第一部分 啤酒工艺综合实验 实验一 还原糖的测定 3 实验二 α-氨基氮的测定（茚三酮法） 4 实验三 双乙酰（紫外分光光度法） 5 实验四 总酸（电位滴定法） 6 实验五 酒精度 7 实验六 原麦汁浓度（蒸馏——密度法） 9 实验七 真正发酵度(实际发酵度) 10 实验八 协定法糖化和外加酶糖化法 11 第二部分 通风发酵综合实验 实验一 淀粉质原料的水分测定 12 实验二 原料中粗淀粉的测定 13 实验三 还原糖的测定 17 实验四 蛋白酶活力的测定方法 19 实验五 糖化酶的测定方法 22 实验六 玉米淀粉液化及糖化 24 实验七 面包酵母流加培养与分批培养试验 27 实验八 糖化酶的发酵和提取实验 31 实验九 酸性蛋白酶固态发酵实验 34 实验 目 录 讲义
1 第一部分 啤酒工艺综合实验 实验一 还原糖的测定 1 原理 本法是利用含有自由醛基的还原糖，在碱性溶液中，能将二价铜还原成氧化亚铜 的性质进行测定。 2 仪器 下端弯曲与管身成直角的滴定管。 3 试剂 （1） 0.1N 硫代硫酸钠标准溶液 配制：溶 26 克硫代硫酸钠及 0.2 克无水碳酸钠于 1000ml 水中。缓和煮沸 10min，冷却。将溶液保存于棕色具塞瓶中，放置一周后过滤备用。 标定： 称取于 120℃烘至恒重的重铬酸钾 0.2 克，称准至 0.0002 克，置于 500ml 具塞锥形瓶中，溶于 25ml 煮沸并冷却的水中，加 2 克碘化钾及 20ml 4N 的硫酸。待 碘化钾溶解后，于暗处放置 10min，加 250ml 水，用 0.1 N 硫代硫酸钠溶液滴定，近 终点时加 3ml 0.5%淀粉指示剂，继续滴定至溶液由蓝色转变成亮蓝绿色。同时作空 白试验校正结果。硫代硫酸钠标准溶液当量浓度 N 按下式计算： N= G/0.04903V 式中： G—— 重铬酸钾的重量（克） V—— 硫代硫酸钠溶液的用量（ml） 0.04903—— 每毫克当量重铬酸钾的克数 （2） 4N 的硫酸溶液 边搅拌边将 56ml的浓硫酸小心地加入到约 350ml蒸馏水中，并定容至 500ml。 （3） 0.5%淀粉溶液 1.25g 可溶性淀粉，加少量水调成糊状，在不断搅拌下注入 200ml 沸水中，微沸 2min，冷却，加水稀释成 250ml。 （4）30%醋酸溶液 取 29.8ml无水乙酸，用水定容至 100ml. （5） 斐林溶液 A. 硫酸铜溶液 溶 34.639 克硫酸铜于水中，稀释至 500.0ml。 B. 碱性酒石酸盐溶液 溶 173 克酒石酸钾钠，50 克氢氧化钠溶于水中，稀释至 500.0ml。 4 标定： 取 10.00ml 斐林溶液的 A 液，加 4ml30%醋酸溶液和 3g 碘化钾，加 25ml 煮沸后 冷却的水，使碘化钾溶解，以 0.1N 硫代硫酸钠标准溶液滴定溶液呈微黄色，加硫氰
2 酸铵 2g，0.5%淀粉溶液 3ml，搅拌后，继续滴定至蓝色消失。斐林溶液的校正系数 f 计算如下： 式中： V——0.1N 硫代硫酸钠标准溶液的用量（ml） 0.006355—— 每毫升 0.1N 硫代硫酸钠溶液相当的铜的克数 0.01748—— 每毫升斐林溶液的 A 液中含有的铜的克数 （6）次甲基蓝指示液，1% 1g 次甲基蓝溶于 100ml水中。 5 操作步骤 （1）取糖化试验的麦芽汁，稀释至 20 倍或更合适的倍数，使其滴定量在 15～ 50ml之间。 （2） 预备实验 取斐林溶液 A、B 各 5.0ml，置锥形瓶中，加 10ml 水稀释，加 热使其于 5min 内沸腾，在沸腾状态下用滴定管滴入稀释麦芽汁至蓝色即将消失时， 加 1～2 滴次甲基蓝指示液，继续滴定至蓝色消失，记录所用稀释麦芽汁的数量。 （3） 正式测定 在 200ml锥形瓶中加入斐林溶液 A、B 各 5.0ml，再加少于预备 实验所用 1ml 的麦芽汁，加热至沸后，加 1～2 滴次甲基蓝指示液，用稀释麦芽汁滴 至终点，记录用去稀释麦芽汁的总量。 6 计算 根据稀释麦芽汁在正式测定中的用量，查表得相应麦芽糖量，再用下式计算： 总还原糖（麦芽糖，g/ml麦汁）＝f×n 或 总还原糖（麦芽糖，g/100g 浸出物）＝ 式中： f——斐林溶液系数 n—— 稀释倍数 G—— 麦芽汁中浸出物含量（%） D——麦芽汁 20℃比重 注意事项： （1） 本测定的操作条件必须严格控制，加热时间、滴定速度每次测定都必须一 致，由沸腾至滴定完毕必须在 3min 内结束，否则应重做。 （2） 用硫代硫酸钠标准溶液标定斐林溶液，标准溶液的浓度应正好 0.1000N， 否则计算时应把用量换算成相当于 0.1000N 的用量。 查表得 100ml麦芽汁中麦芽糖毫克 数 1000 f×查表得 100ml麦芽汁中麦芽糖毫克 数×n 1000×G×D
3 实验二 α-氨基氮的测定（茚三酮法） 1、实验试剂 a 显色剂 100 克磷酸氢二钠（Na2HPO4.12H2O） 60 克磷酸二氢钾（KH2PO4） 5.00 克水合茚三酮 3.00 克果糖 用水溶液溶解后稀释至 1 升（此溶液在低温下用棕色瓶可保存 2 周，pH 应为 6.6-6.8。操作时可以按比例配成 100ml）。 b 稀释溶液：2 克碘酸钾溶于 600ml水中，再加入 96%乙醇 400ml. c 标准溶液：溶 107.2mg 甘氨酸于 100ml 水中，0℃贮藏。用时按要求稀释。 该溶液含有 200mgα-氨基氮/升。 2、实验操作 取糖化的麦芽汁 1.00ml（或者是其他的合适量，使稀释后的浓度为 1-3mgα-氨 基氮/升），放入 100ml的容量瓶中，稀释到刻度，摇匀。 标准甘氨酸溶液稀释液：取 1.00ml 标准溶液，在 100ml 的容量瓶中稀释到刻 度。 取麦芽汁稀释溶液、水、标准的甘氨酸溶液（三个）稀释液各 2.00ml，放入比 色管中，（水用于空白对照），各比色管中分别加入 1.00ml 的显色剂，摇匀，在沸 水中加热 16min。（此时应该准备 20℃的水浴） 20℃水浴中冷却 20min。 加入 5.00ml的碘酸钾稀释溶液，摇匀，在 30min 内于 570nm处测定吸光度值。 3、计算 游离的α-氨基氮（毫克/升麦芽汁）=2×100×样品溶液吸光度值 / 标准溶液平均 吸光度
4 实验三 双乙酰（紫外分光光度法） 1 原理 双乙酰作为挥发性组份从啤酒样中蒸发出来，与邻苯二胺反应，生成 2，3－二 甲喹喔啉，在 335nm波长下进行测定。由于其他联二酮类都具有相同的反应特性， 再加上蒸馏过程中部分前驱体要转化成联二酮，因此上述测定结果为总联二酮含量 (以双乙酰表示)。 2 仪器 a) 带有加热套管的双乙酰蒸馏器 ； b) 具有锥形瓶(或平底蒸馏烧瓶)的蒸汽发生瓶：2000mL(或 3000mL) ； c) 容量瓶：25 mL ； d) 紫外分光光度计：备有 10mm石英比色皿或 20mm玻璃比色皿。 3 试剂和溶液 a) 4mol/L 盐酸溶液：按 GB/T 601 配制； b) l0g/L 邻苯二胺溶液：称取邻苯二胺 0.100g，溶于 4mol/L 盐酸溶液中，并定容 至 10mL，摇匀，放于暗处。此溶液须当天配制与使用；若配制出来的溶液呈红色， 应重新更换新试剂； c) 有机硅消泡剂(或甘油聚醚) 。 4 分析步骤 4.1 蒸馏 将双乙酰蒸馏器安装好，加热蒸汽发生瓶，使水至沸。通汽预热后，置 25mL 容量瓶于冷凝器出口接受馏出液，外加冰浴冷却，加 2～4 滴消泡剂于 100mL 量筒 中，再注入未经除气的预先冷至 5℃左右的酒样 100mL，迅速移入已预热的蒸馏器 内，并用少量水冲洗带塞漏斗，盖塞。然后用水封口，进行蒸馏，直至馏出液接近 25mL(蒸馏需在 3～5min 内完成)时取下容量瓶，达到室温用水定容，摇匀。 4.2 显色与测量： 分别吸取馏出液 10.0mL 于两支干燥的比色管中，并于第一支管中加入邻苯二胺 溶液 0.50mL，第二支管中不加(做空白)，充分摇匀后，同时置于暗处放置 20～ 30min，然后于第一支管中加 4mol/L 盐酸溶液 2mL，于第二支管中加入 4mol/L 盐酸 溶液 2.5mL，混匀后，于 335nm波长下，用 20mm玻璃比色皿，以空白调仪器零 点，测定其吸光度。比色测定操作须在 20min 内完成。 5 分析结果的表述 试样中双乙酰含量按式(2)计算： X = A335 1.2 .(2) 式中： X —— 试样中双乙酰的含量，mg/L ； A335 —— 试样在 335nm波长下，用 20mm比色皿测得的吸光度； 1.2—— 吸光度与双乙酰含量的换算系数
5 实验四 总酸（电位滴定法） 1 原理 酸碱中和原理。用氢氧化钠标准溶液直接滴定啤酒试样中的总酸，以 pH=8.2 为 电位滴定的指示终点，根据消耗氢氧化钠标准溶液的体积计算出啤酒试样中总酸的含 量。 2 仪器 自动电位滴定仪：精度±0.02pH，附电磁搅拌器 ； 恒温水浴：精度±0.5℃，带振荡装置。 3 试剂和溶液 a) 0.1mol/L 氢氧化钠溶液：按 GB/T 601 配制与标定。 b) 标准缓冲溶液：现用现配。 4 分析步骤 4.1 试样的处理：取试样（5.1）约 60mL 于 100mL 烧杯中，置于(40±0.5)℃振荡 水浴中恒温 30min，取出，冷却至室温。 4.2 测定： a) 按使用说明书安装与调试仪器。 b) 用标准缓冲溶液校正自动电位滴定仪。用水清洗电极，并用滤纸吸干附着电极 的液珠。 c) 吸取处理好的试样 50.0mL 于烧杯中，放入校正好的电极，开启电磁搅拌器， 用氢氧化钠标准溶液滴定，开始每次约加 1.0mL 直至 pH=7.6，然后每次滴加 0.10mL 直至 pH=8.2 为其终点 ，记录消耗氢氧化钠标准溶液的体积。 5 结果 试样的总酸按式(3)计算： X = 2c V .(3) 式中： X —— 试样的总酸，即 100mL 试样消耗氢氧化钠标准溶液 [c(NaOH)=0.1mo1/L] 毫升数，mL/100mL： c —— 氢氧化钠标准溶液的浓度，mo1／L V —— 消耗氢氧化钠标准溶液的体积，mL； 2 —— 换算成 100mL 试样的系数。 所得结果应表示至一位小数。 6 允许差 同一试样两次测定值之差，不得超过平均值的 4％
6 实验五 酒精度 1 原理 利用在 20℃时酒精水溶液与同体积纯水质量之比，求得相对密度(以 d 2020表示)。 然后，查表得出试样中酒精含量的百分比，即酒精度，以%(V/V）或％(m/m)表示。 2 仪器 a) 全玻璃蒸馏器：500mL； b) 恒温水浴：精度±0.1℃； c) 容量瓶：100mL ； d) 移液管：100 mL ； e) 分析天平，感量 0.1mg ； f) 天平：感量 0.1g ； g) 附温度计密度瓶：25mL 或 50mL； h) 数字密度计和注射器。 3 分析步骤 3.1 容量法 3.1.1 蒸馏 用 100mL 容量瓶准确量取试样（5.1）100mL，置于蒸馏瓶中，用 50mL 水分三 次冲洗容量瓶洗液并入蒸馏瓶中，加玻璃珠数粒，装上蛇型冷凝管，用原 100mL 容 量瓶接收馏出液(外加冰浴)，缓缓加热蒸馏(冷凝管出口水温不得超过 20℃)，收集约 96mL 馏出液(蒸馏应在 30～60min 内完成)，取下容量瓶，调节液温至 20℃，补加水 定容，混匀，备用。 a)测量 A 将密度瓶洗净、干燥、称量，反复操作，直至恒重。 将煮沸冷却至 15℃的水注满恒重的密度瓶，插上带温度计的瓶塞(瓶中应无气 泡)，立即浸于(20±0.1)℃的恒温水浴中，待内容物温度达 20℃，并保持 5min 不变后 取出。用滤纸吸去溢出支管的水，立即盖好小帽，擦干后，称量。 b)测量 B 将水倒去，用馏出液 a)反复冲洗密度瓶三次，然后装满，按 b)同样操作。 试样馏出液(20℃)的相对密度按式(4)计算： m m m m d − − = 1 20 2 20 .(4) 式中： d 2020 —— 试样馏出液(20℃)的相对密度(比重)； m2 —— 密度瓶和馏出液的质量，g ； m —— 密度瓶的质量，g ； m1 —— 密度瓶和水的质量，g
7 根据相对密度 20 20 d 查附录 A，得到馏出液的酒精度，%(V/V)或 g/100mL。 即为啤 酒试样的酒精度，%(V/V) 或 g/100mL。所得结果应表示至两位小数。 3.2 重量法 a) 蒸馏 称取制备好的试样(5.1) 100g，精确至 0.1g，全部移入 500mL 已知质量的蒸馏瓶 中，加水 50mL 和数粒玻璃珠，装上蛇型冷凝器(或冷却部分的长度不短于 400mm的直型冷凝器)，开启冷却水，用已知质量的 100mL 容量瓶接收馏出液 (外加冰浴)，缓缓加热蒸馏(冷凝管出口水温不得超过 20℃)，收集约 96mL 馏出 液(蒸馏应在 30～60min 内完成)，取下容量瓶，调液温至 20℃，然后补加水，使 馏出液质量为 100 .0g(此时总质量为 100.0g 十容量瓶质量)，混匀。(注意保存蒸 馏后的残液，供做真正浓度用)。 b) 测量 A 和 测量 B c) 计算试样馏出液(20℃)相对密度。根据相对密度 20 20 d 查附录 A，得到馏出液的 酒精度，%(m/m)。即为啤酒试样的酒精度，%(m/m) 。所得结果应表示至两 位小数。 4 允许差 同一试样两次测定值之差不得超过平均值的 1％
8 实验六 原麦汁浓度（蒸馏——密度法） 1 原理 以蒸馏——密度法测出啤酒试样中的真正浓度和酒精度。按经验公式计算出啤酒 试样的原麦汁浓度。或用仪器法直接自动测定、计算、打印出样品的真正浓度及原麦 汁浓度。 2 仪器 同实验。 3 分析步骤 3.1 真正浓度的测定。 a) 试样的制备：将重量法(在已知重量的蒸馏烧瓶中)蒸馏除去酒精后的残液，冷却 至 20℃，准确补加水使残液至 100.0g，混匀。 或用已知质量的蒸发皿称取试样 100.0g，精确至 0.1g，于沸水浴上蒸发， 直至原体积的 1/3，取下冷却，加水恢复至原质量，混匀。 b) 试样的测定：用密度瓶或密度计测定出残液的相对密度。查附录 B 中的表 B1， 求得 100g 啤酒试样中浸出物的克数(g/100g)。即为啤酒的真正浓度，以 plato 度(°P) 或 %(m/m)表示。 3.2 酒精度同 9.1.4 。 4 结果 根据测得的酒精度和真正浓度，按式(5)计算出原麦汁浓度： 100 1.0665 ( 2.0665 100 + + = A A E X ） .(5) 式中：X —— 原麦汁浓度，°P [％(m/m)]； A —— 酒精度，％(m/m)； E —— 真正浓度，°P [％(m/m)] 。 或查附录 B 中的表 B2，原麦汁浓度按式(6)计算： X = 2 A+ E − b .(6) 式中：X —— 原麦汁浓度，°P [％(m/m)]； A —— 酒精度，％(m/m)； E —— 真正浓度，°P [％(m/m)]； b —— 校正系数。 所得结果表示至一位小数
9 实验七 真正发酵度(实际发酵度) 啤酒的真正发酵度(RDF)按式(7)或(8)计算： A ER A RDF + = 2.0665 2.0665 100 .(7) 式中： RDF —— 啤酒的真正发酵度，% ； A —— 啤酒的酒精度，%（m/m）； ER —— 啤酒的真正浓度，°P [ %(m/m)] 。 Z Y Y Z RDF − − = 1 0.005161 100 ( ) 1 .(8) 式中： RDF —— 啤酒的真正发酵度，% ； Y —— 啤酒的原麦汁浓度，°P [ %(m/m)] ； Z—— 啤酒的真正浓度，°P [ %(m/m)] ； 0.005161——换算系数