慢[42]。不同的作者对双歧杆菌在豆奶中的生长也做过集中的研究[43,40]，且最大的细胞浓度在 107cfu/ml 到 109cfu/ml 间不等。一般的，即使用同一菌株，在豆奶中双歧杆菌的单位体积生产力会比在牛奶中少。Heenan 等人 [36]培养益生菌的不同生长基质（不同的乳酸菌和两种益生菌菌株），报告说当使用 MRS 培养基时，B. lactis Bb-12 的最大细胞数量 was 2.6 ×108 cfu/ml。当研究 B. lactis Bb-12 菌株在胡萝卜汁中的生长行为时，没有观察到迟滞期，而当使用如 RCM 和 TPY 等实验室培养基培养时，可记录到大约六个小时的迟滞期（未显示在数据中）。根据以上结果，胡萝卜汁看起来是双歧杆菌很有前景的一种培养基。表格一：发酵过程中 B. lactis Bb-12, B. bifidum B3.2, B. bifidum B7.1 细胞数、固有微生物、pH、乙醇和总糖浓度的变化。纵向为发酵时间、双歧杆菌、中温需氧菌、大肠菌、pH、总糖、乙醇。在所用被研究过的污染性微生物中，只有中温需氧菌和大肠杆菌在发酵中被发现。在发酵胡萝卜汁中（24 小时），大肠杆菌的细胞浓度在检测极限以下，而中温需氧菌的浓度在 102 cfu/ml 或更少。由于酸性代谢产物产生，胡萝卜汁的 pH 值从最初的 6.4 下降到 4.2 （表格一）。对所有被检测的胡萝卜汁中的双歧杆菌来说，开始六个小时中的酸性代谢产物都很浓。CCRC14633 婴儿双歧杆菌在豆奶中的生

微生物发酵工程案例教学 201 (C) 2 2(C) ntation time(h) 图一：B.lactis Bb-12(A),B.bifidum B3.2(B)andB.bifidum B7.1(C)在胡萝卜汁发酵过程中糖的利用和代谢物生产。蔗糖、葡萄糖、果糖、乳酸和乙酸。在用Santos榨汁机制取的100ml纯胡萝卜汁中，含有大约20mgb-胡萝卜素和9mga-胡萝卜素。这一结果高于全国营养数据库中的数据（每100g8mgb-胡萝卜素和3mla-胡萝卜素）以及Singh[49]等人的数据（每100g2.2mgb-胡萝卜素），但与Demir[21]等人的数据一致(200ug/ml)。类胡萝卜素的含量取决于许多变量，比如胡萝卜的品种、土壤和天气状况等。24小时双歧杆菌发酵之后，-胡萝卜素和 b-胡萝卜素的含量均减少。当加入B.bifidum B7.1时，消耗量为10%的b-胡萝卜素和5%的a-胡萝卜素，而对于B.1 actis Bb-12数字分别为20%和15%。当用胡萝卜汁发酵B.bifidum B3.2时，类胡萝卜素含量下降最多(25%b-胡萝卜素和20%a-胡萝卜素)。这种下降一方面取决于细菌的新陈代谢，另一方面取决于发酵条件（温度，pH)[19,50]。在胡萝卜汁的发酵中，乳酸的产生比乙酸更多。众所周知，通过产生味道和结构，乳酸增加发酵有机产物的营养价值。在发酵的实现上，所有的菌株都检测到15-17mg/ml的乳酸，而乙酸浓度则在3.3-5.3 mg/ml之间（图一）。有趣的是，在研究以乳制品为基础的基质培养双歧杆菌产生短链脂肪酸的研究中显示，乙酸产生比乳酸合成更多。双歧杆菌的二氧化碳代谢，即“双歧途径”，可能大体上导致乙酸对乳酸3比2 的摩尔比率[45]。这个比率是理论值，而在实际发酵中，该值在各菌株中都有不同，并取决于亚株或甚至是发酵时间[48]。很多关于乳酸发酵必需营养成分的研究表明，越多添加含氮组分，乳酸产出浓度也越高。些研究对用蔬菜和/或水果汁作为原材料发酵益生菌产生有机产物也有报告。Gardner等人[35]报告了用蔬菜汁进行的对单一或混合乳酸菌的乳酸发酵（洋白菜、胡萝卜和洋葱混合）。他们发现乳酸和乙酸的浓度分别在3mg/ml到15mg/ml之间和1mg/ml到6mg/ml之间。最近的研究发现高矿物质含量[22]能促进胡萝卜汁中的乳酸发酵。结果显示双歧杆菌在乳酸产生方面与乳酸菌进行竞争。另外，在所有情况下，乳酸含量都高于乙酸含量。总的来说，可归结为，由于含氮物质和矿物质的存在，必然导致胡萝卜汁发酵产生的乳酸比乙酸更多。在所有被检测双歧杆菌菌株中，6小时发酵后的无细胞上清液中用高性能液相色谱也可检测到少量乙 9

微生物发酵工程案例教学 9 图一：B. lactis Bb-12 (A), B. bifidum B3.2 (B) and B. bifidum B7.1 (C)在胡萝卜汁发酵过程中糖的利用和代谢物生产。蔗糖、葡萄糖、果糖、乳酸和乙酸。在用 Santos 榨汁机制取的 100ml 纯胡萝卜汁中，含有大约 20mg b-胡萝卜素和 9mg a-胡萝卜素。这一结果高于全国营养数据库中的数据（每 100g 8mg b-胡萝卜素和 3ml a-胡萝卜素）以及 Singh [49] 等人的数据（每 100g 2.2mg b-胡萝卜素），但与 Demir [21] 等人的数据一致（200 ug/ml）。类胡萝卜素的含量取决于许多变量，比如胡萝卜的品种、土壤和天气状况等。24 小时双歧杆菌发酵之后，a-胡萝卜素和 b-胡萝卜素的含量均减少。当加入 B. bifidum B7.1 时，消耗量为 10%的 b-胡萝卜素和 5%的 a-胡萝卜素，而对于 B. lactis Bb-12 数字分别为 20%和 15%。当用胡萝卜汁发酵 B. bifidum B3.2 时，类胡萝卜素含量下降最多（25% b-胡萝卜素和 20% a-胡萝卜素）。这种下降一方面取决于细菌的新陈代谢，另一方面取决于发酵条件（温度，pH）[19,50]。在胡萝卜汁的发酵中，乳酸的产生比乙酸更多。众所周知，通过产生味道和结构，乳酸增加发酵有机产物的营养价值。在发酵的实现上，所有的菌株都检测到 15–17 mg/ml 的乳酸，而乙酸浓度则在 3.3–5.3 mg/ml 之间（图一）。有趣的是，在研究以乳制品为基础的基质培养双歧杆菌产生短链脂肪酸的研究中显示，乙酸产生比乳酸合成更多。双歧杆菌的二氧化碳代谢，即“双歧途径”，可能大体上导致乙酸对乳酸 3 比 2 的摩尔比率[45]。这个比率是理论值，而在实际发酵中，该值在各菌株中都有不同，并取决于亚株或甚至是发酵时间[48]。很多关于乳酸发酵必需营养成分的研究表明，越多添加含氮组分，乳酸产出浓度也越高。一些研究对用蔬菜和/或水果汁作为原材料发酵益生菌产生有机产物也有报告。Gardner 等人[35]报告了用蔬菜汁进行的对单一或混合乳酸菌的乳酸发酵（洋白菜、胡萝卜和洋葱混合）。他们发现乳酸和乙酸的浓度分别在 3 mg/ml 到 15 mg/ml 之间和 1 mg/ml 到 6 mg/ml 之间。最近的研究发现高矿物质含量[22]能促进胡萝卜汁中的乳酸发酵。结果显示双歧杆菌在乳酸产生方面与乳酸菌进行竞争。另外，在所有情况下，乳酸含量都高于乙酸含量。总的来说，可归结为，由于含氮物质和矿物质的存在，必然导致胡萝卜汁发酵产生的乳酸比乙酸更多。在所有被检测双歧杆菌菌株中，6 小时发酵后的无细胞上清液中用高性能液相色谱也可检测到少量乙