第三章 发酵生物化学基础 第一节 糖的微生物代谢（自学） 第二节 脂类和脂肪酸的微生物代谢（自学） 第三节 氨基酸和核酸的微生物代谢（自学） 第四节 微生物的次级代谢 从前面的章节中，我们了解了微生物从外界吸收各种营养物质，通过分解代谢和合成代 谢，产生出维持生命活动的物质和能量的初级代谢过程。此外，微生物还能进行次级代谢。 本节将概述次级代谢的概念及其类型。介绍几个有代表性的次级代谢产物的生物合成途了解 次级代谢的特点。简要介绍当前流行的有关次级代谢的生理功能的学说。 一、次级代谢的概念及类型 （一）次级代谢的概念 次级代谢的概念是 1958 年由植物学家 Rohland 首先提出来的。他把值物产生的与植物 生长发育无关的某些特有的物质称为次级代谢物质，合成和利用它们的途径即为次级代谢。 1960 年微生物学家 Bu’Lock 把这一概念引入微生物学领域。 次级代谢并没有一个十分严格的定义，它是相对于初级代谢而提出的—个概念，主要是 指次级代谢产物的合成。它具有许多特点，根据这些特点可以认为次级代谢是指：微生物在 一定的生长时期(一般是稳定生长期)，以初级代谢产物为前体，合成一些对微生物的生命活 动没有明确功能的物质的过程。这一过程的产物即为次级代谢产物。 另外，也有把初级代谢产物的非生理量的积累，看成是次级代谢产物，例如微生物发酵 产生的维生素、柠檬酸、谷氨酸等。 （二）次级代谢产物的类型 次级代谢产物种类繁多，如何区分类型尚无统一标准。有的研究者按照次级代谢产物的 产生菌不同来区分；有的根据次级代谢产物的结构或作用来区分；有的则根据次级代谢产物 合成途径来区分。现简介如下： 1，根据产物合成途径区分类型 根据产物合成途径可以分为五种类型。 （1）与糖代谢有关的类型 以糖或糖代谢产物为前体合成次级代谢产物有三种情况： （A）直接由葡萄糖合成次级代谢产物。例如，曲霉属(Aspergillus)产生的曲酸、蛤蟆菌 (Amanitamuscarina)产生的蕈毒碱，放线菌产生的链霉素以及大环内酯抗生素中的糖苷等。 曲酸 （B）由预苯酸合成芳香族次级代谢产物，例如放线菌产生的氯霉素、新霉素等。 （C）由磷酸戊糖合成的次级代谢物质较多。磷酸戊糖首先合成重要的初级代谢产物核 苷类物质，进一步合成次级代谢产物，如狭霉素、嘌呤霉素、抗溃疡间型霉素、杀稻瘟菌素 O O HO CH2OH
S 以及多氧霉素等。 （2）与脂肪酸代谢有关的类型 此类型有两种情况： （A）以脂肪酸为前体，经过几次脱氢、β-氧化之后，生成比原来脂肪酸碳数少的聚乙 炔(po1yacetylene)脂肪酸。这种次级物质多在高等植物中存在。担子菌中也能见到。 （B）次级代谢产物不经过脂肪酸，而是从丙酮酸开始生成乙酰 CoA，再在羧化酶催化 下生成丙二酰 CoA。在初级代谢中由此进一步合成脂肪酸，而在次级代谢中所生成的丙二 酰 CoA 等链中的羰基不被还原，而生成聚酮 (po1yketide) 或 β —多酮次甲基链 (β-polyketomethylene)。由此进一步生成不同的次级代谢产物。例如四环素抗生素类。红霉 素内酯是由聚丙酸型聚酮生成，即在丙酸上加上一个经脱羧的甲基丙二酸的 C3 单位，最后 由七酮形成内酯环，再与红霉糖、脱氧氨基已糖，以糖苷的形式结合而成为红霉素。 （3）与萜烯和甾体化合物有关的类型 与萜烯和甾体化合物有关的次级代谢产物，主要是由霉菌产生的，例如烟曲霉素(三个 异戊烯单位聚合而成)、赤霉素(四个异戊烯单位聚合而成)、梭链孢酸(由六个异戊烯单位聚 合而成)及由八个异戊二烯单位聚合成的 β-胡萝卜素等
（4）与 TCA 环有关的类型 与 TCA 环相连的次级代谢产物也可以分为两类： 一类是从 TCA 环得到的中间产物进一步合成次级产物，例如由 a—酮戊二酸还原生成 戊烯酸，由乌头酸脱羧生成衣康酸。 另一类是由乙酸得到的有机酸与 TCA 环上的中间产物缩合生成次级产物，例如，脂肪酸 α- 亚甲基与草酰乙酸或 α—酮戊二酸羧基或羰基缩合。担子菌产生的松蕈(三)酸(α-十六烷基柠 檬酸)就是由十八烷酸(C17H33·COOH)的 α-亚甲基与草酰乙酸的羰基缩合而成。 （5）与氨基酸代谢有关的类型 与氨基酸代谢有关的次级代谢，可以分为三类： （A）由一个氨基酸形成的次级代谢产物，如放线菌产生的环丝氨酸、氮丝氨酸；担子 菌由色氨酸合成口磨氨酸、鹅膏 氨酸、二甲基-4-羟色胺磷酸以及靛蓝等。 （B）由二个氨基酸形成的曲霉酸、支霉粘毒(gliotoxin)。是由二个氨基酸先以肽键结合
闭环生成二酮吡嗪(diketopiperazine)进一步形成的。半胱氨酸和缬氨酸以另外的缩合方式形 成 6—氨基青霉素烷酸。 （C）由三个以上氨基酸缩合而成的次级产物，氨基酸之间多以肽键结合成直链状，例 如镰刀菌(Fusarium)产生的恩镰孢菌素(enniatine)。放线菌产生的很多次生物质属于此类型。 例如短杆菌 A、放线菌素、短杆菌酪素、多粘菌素、杆菌肽及紫霉素等。此外，还有二个以 上氨基酸经过复杂的缩分后形成含氮芳香环如麦角生物碱。 2，根据产物的作用区分类型 根据次级代谢产物的作用可以分为抗生素、激素、生物碱、毒素及维生素等类型。 抗生素：这是微生物所产生的，具有特异抗菌作用的一类次级产物。日前发现的抗生素 已有 2500~3000 种，青霉素、链霉素、四环素类、红霉素、新生霉素、新霉素、多粘霉素、 利福平、放线菌素(更生霉素)、博莱霉家(争光霉素)等几十种抗生素已进行工业生产。 激素：微生物产生的一些可以刺激动、植物生长或性器官发育的一类次级物质。例如赤 霉菌(Gibberella fujikuroi)产生的赤霉素。 生物碱：大部分生物碱是由植物产生的。麦角菌(Claviceps purpurea)可以产生麦角生物 碱。 毒素：大部分细菌产生的毒素是蛋白质类的物质。如破伤风梭菌(Clostridium tetani)产生 的破伤风毒素， 白喉杆菌(Corynebacterium diphtheriae) 产生的 白喉毒素， 肉毒梭菌 (Cl．botulinum)产生的肉毒素及苏云金杆菌(Bacillus thuringiensis)产生的伴胞晶体等。放线 菌，真菌也产生毒素。例如黄曲霉(Aspergillus flavus)产生的黄曲霉毒素。担子菌产生的各种 蘑菇毒素等。 色素：不少微生物在代谢过程中产生各种有色的产物。例如由粘质赛氏杆菌(Serratia marcescens)产生灵菌红素，在细胞内积累，使菌落呈红色。有的微生物将产生的色素分泌到 细胞外，使培养基呈现颜色。 维生素；作为次生物质，是指在特定条件下，微生物产生的远远超过自身需要量的那些 维生素，例如丙酸细菌(Propionibacterium sp．)产生维生素 B12，分枝杆菌(Mycobacterium) 产生吡哆素和烟酰胺，假单胞菌产生生物素，以及霉菌产生的核黄素和 β-胡萝卜素等
二、次级代谢产物的生物合成 次级代谢产物的合成过程可以概括为如下模式： 次级代谢产物的合成是以初级代谢产物为前体，进入次级代谢产物合成途径后，大约经 过三个步骤，合成次级代谢产物。 第一步，前体聚合。前体单元在合成酶催化下进行聚合。例如四环素合成中，在多酮链 合成酶催化下，由丙二酰 CoA 等形成多酮链，进而合成四环素及大环内酯类抗生素。多肽 类抗生素由合成酶催化，由氨基酸生成多肽链。 第二步，结构修饰。聚合后的产物再经过修饰反应如环化、氧化、甲基化、氯化等。 氧化作用是在加氧酶催化下进行的。次级代谢中的加氧酶多是单加氧酶，它把氧分子中 的一个氧原子添加到底物上，另一个氧原子还原成水，并常伴有 NADPH 的氧化。 RH+O2+NADPH2→ROH+H2O 十 NADP 次级代谢中的氯化反应，可以看作是特征性的反应，在氯过氧化物酶催化下进行。此酶 是糖蛋白，含有高铁原卟啉。在金霉索，氯霉素合成中都有此反应，简示如下： RH+H2O2+Cl-+H+→RCl+2H2O 第三步，是不同组分的装配。如新生霉素的几个组分，4-甲氧基-5’，5’-二甲基-L-来 苏糖(noviose)、香豆素和对经基苯甲酸等形成后，再经装配成新生霉素，图示如下。 诺卡霉素 A(nocardicinA)分子装配如下图所示
三、次级代谢的特点 1，次级代谢以初级代谢产物为前体，并受初级代谢的调节 次级代谢与初级代谢关系密切。初级代谢的关键性中间产物，多半是次级代谢的前体。 例如糖降解产生的乙酰 CoA 是合成四环素、红霉案及 β-胡萝卜素的前体。缬氨酸、半胱氨 酸是合成青霉素，头孢霉素的前体。色氨酸是合成麦角碱的前体等。 出于初级代谢为次级代谢提供前体，所以产生前体物质的初级代谢过程受到控制时，也 必然影响次级代谢的进行，因此，初级代谢还具有调节次级代谢的作用。例如三羧酸循环可 以调节四环素的合成。赖氨酸的反馈调节控制着青霉素的合成。色氨酸调节麦角碱的合成等， 具体调节过程见代谢调节一章有关部分。 2，次级代谢产物一般在菌体生长后期合成 初级代谢贯穿于生命活动始终，与菌体生长平行进行。而次级代谢一般只是在菌体对数 生长后期或稳定生长期进行。因此，此类微生物的生长和次级代谢过程可以区分为两个阶段， 即菌体生长阶段和代谢产物合成阶段。例如，链霉素、青霉素、金霉素、红霉素、杆菌肽等， 都是在合成阶段形成。但是，次级代谢产物的合成时期，可以因培养条件的改变而改变。例 如氯霉素在天然培养基中是菌体繁殖期合成，而在合成培养基中，它的合成与生长平行。又 如麦角菌(C．purpurea)的营养缺陷型菌株，在含葡萄糖及酵母膏的天然培养基中，先长菌体， 繁殖期合成生物碱，而在合成培养基中，菌体生长缓慢，同时合成生物碱。 在生长阶段菌体生长迅速，中间产物很少积累，当容易利用的糖、氮、磷消耗到一定 量之后，菌体生长速度减慢，菌体内某些中间产物积累，原有酶活力下降或消失，导致生理 阶段的转变，即由菌体生长阶段转为次级代谢物质合成阶段。此时原来被阻遏的次级代谢的 酶，被激话或开始合成。例如，青霉素合成中的酰基转移酶、链霉素合成中的脒基转移酶等 次级代谢中的关键酶都在合成阶段被合成。若在菌体生长阶段接近终了或终了后立即加入蛋 白质、核酸抑制剂，这些酶便不能合成，次级代谢过程将不能进行。 次级代谢中存在两个生理阶段，一般认为是由于碳分解产物产生阻遏作用的结果，阻遏 解除后，合成阶段才能开始。 第五节 芳香族化合物的微生物代谢 一、芳香烃的分解 微生物对芳香烃的分解是在有氧条件下进行的，首先以形成二元酚如邻苯二酚、原儿茶 酸等作为环裂解底物，再进一步氧化分解
苯转化成邻苯二酚：苯的氧化首先是生成二羟基已二烯，再转化为邻苯二酚，其过程见 下图。 苯的微生物氧化 苯转化成邻苯二酚的酶系是由三个组分构成的：①分子量为 60000 含有 FAD 的蛋白质； ②分子量为 21000 含有非血红素铁的蛋白质，②分子量为 186000 含有非血红素铁的红色蛋 白质，这些组分的功能如下图所示。 微生物氧化苯的双氧酶的功能 甲苯转化成环裂解底物：甲苯氧化成邻苯二酚有两条途径 （1）Kitagawa 用(P．aeruiginosa)试验指出该菌分解甲苯是将甲基氧化成羧基，再将苯 甲酸转化为邻苯二酚，甲苯与苯甲酸之间的中间产物是苯甲醇和苯甲醛，见下图。 甲苯的氧化途径 （2）Walker 用 Pseudomonas 菌试验证明甲苯分解存在另一条途径，即二羟化反应将甲 苯转化成 3-甲基邻苯二酚作为裂解底物。从下图可见，苯甲酸是如何转化成邻苯二酚的。 这是 1971 年 Reiner 等才弄清其确切的反应顺序
苯甲酸氧化成邻苯二酚的途径 邻苯二酚环裂解及其降解：邻苯二酚通过两种途径之一进行降解，这取决于环是在两个 羟基之间裂解(邻位裂解)，还是在羟基旁裂解( 间位裂解) 。两种反应都是由双氧酶 (dioxygnases)催化，前一种由邻苯二酚酶(邻苯二酚-1，2-双氧酶)催化，后一种由变邻苯二酚 酶(邻苯二酚-2，3-双氧酶)催化，其产物分别是顺、顺一粘康酸半醛，再进一步降解为正常 的中间代谢物，分别生成 β-酮己二酸和 4-羟-2-酮戊酸。进一步分解则得琥珀酸、乙酰辅酶 A 和丙酮酸、乙醛，再由 TCA 环完全氧化或进入其他生物合成途径。如下图所示。 邻苯二酚的裂解途径 原儿茶酸与邻苯二酚的降解方式相类似，也能以间位或邻位裂解途径降解。邻位裂解的 终产物是琥珀酸，间位裂解的终产物是两分子丙酮酸。 脂环烃的分解：在全部烃类中，脂环烃对微生物作用的抗性最强。目前已知一种微生物
能以环己烷作为唯一的碳源和能源而生长。环己烷可被两种假单胞菌属细菌的混合培养物经 过共代谢而缓慢地降解。这些微生物中的第一种能利用正烷烃，它可利用庚烷迅速生长。如 果有环已烷同时存在，则环己烷披共氧化为环已醇，然后环已醉被混合培养物中的另一种微 生物所降解。实际上，有几种微生物可以利用环己醇生长．如小球诺卡氏菌(Nocardia globerula)对环己醇的降解过程如下图所示。 小球诺卡氏菌对环己醇的降解 嗜石油诺卡氏菌(Nocardia petroleophila)可利用甲基环己烷生长，其最初降解步骤如下图 所示。 嗜石油诺卡氏菌对甲基环己烷降解 第六节 H2 和 CO2 的微生物代谢 一、H2 的微生物代谢 1，分解代谢 氢细菌都是一些呈革兰氏阴性的兼性化能自养菌。它们能利用分子氢，氧化产生的能量 同化 CO2，也能利用其它有机物进行生长。 在有分子氢和氧的条件下，氢细菌在生长过程中实际上包括两个过程：①分子氢氧化 成水，放出能量；②分子氢还原 CO2 成为细胞物质，总的结果是以 6：2：l 的比例消耗 H2， O2 和 CO2，其反应如下： 四分子氢氧化成水所放出的能量可产生一分子 ATP，用于还原 CO2 构成细胞物质和维
持细菌的生长。 氢细菌的细胞膜上有泛醌、维生素 K2 及细胞色素等呼吸链成分，但与其它的好氧微生 物不同，在氢细菌里，电子直接从氢转移到呼吸链，电子再经呼吸链传递产生 ATP，一种不 透明的诺卡氏菌(Nocardia opaca)只含有一种可溶性氢化酶，它可使氢还原 NAD+产生 NADH，然后，NADH 再作呼吸链的供氨体，产生 ATP。 在多数氢细菌中，有两种氢化酶，其结构和功能各不相同。 （1）颗粒状氢化酶(particulate hydrogenase) 如真养产碱菌(A．eutrophus)的颗粒状氢化酶是由两个亚基组成的，一个亚基分子量为 37000，另一个亚基分子量为 37000，二者之比为 1：1。颗粒状氢化酶结合在细胞质膜上， 它直接与呼吸链偶联，不经过依赖于 NAD+的脱氢酶作中间体，催化氢的氧化，并把电子直 接传给呼吸链产生ATP。电子在呼吸链上传递可能有两条途径：一条是依赖于维生素K2(VK2) 的途径；另—条是与维生素 K2 无关的途径。两条途径中都有细胞色素存在，在许多氢细菌 中还发现有 CoQ，一般认为 ATP 产生是电子从氢传到细胞色素 b 的部位，颗粒状氢化酶不 受过量 ATP 的抑制，但可被 NADH、CN 利 CO 所抑制。 （2）可溶性氢化酶(so1uble hydrogenase) 真养产碱菌(A．eutrophus)的可溶性氢化酶存在于细胞质中，由四聚体复合组成，其中 三个亚基(分子量分别为 63000、60000、29000，摩尔比例为 1：1：2，还含有黄素单核苷酸 和 FeS 中心(FMN：Fe：S 摩尔比为 2：12：12)。 可溶性氢化酶催化氢的氧化，能直接还原 NAD+，还能还原 Cytb、Cytc 等，它不与氧、 NAD+和甲烯蓝起反应，它受 ADP 相 ATP 相对浓度的控制，当 ADP 缺少，ATP 过量时，酶 的活性受抑制。反应产物 NADP 对酶也有抑制作用。可溶性氢化酶不受 CN-、CO 的抑制。 它的主要功能是为菌体生长提供固定 CO2 的还原力。另外，它可直接运送电子进入呼吸链， 两种氢化酶的作用及电子传送途径见下图。 真养产碱菌中两种氢化酶的功能。 偶联部位以阿拉伯数字标明。Phase（颗粒状氢化酶）、Shase（可溶性氢化酶） 在真养产碱菌中，同时含有 CoQ 和 VK2，因培养条件不同，这两种物质的相对浓度则 不同。在氧限量时，CoQ 明显减少，当氧过量时，VK2 含量极微。 必须指出，氢细菌是—类兼性化能自养菌，在有 O2 无 H2 时，可利用糖或有机酸或氨基 酸而生长。有的还可利用嘌呤和嘧啶进行生长。 当氢细菌以无机化能营养方式生长时，H2 的存在能阻抑菌体对有机物(如对果糖)的利 用，这种现象称为氢效应。共原因有两方面： (1)果糖的利用是通过 ED 途径进行的。当有氧存在时，分子氢使 ED 途径中酶合成的诱 导受到抑制，因而不能利用 ED 途径分解有机物，包括果糖。 (2)果糖经 ED 途径分解的关键是进行脱氢氧化。在氢细菌体内 NAD(P)+是有限的，当