第八章 发酵过程 发酵过程即细胞的生物反应过程，是指由生长繁殖的细胞所引起的生物反应 过程。它不仅包括了以往“发酵”的全部领域，而且还包括固定化细胞的反应过程、 生物法废水处理过程和细菌采矿等过程。微生物发酵的生产水平不仅取决于生产 菌种本身的性能，而且要赋以合适的环境条件才能使它的生产能力充分表达出 来。为此我们必须通过各种研究方法了解有关生产菌种对环境条件的要求，如培 养基、培养温度、pH、氧的需求等，并深入地了解生产菌在合成产物过程中的 代谢调控机制以及可能的代谢途径，为设计合理的生产工艺提供理论基础。同时， 为了掌握菌种在发酵过程中的代谢变化规律，可以通过各种监测手段如取样测定 随时间变化的菌体浓度，糖、氮消耗及产物浓度，以及采用传感器测定发酵罐中 的培养温度 pH、溶解氧等参数的情况，并予以有效地控制，使生产菌种处于产 物合成的优化环境之中。 第一节 发酵过程的代谢变化规律 代谢变化就是反映发酵过程中菌体的生长，发酵参数（培养基，培养条件等） 和产物形成速率三者间的关系。 了解生产菌种在具有合适的培养基、pH、温度和通气搅拌等环境条件下对 基质的利用、细胞的生长以及产物合成的代谢变化，有利于人们对生产的控制。 代谢曲线：代谢变化是反映发酵过程中菌体的生长，发酵参数（培养基，培 养条件等）和产物形成速率三者间的关系。把它们随时间变化的过程绘制成图， 就成为所说的代谢曲线。发酵过程按进行过程有三种方式： （1）分批发酵(Batch fermentation) （2）补料分批发酵(Fed-batch fermentation) （3）连续发酵(Continuous fermentation) 本节主要介绍分批发酵、补料分批发酵及连续发酵三种类型的操作方式下的 代谢特征。 一、分批发酵 1、分批发酵的定义 是指在一封闭系统内含有初始限量基质的发酵方式。在这一过程中，除了氧 气、消泡剂及控制 pH 的酸或碱外，不再加入任何其它物质。发酵过程中培养基 成分减少，微生物得到繁殖。 2、分批发酵的特点 微生物所处的环境在发酵过程中不断变化，其物理，化学和生物参数都随时
间而变化，是一个不稳定的过程。 3、分批发酵的优缺点 优点： ⚫ 操作简单； ⚫ 操作引起染菌的概率低。 ⚫ 不会产生菌种老化和变异等问题 缺点： 非生产时间较长、设备利用率低。 4、分批发酵的生长曲线 单细胞微生物的生长曲线 （2）丝状真菌的生长曲线 在液体振荡培养(或深层通气培养)中，以菌丝干重作为衡量生长的指标，可 获得如图所示的生长曲线。在静止培养中也可获得类似的生长曲线。 丝状真菌的生长过程大致可分为；①生长延滞期；②迅速生长期；③衰退期。 ①生长延滞期 造成生长延滞的原因有两种：一是孢子萌发前的真正的延滞期，另一种是生 长已开始但却无法测量。对真菌的生长延滞期尚未作过仔细研究。 ②迅速生长期 此时菌丝体干重迅速增加，其立方根与时间成直线关系。因为真菌不是单细 胞，其繁殖不以几何倍数增加，故而没有对数生长期。真菌的生长常表现为菌丝 尖端的生长和菌丝的分枝，因此受到邻近细胞竞争营养物质的影响。尤其在静止 培养时，许多菌丝在空气中生长，必须从邻近的细胞吸收营养物质供生长需要， 在迅速生长期中，碳、氮、磷被迅速利用，呼吸强度达到顶峰，代谢产物如酸类 可出现或不出现。静止培养时，在迅速生长期的后期的菌膜上格出现孢子。 ③衰退期 真菌生长进入衰退期的标志，是菌丝干重下降。一般是在一短期内失重很快， 以后不再变化。但有些真菌则发生菌丝体自溶，由于其自身所产生的酶类催化几 丁质、蛋白质、核酸等分解而释放出氨、游离氨基酸、有机磷化物和有机硫化合 物等。处于衰退期的菌丝体的细胞，除顶端较幼细胞的原生质比较稠密均匀外， 大多数细胞都出现大的空泡。 生长的停止由以下两种因素之一所决定。在高浓度培养基中，可能是因为有 毒代谢产物的积累而阻碍生长，如在高浓度碳水化合物的培养基中可积累有机
酸；在含有机氮高的培养基中可积累氨。多数次生物质，如抗生素等，也是在此 时合成的。在较稀释的、营养物质平衡良好的培养基中，生长停止的主要因素是 碳水化合物的耗尽。当生长停止后，菌丝体的自溶裂解的程度，因菌种的本性和 培养条件而导。 5、分批发酵的类型 通常有两种分类方式： （1）Gaden's fermentation classification（按照菌体生长，碳源利用和产物生 成的变化） ①第一类型（生长关联型） 产物直接来源于产能的初级代谢（自身繁殖所必需的代谢），菌体生长与产 物形成不分开（见下图）。例如单细胞蛋白和葡萄糖酸的发酵。 其动力学方程为：
②第二类型（部分生长关联型） 产物也来源于能量代谢所消耗的基质，但产物的形成在与初级代谢分开的次 级代谢中，出现两个峰，菌体生长进入稳定期，出现产物形成高峰（见下图）。 例如，柠檬酸和某些氨基酸的发酵。 其动力学方程为 ③第三类型 产物是在基质消耗和菌体生长之后，菌体利用中间代谢反应来形成的，即产 物的形成和初级代谢是分开的（见下图）。如抗生素发酵。 其动力学方程为： （2）Piret's fermentation classification （按照产物生成与菌体生长是否同步） ①生长关联型 (第一类型) 形成与生长有关，如酒精、某些酶等。 ：产物合成的比速率 ：生长关联型产物的形成比例（ 产物 菌体） 或 Q Q P Xdt dP P dt dP g g x / = = = = = + = + Xdt dP P dt dP Q X X = = = Xdt dP P dt dP Q X
其动力学方程为： ②生长无关联型（第二，三类型）产物的形成速度与生长无关，只与细胞积 累量有关。如，抗生素。杀念珠菌素发酵中葡萄糖、DNA、抗生素产量的代谢 变化 A：DNA；B：葡萄糖；C：杀念珠菌素产量 6，分批发酵的分类对实践的指导意 义 从上述分批发酵类型可以分析：如果生产的产品是生长关联型（如菌体与初级 代谢产物），则宜采用有利于细胞生长的培养条件，延长与产物合成有关的对数 生长期；如果产品是非生长关联型（如次级代谢产物），则宜缩短对数生长期， 并迅速获得足够量的菌体细胞后延长平衡期，以提高产量。7，典型的分批发酵 工艺流程 ：比生长速率（ ） ：菌体生长为基准的产物的率（ ） 产物形成比速率（ ） h Y Q Q Y g g g h L P x P P P x 1 / / / : / − =
二、补料分批发酵 1、定义 补料分批发酵又称半连续发酵或流加分批发酵，是指在分批发酵过程中，间 歇或连续地补加新鲜培养基的发酵方式。2、补料分批发酵的优缺点 优点： ⚫ 使发酵系统中维持很低的基质浓度； ⚫ 和连续发酵比、不需要严格的无菌条件； ⚫ 不会产生菌种老化和变异等问题。 缺点： ⚫ 存在一定的非生产时间； ⚫ 和分批发酵比，中途要流加新鲜培养基，增加了染菌的危险。 3、补料分批发酵的类型 按补料方式不同可分为： （1）连续流加 （2）不连续流加 （3）多周期流加 按补料成分的不同可分为： （1）单一组分流加 （2）多组分流加 按控制方式的不同可分为： （1）反馈控制 （2）无反馈控制
四、连续发酵 1、定义 培养基料液连续输入发酵罐，并同时放出含有产品的相同体积发酵液，使发 酵罐内料液量维持恒定，微生物在近似恒定状态（恒定的基质浓度、恒定的产物 浓度、恒定的 pH、恒定菌体浓度、恒定的比生长速率）下生长的发酵方式。2、 连续发酵的优缺点 优点： ⚫ 能维持低基质浓度； ⚫ 可以提高设备利用率和单位时间的产量； ⚫ 便于自动控制。 缺点： ⚫ 菌种发生变异的可能性较大； ⚫ 要求严格的无菌条件。 3、连续发酵的类型 （1）恒化培养 使培养基中限制性基质的浓度保持恒定 （2）恒浊培养 使培养基中菌体的浓度保持恒定 4、连续发酵的代谢曲线 X：菌体浓度；S：限制性基质浓度；t：时间 第二节 发酵工艺的控制
工艺条件控制的目的：就是要为生产菌创造一个最适的环境，使我们所需要 的代谢活动得以最充分的表达。 一、温度对发酵的影响及控制 1，影响发酵温度的因素 （1）产热因素：生物热和搅拌热。 （2）散热因素：蒸发热和辐射热。2，发酵热发酵热就是发酵过程中释放出 来的净热量。 Q 发酵=Q 生物+Q 搅拌-Q 蒸发-Q 辐射（1）生物热： 定义：生物热是生产菌在生长繁殖时产生的大量热量。培养基中碳水化合物， 脂肪，蛋白质等物质被分解为 CO2,NH3 时释放出的大量能量。 用途：合成高能化合物，供微生物生命代谢活动，热能散发。 影响生物热的因素：生物热随菌株，培养基，发酵时期的不同而不同。一般， 菌株对营养物质利用的速率越大，培养基成分越丰富，生物热也就越大。发酵旺 盛期的生物热大于其他时间的生物热。生物热的大小还与菌体的呼吸强度有对应 关系。实验发现抗生素高产量批号的生物热高于低产量批号的生物热。说明抗生 素合成时微生物的新陈代谢十分旺盛。 发酵过程中生物热的变化在四环素发酵中，还发现生物热和菌的呼吸强度的变化 有对应关系，特别是在 80 小时以前。从此实验中还可看到，当产生的生物热达 到高峰时，糖的利用速度也最大。另外也有人提出，可从菌体的耗氧率来衡量生 物热的大小。 1、抗生素相对活性为1 2、抗生素相对活性为0.5
四环素生物合成过程中系列参数的动态变化过程 1：效价；2：呼吸强度；3：生物热；4：糖浓度（2）搅拌热 定义：通风发酵都有大功率搅拌，搅拌的机械运动造成液体之间，液体与设 备之间的摩擦而产生的热 。 搅拌热的计算： Q 搅拌=3600（P/V） 式中 3600：热功当量（kJ/（kW.h）） （P/V）：通气条件下单位体积发酵液所消耗的功率（ kW/m3）（3）蒸发热 定义：通入发酵罐的空气，其温度和湿度随季节及控制条件的不同而有所变 化。空气进入发酵罐后，就和发酵液广泛接触进行热交换。同时必然会引起水分 的蒸发；蒸发所需的热量即为蒸发热。 蒸发热的计算： Q 蒸发=G（I2-I1） 式中 G：空气流量，按干重计算，kg/h I1 、 I2 ：进出发酵罐的空气的热焓量，J/kg（干空气） （4）辐射热 定义：由于发酵罐内外温度差，通过罐体向外辐射的热量。 辐射热的计算：辐射热可通过罐内外的温差求得，一般不超过发酵热的 5%。 3，发酵热的测定（1）通过测定一定时间内冷却水的流量和冷却水进出口温度， 由下式求得这段时间内的发酵热。 （2）通过罐温的自动控制，先使罐温达到恒定，再关闭自控装置测得温度 随时间上升的速率 S，按下式可求得发酵热： 4，温度对发酵的影响温度通过以下方式影响发酵过程 （1）影响各种酶的反应速率和蛋白质性质 （2）影响发酵液的物理性质 （3）影响生物合成的方向。例如，四环素发酵中金色链霉菌同时能产生金 霉素。在低于 30℃温度下，该菌种合成金霉素能力较强。当温度提高，合成四 环素的比例也提高。在温度达 35℃则只产生四环素而金霉素合成几乎停止
发酵过程中，微生物生长速率变化 dX/dt =μX-αX 式中 μ：比生长速率 α：比死亡速率 当处于生长状态时，μ>>α，α可忽略。 μ与 α与温度有关 根据 Arrenhnius 公式 μ= Ae-E/RT α= A’e-E’/RT 通常 E’大于 E，所以 α比 μ对温度变化更为敏感。 例：青霉菌生产青霉素 青霉菌生长活化能 E=34kJ/mol 青霉素合成活化能 E=112kJ/mol 青霉素合成速率对温度较敏感，温度控制相当重要。 5，最适温度的确定在发酵过程中，最适温度是一种相对概念，是指在该温 度下最适于菌的生长或发酵产物的生成。最适发酵温度与菌种，培养基成分，培 养条件和菌体生长阶段有关。 最适发酵温度的选择：在发酵的整个周期内仅选一个最适培养温度不一定 好。温度的选择要参考其它发酵条件。温度的选择还应考虑培养基成分和浓度 6，温度的控制发酵罐：夹套（10M3 以下） 盘管（蛇管） （10M3 以上） 二、pH 对发酵的影响及控制 发酵过程中培养液的 pH 值是微生物在一定环境条件下代谢活动的综合指 标，是一项重要的发酵参数。它对菌体的生长和产品的积累有很大的影响。因此， 必须掌握发酵过程中 pH 的变化规律，及时监测并加以控制，使它处于最佳的状 态。尽管多数微生物能在 3~4 个 pH 单位的 pH 范围内生长，但是在发酵工艺中， 为了达到高生长速率和最佳产物形成，必须使 pH 在很窄的范围内保持恒定。 1，pH 值对微生物的生长繁殖和产物合成的影响 pH 通过以下方式影响发酵过程： （1）pH 影响酶的活性当 pH 抑制菌体中某些酶的活性时，使菌体的新陈代 谢受阻； （2）pH 影响微生物细胞膜所带电荷的状态，从而改变细胞膜的渗透性，影 响微生物对营养物质的吸收及代谢产物的排泄，因此影响代谢的正常进行； （3）pH 影响培养基某些组分和中间代谢产物的离解，从而影响微生物对这 些物质的利用； （4）pH 不同，往往引起菌体代谢过程的不同，使代谢产物的质量和比例发 生改变。 2，发酵过程中 pH 的变化 生长阶段 生成阶段 自溶阶段 3，引起 pH 下降的因素（1）碳源过量