动物微生物实验实训指导书 一、实验实训指导说明： 1、性质与作用：动物微生物是高等农业职业院校畜牧兽医专业的一门岗位素质课 程。对应岗位是：动物疫病诊断、检疫、检测技术等实训室技术岗位。作用是：研究微 生物与畜禽的关系，并利用微生物学与免疫学的知识和技能来诊断、防治畜禽的疾病与 人畜共患疾病，让学生具备畜牧兽医行业高等技术应用型专门人才所必须的畜禽疾病诊 断、检测、预防等专业知识和熟练的职业专门技术能力，培养学生具备相应职业关键技 术能力和职业道德。在教学过程中，使学生要掌握动物微生物与免疫所必须的专项实践 技能和综合职业能力，基本掌握细菌类疾病、病毒类疾病、其他微生物实训室检验技术 等。同时，在教学中对学生职业道德进行影响，注意敬业精神、吃苦耐劳、尽心钻研等 方面的教育影响，并形成良好职业道德和敬业精神。 2、课程内涵：本课程的内涵是通过过程性的训练及考核，通过形成性联系及渐进 式教学，使学生不但掌握专业知识而且能够有效把握技能的知识背景及相应的产业历 史，为学生在系统掌握本课程专业技能操作的同时，初步具有应对复杂问题及进行有效 迁移以及创造的能力。使学生掌握动物微生物课程所必须的专业理论知识，专业实践能 力和综合职业能力，掌握主要动物的疾病实训室诊断技术，可以独立的开展动物疫病的 实训室检验，具有较强的工作岗位适应能力、分析和解决实际问题的能力以及创新意识 和职业道德意识。经过本课程的学习及培养后学生应具有认真负责、踏实肯干，严谨求 实的工作态度及独立思考、自主创业的精神。 二、实验实训目录： 实验实训一 显微镜油镜的使用及细菌形态观察方法 实验实训二 动物微生物检验中常用玻璃器皿的准备 实验实训三 细菌标本片的制备及染色方法 实验实训四 常用培养基的制备 实验实训五 细菌的分离培养及培养性状的观察技术 实验实训六 细菌的药物敏感试验（纸片法）技术 实验实训七 外界环境微生物测定技术 实验实训八 实验动物接种技术 实验实训九 病毒鸡胚接种技术 实验实训十 鸡新城疫病毒的红细胞（血）凝集与凝集抑制试验（微量法）操作技 术 实验实训十一 真菌的检验技术 实验实训十二 凝集试验 实验实训十三 琼脂扩散试验技术
动物微生物实验实训指导书 一、实验实训指导说明： 1、性质与作用：动物微生物是高等农业职业院校畜牧兽医专业的一门岗位素质课 程。对应岗位是：动物疫病诊断、检疫、检测技术等实训室技术岗位。作用是：研究微 生物与畜禽的关系，并利用微生物学与免疫学的知识和技能来诊断、防治畜禽的疾病与 人畜共患疾病，让学生具备畜牧兽医行业高等技术应用型专门人才所必须的畜禽疾病诊 断、检测、预防等专业知识和熟练的职业专门技术能力，培养学生具备相应职业关键技 术能力和职业道德。在教学过程中，使学生要掌握动物微生物与免疫所必须的专项实践 技能和综合职业能力，基本掌握细菌类疾病、病毒类疾病、其他微生物实训室检验技术 等。同时，在教学中对学生职业道德进行影响，注意敬业精神、吃苦耐劳、尽心钻研等 方面的教育影响，并形成良好职业道德和敬业精神。 2、课程内涵：本课程的内涵是通过过程性的训练及考核，通过形成性联系及渐进 式教学，使学生不但掌握专业知识而且能够有效把握技能的知识背景及相应的产业历 史，为学生在系统掌握本课程专业技能操作的同时，初步具有应对复杂问题及进行有效 迁移以及创造的能力。使学生掌握动物微生物课程所必须的专业理论知识，专业实践能 力和综合职业能力，掌握主要动物的疾病实训室诊断技术，可以独立的开展动物疫病的 实训室检验，具有较强的工作岗位适应能力、分析和解决实际问题的能力以及创新意识 和职业道德意识。经过本课程的学习及培养后学生应具有认真负责、踏实肯干，严谨求 实的工作态度及独立思考、自主创业的精神。 二、实验实训目录： 实验实训一 显微镜油镜的使用及细菌形态观察方法 实验实训二 动物微生物检验中常用玻璃器皿的准备 实验实训三 细菌标本片的制备及染色方法 实验实训四 常用培养基的制备 实验实训五 细菌的分离培养及培养性状的观察技术 实验实训六 细菌的药物敏感试验（纸片法）技术 实验实训七 外界环境微生物测定技术 实验实训八 实验动物接种技术 实验实训九 病毒鸡胚接种技术 实验实训十 鸡新城疫病毒的红细胞（血）凝集与凝集抑制试验（微量法）操作技 术 实验实训十一 真菌的检验技术 实验实训十二 凝集试验 实验实训十三 琼脂扩散试验技术
三、实践教学内容： 实验实训一显微镜油镜的使用及细菌形态的观察 一、目的要求： 1、要求学生掌握显微镜油镜的使用及保养方法。 2、认识细菌的形态、基本构造和特殊构造 二、设备材料： 显微镜香柏油二甲苯擦镜纸细菌染色标本 三、实验实训内容： (一)显微镜油镜的使用 1、油镜的识别：油镜是显微镜物镜的一种，因使用时必须浸于香柏油内，故称油镜。 油镜与其他物镜有以下区别： (1)油镜一般是所有物镜中最长的。 (2)油镜头上标有其放大倍数“100×”或“90×”。 (3)不同厂家生产的显微镜，常在不同镜头上标有不同颜色的线圈以示区别，使用时应 先熟悉一下油镜头上的线圈颜色，以防用错物镜。 2、基本原理：因光线在香柏油中的折射率(n=1.515)与在玻璃中的折射率(n=1.52》 相近，故可减少因折射而射入镜头外的光线，提高了视野的亮度。 3、使用方法： (1)对光：将聚光器升至最高，将光圈放大至最大，调节凹面反光镜，使射入镜头中 的光线最强。 (2)装片：在细菌染色标本片的欲检部位滴一滴香柏油后，将标本片安放于载物台上， 用弹簧片固定，将待检部位移至聚光器上，先用低倍镜寻找适当的视野，再换用油镜头 观察。 (3)调焦：先用粗调节螺旋将载物台上升或使油镜头下降，使油镜头与标本片几乎接 触，然后，边用眼睛观察目镜，边用细调节螺旋向相反方向缓慢旋转，直至出现完全清 晰的物像为止。 (4)保养：油镜用毕，先用粗调节螺旋将载物台下移或使油镜头上升，将细菌标本片 取下，用擦镜纸吸去香柏油，如油已干或模糊不清者，可在擦镜纸上滴1一2滴二甲苯 或无水乙醇后将玻片上的香柏油吸净，并立即用干擦镜纸拭去二甲苯：用同样的方法将 油镜头擦拭干净。然后将低倍镜转至中央或将物镜转成“八”字形，调节粗调节螺旋
三、实践教学内容： 实验实训一 显微镜油镜的使用及细菌形态的观察 一、目的要求： 1、要求学生掌握显微镜油镜的使用及保养方法。 2、认识细菌的形态、基本构造和特殊构造。 二、设备材料： 显微镜 香柏油 二甲苯 擦镜纸 细菌染色标本 三、实验实训内容： （一）显微镜油镜的使用 1、油镜的识别：油镜是显微镜物镜的一种，因使用时必须浸于香柏油内，故称油镜。 油镜与其他物镜有以下区别： （1）油镜一般是所有物镜中最长的。 （2）油镜头上标有其放大倍数 “100×” 或“90×”。 （3）不同厂家生产的显微镜,常在不同镜头上标有不同颜色的线圈以示区别，使用时应 先熟悉一下油镜头上的线圈颜色,以防用错物镜。 2、基本原理：因光线在香柏油中的折射率（n=1.515）与在玻璃中的折射率（n=1.52） 相近，故可减少因折射而射入镜头外的光线，提高了视野的亮度。 3、使用方法： （1）对光：将聚光器升至最高，将光圈放大至最大，调节凹面反光镜，使射入镜头中 的光线最强。 （2）装片：在细菌染色标本片的欲检部位滴一滴香柏油后，将标本片安放于载物台上， 用弹簧片固定，将待检部位移至聚光器上，先用低倍镜寻找适当的视野，再换用油镜头 观察。 （3）调焦：先用粗调节螺旋将载物台上升或使油镜头下降，使油镜头与标本片几乎接 触，然后，边用眼睛观察目镜，边用细调节螺旋向相反方向缓慢旋转，直至出现完全清 晰的物像为止。 （4）保养：油镜用毕，先用粗调节螺旋将载物台下移或使油镜头上升，将细菌标本片 取下，用擦镜纸吸去香柏油，如油已干或模糊不清者，可在擦镜纸上滴 1－2 滴二甲苯 或无水乙醇后将玻片上的香柏油吸净，并立即用干擦镜纸拭去二甲苯；用同样的方法将 油镜头擦拭干净。然后将低倍镜转至中央或将物镜转成“八”字形，调节粗调节螺旋
使物镜头与载物台接触，下降聚光器。将显微镜用绸布盖好后装入镜箱，置于阴凉干燥 外。 (二)细菌形态的观察： 1、细菌基本形态的观察： 2、细菌特殊构造的观察： (1)球菌标本片的观察 (1)细菌荚膜标本片的观察 (2)杆菌标本片的观察 (2)细菌鞭毛标本片的观察 (3)螺旋菌标本片的观察 (3)细菌芽孢标本片的观察 注意事项： 1、当油镜头与标本片几乎接触时，不可再用粗调螺旋向上移动载物台或下降油镜头， 以免损坏玻片甚至压碎镜头。 2、油镜头和玻片只能用擦镜纸擦拭，不能用手、棉布或其他纸张擦拭。 3、香柏油的用量以1一2滴、能淹到油镜头的中间部分为宜，用量太多则浸染镜头，太 少则视野变暗不便观察。 4、为了增强视野的亮度，应做到三点：聚光器调至最高，光圈调至最大，反光镜用凹 面镜。 四、教学组织：实验1人一组，每人有一台显微镜，教师认真讲解操作规程，边讲解边 示范，学生观察做图，在学生基本清楚的下，教师进行分别指导教学。 五、作业：1、实验报告。2、心得体会。3、将细菌形态画于实验册上。 实验实训二 动物微生物检验中常用玻璃器皿的准备 一、目的要求：掌握动物微生物检验中常用玻璃器皿的准备 二、设备材料：试管吸管平皿三角烧瓶烧杯量筒脱脂棉纱布旧报纸石 炭酸洗衣粉盐酸等 三、实验实训内容 玻璃器皿的准备 1、购置的载片，先用2%盐酸浸泡一天，冲去盐酸。再用洗衣粉水洗涤，用自来水冲净， 浸泡在蒸馏水中或擦干装盒备用。 2、用过的玻璃器皿的处理： &洗涤前必须灭菌：高压灭菌：油类的物品乘热洗涤（培养基、血液试管滴管等）。吸 管：浸泡于5%石炭酸48H。&洗涤 ※用过的载片，先用纸擦去香柏油，再放入洗衣粉液中煮沸（或5%的石炭酸48H浸泡）， 稍冷后取出。逐个用清水洗净，放于酒精中。试管等物品同灭菌及洗涤。 ※盖片使用前，可用洗衣粉或洗液浸泡，洗净后再用95%乙醇浸泡，擦干备用，用过的 盖片也应及时洗净擦干保存
使物镜头与载物台接触，下降聚光器。将显微镜用绸布盖好后装入镜箱，置于阴凉干燥 处。 （二）细菌形态的观察： 1、细菌基本形态的观察： 2、细菌特殊构造的观察： （1）球菌标本片的观察 （1）细菌荚膜标本片的观察 （2）杆菌标本片的观察 （2）细菌鞭毛标本片的观察 （3）螺旋菌标本片的观察 （3）细菌芽孢标本片的观察 注意事项： 1、当油镜头与标本片几乎接触时，不可再用粗调螺旋向上移动载物台或下降油镜头， 以免损坏玻片甚至压碎镜头。 2、油镜头和玻片只能用擦镜纸擦拭，不能用手、棉布或其他纸张擦拭。 3、香柏油的用量以 1－2 滴、能淹到油镜头的中间部分为宜，用量太多则浸染镜头，太 少则视野变暗不便观察。 4、为了增强视野的亮度，应做到三点：聚光器调至最高，光圈调至最大，反光镜用凹 面镜。 四、教学组织：实验 1 人一组，每人有一台显微镜，教师认真讲解操作规程，边讲解边 示范，学生观察做图，在学生基本清楚的下，教师进行分别指导教学。 五、作业：1、实验报告。2、心得体会。3、将细菌形态画于实验册上。 实验实训二 动物微生物检验中常用玻璃器皿的准备 一、目的要求：掌握动物微生物检验中常用玻璃器皿的准备 二、设备材料：试管 吸管 平皿 三角烧瓶 烧杯 量筒 脱脂棉 纱布 旧报纸 石 炭酸 洗衣粉 盐酸等 三、实验实训内容： 玻璃器皿的准备 1、购置的载片，先用 2%盐酸浸泡一天，冲去盐酸。再用洗衣粉水洗涤，用自来水冲净， 浸泡在蒸馏水中或擦干装盒备用。 2、用过的玻璃器皿的处理： ＆洗涤前必须灭菌：高压灭菌：油类的物品乘热洗涤（培养基、血液试管滴管等）。吸 管：浸泡于 5%石炭酸 48H。＆洗涤： ※ 用过的载片，先用纸擦去香柏油，再放入洗衣粉液中煮沸（或 5%的石炭酸 48H 浸泡）， 稍冷后取出。逐个用清水洗净，放于酒精中。试管等物品同灭菌及洗涤。 ※盖片使用前，可用洗衣粉或洗液浸泡，洗净后再用 95%乙醇浸泡，擦干备用，用过的 盖片也应及时洗净擦干保存
※吸管浸泡于洗衣粉水中，用细铁丝取出棉花，用试管刷洗涤，再用自来水洗，用蒸馏 水冲洗。 &干燥：自然干燥或干燥箱。 &包装：※棉塞的制备※试管的包装※平皿的包装。※锥形瓶的包装。 四、教学组织：实验2-3人一组，教师认真讲解操作规程，边讲解边示范，学生理解 操作，在学生基本清楚的下，教师进行分别指导教学 五、作业：1、实验报告。2、心得体会。 实验实训三细菌标本片的制备及染色方法 一、目的要求： 要求学生掌握细菌标本片的制备基染色方法。 二、设备材料： 病料细菌培养物接种环玻片酒精灯染色缸染色架染色液 三、实验实训内容： (一)细菌涂片的制备 1、液体培养物及液体病料： (1)涂片用接种环取一滴培养液或液体病料，于玻片的中央均匀地涂布成适当大小 的薄层。 (2)干燥一般采用自然干燥，天气较冷时也可于酒精灯火焰上方30一40cm处适当加 热干燥。 (3)固定分为火焰固定和化学固定两种。火焰固定时，将干燥好的玻片涂面朝上， 以其背面在酒精灯火焰上来回通过数次，略作加热，以不烫手背为度：化学固定时， 可将干燥好的玻片浸入甲醇中2一3mi后取出晾干，或在涂片上滴加数滴甲醇使其作用 2-3min后自然挥发干燥。此外，丙酮和酒精也可用作化学固定剂：作瑞特氏染色的涂 片不需固定，因染色液中含有甲醇，有固定作用。 (4)染色根据不同的材料和菌种选择不同的染色法。 2、固体培养物：用接种环取一滴生理盐水于玻片的中央，用接种环挑取一个菌落于生 理盐水中混合，均匀地涂布成适当大小的薄层，干燥，固定，染色。 (二)细菌触片的制备：将固体病料（病变组织）作无菌切开，用切面在玻片中央接触 一下或稍用力印压成一薄层，干燥，固定，染色 (三)细菌的染色法： 1、单染色法：又称简单染色法，即只应用一种染料进行染色的方法。 (1)美蓝染色法：在已干燥、固定好的涂片或触片上滴加适量的美蓝染色液，染色1 -2min后，水洗，干燥（吸水纸吸干或自然干燥），镜检
※吸管浸泡于洗衣粉水中，用细铁丝取出棉花，用试管刷洗涤，再用自来水洗，用蒸馏 水冲洗。 ＆干燥：自然干燥或干燥箱。 ＆包装：※棉塞的制备※试管的包装※平皿的包装。※锥形瓶的包装。 四、教学组织：实验 2-3 人一组，教师认真讲解操作规程，边讲解边示范，学生理解、 操作，在学生基本清楚的下，教师进行分别指导教学。 五、作业：1、实验报告。2、心得体会。 实验实训三 细菌标本片的制备及染色方法 一、目的要求： 要求学生掌握细菌标本片的制备基染色方法。 二、设备材料： 病料 细菌培养物 接种环 玻片 酒精灯 染色缸 染色架 染色液 三、实验实训内容： （一）细菌涂片的制备： 1、液体培养物及液体病料： （1）涂片 用接种环取一滴培养液或液体病料，于玻片的中央均匀地涂布成适当大小 的薄层。 （2）干燥 一般采用自然干燥，天气较冷时也可于酒精灯火焰上方 30－40cm 处适当加 热干燥。 （3）固定 分为火焰固定和化学固定两种。火焰固定时，将干燥好的玻片涂面朝上， 以其背面在酒精灯火焰上来回通过数次，略作加热，以不烫手背 为度；化学固定时， 可将干燥好的玻片浸入甲醇中 2－3min 后取出晾干，或在涂片上滴加数滴甲醇使其作用 2－3min 后自然挥发干燥。此外，丙酮和酒精也可用作化学固定剂；作瑞特氏染色的涂 片不需固定，因染色液中含有甲醇，有固定作用。 （4）染色 根据不同的材料和菌种选择不同的染色法。 2、固体培养物：用接种环取一滴生理盐水于玻片的中央, 用接种环挑取一个菌落于生 理盐水中混合,均匀地涂布成适当大小的薄层,干燥,固定,染色。 （二）细菌触片的制备： 将固体病料（病变组织）作无菌切开,用切面在玻片中央接触 一下或稍用力印压成一薄层,干燥,固定,染色。 （三）细菌的染色法： 1、单染色法：又称简单染色法，即只应用一种染料进行染色的方法。 （1）美蓝染色法：在已干燥、固定好的涂片或触片上滴加适量的美蓝染色液，染色 1 －2min 后，水洗，干燥（吸水纸吸干或自然干燥），镜检
(2)瑞特氏染色：在己干燥、固定好的涂片或触片上滴加瑞特氏染色液，为避免干燥 可适当多加一些，或视情况补充滴加，1一3mi后再加与染液等量的中性蒸馏水或缓冲 液，轻轻晃动玻片，使之与染色液混合均匀，再经3一5min后，直接用水冲洗，吸干或 烘干后镜检。也可在玻片上的涂抹处盖一适当大小的滤纸，然后再在滤纸上轻轻滴加瑞 特氏染色液，至略浸过滤纸，视情况补充滴加，维持不千，3-5min后直接用水冲洗， 吸干或烘干后镜检。 (3)吉姆萨氏染色法：先将吉姆萨染色液原液稀释成常用的吉姆萨染色液（取5一10 滴原液于5l新煮过的中性蒸馏水中，混合均匀)，在经甲醇固定好的涂片上滴加足量 的染色液，或将涂片浸入盛有染色液的染色缸中，染色30mi或浸染数小时至24小时 后取出，水洗，吸干或烘干后镜检。 2、复染色法：应用两种或两种以上的染料或再加媒染剂进行染色的方法。 (1)革兰氏染色法：在已干燥、固定好的涂片上滴加适量的草酸铵结晶紫染色液，染 色1-2min后，水洗，再加革兰氏碘液，作用1-2min后，水洗，加95%酒精脱色 0.5-lmin后，水洗，稀释石炭酸复红（或沙黄、番红）染色液复染0.5min后，水 洗，干燥，镜检。 (2)抗酸染色法：常用的有萋一尼氏染色法和沙黄一美蓝染色法。 ①萋一尼氏染色法：在已干燥、固定好的涂片上滴加较多量的石炭酸复红染色液，酒精 灯火焰上方微微加热至冒出蒸气并维持3一5mi,水洗：再用3%盐酸酒精脱色至无染色 液流出，充分水洗：然后用碱性美蓝染液复染约1mi,水洗，吸干，镜检。 ②沙黄一美蓝染色法：在己干燥、固定好的涂片上滴加较多量的沙黄染色液，酒精灯 火焰上方微微加热使冒蒸气3-5次，维持1一2in,水洗：再用再用3%盐酸酒精脱色 至无染色液流出，充分水洗：然后用碱性美蓝染液复染约lmi,水洗，吸干，镜检。 注意事项： 1、做细菌涂片时，不宜涂得过厚，以免影响制片效果。 2、固定必须确实，火焰固定时不宜温度过高，以免破坏菌体结构。 3、每种染液染色的过程中应保持染色液不干，尤其加热染色的染液，在染色过程中应 随时添加，以免蒸发干，影响染色效果。 4、每种染液染色后，应用水将染液一起冲掉，不可先将染液倾去后再用水冲洗。 四、教学组织：实验2-3人一组，教师认真讲解操作规程，边讲解边示范，学生操作、 观察、做图，在学生基本清楚的下，教师进行分别指导教学。 五、作业：1、实验报告。2、心得体会。3、将每组涂片结果画于实验册上。 实验实训四 常用培养基的制备 一、目的要求：
（2）瑞特氏染色：在已干燥、固定好的涂片或触片上滴加瑞特氏染色液，为避免干燥， 可适当多加一些，或视情况补充滴加，1－3min 后再加与染液等量的中性蒸馏水或缓冲 液，轻轻晃动玻片，使之与染色液混合均匀，再经 3－5min 后，直接用水冲洗，吸干或 烘干后镜检。也可在玻片上的涂抹处盖一适当大小的滤纸，然后再在滤纸上轻轻滴加瑞 特氏染色液，至略浸过滤纸，视情况补充滴加，维持不干，3－5min 后直接用水冲洗， 吸干或烘干后镜检。 （3）吉姆萨氏染色法：先将吉姆萨染色液原液稀释成常用的吉姆萨染色液（取 5－10 滴原液于 5ml 新煮过的中性蒸馏水中，混合均匀），在经甲醇固定好的涂片上滴加足量 的染色液，或将涂片浸入盛有染色液的染色缸中，染色 30min 或浸染数小时至 24 小时 后取出，水洗，吸干或烘干后镜检。 2、复染色法：应用两种或两种以上的染料或再加媒染剂进行染色的方法。 （1）革兰氏染色法：在已干燥、固定好的涂片上滴加适量的草酸铵结晶紫染色液，染 色 1－2min 后，水洗， 再加革兰氏碘液，作用 1－2min 后， 水洗，加 95％酒精脱色 0.5－1min 后，水洗， 稀释石炭酸复红（或沙黄、番红）染色液复染 0.5min 后， 水 洗，干燥，镜检。 （2）抗酸染色法：常用的有萋－尼氏染色法和沙黄－美蓝染色法。 ①萋－尼氏染色法：在已干燥、固定好的涂片上滴加较多量的石炭酸复红染色液，酒精 灯火焰上方微微加热至冒出蒸气并维持 3－5min，水洗；再用 3%盐酸酒精脱色至无染色 液流出，充分水洗；然后用碱性美蓝染液复染约 1min，水洗，吸干，镜检。 ② 沙黄－美蓝染色法：在已干燥、固定好的涂片上滴加较多量的沙黄染色液，酒精灯 火焰上方微微加热使冒蒸气 3－5 次，维持 1－2min，水洗；再用再用 3%盐酸酒精脱色 至无染色液流出，充分水洗；然后用碱性美蓝染液复染约 1min，水洗，吸干，镜检。 注意事项： 1、做细菌涂片时，不宜涂得过厚，以免影响制片效果。 2、固定必须确实，火焰固定时不宜温度过高，以免破坏菌体结构。 3、每种染液染色的过程中应保持染色液不干，尤其加热染色的染液，在染色过程中应 随时添加，以免蒸发干，影响染色效果。 4、每种染液染色后，应用水将染液一起冲掉，不可先将染液倾去后再用水冲洗。 四、教学组织：实验 2-3 人一组，教师认真讲解操作规程，边讲解边示范，学生操作、 观察、做图，在学生基本清楚的下，教师进行分别指导教学。 五、作业：1、实验报告。2、心得体会。3、将每组涂片结果画于实验册上。 实验实训四 常用培养基的制备 一、目的要求：
1、要求学生掌握常用培养基的制备过程 2、要求学生掌握培养基pH的测定和调节方法 二、设备材料： 灭菌锥形瓶烧杯试管平皿天平高压灭菌器过滤装置漏斗纱布电炉 玻棒新鲜牛肉或牛肉浸膏蛋白胨磷酸氢二钾氯化钠琼脂蒸馏水0.1moln 氢氧化钠溶液精密pH试纸等 三、实验实训内容： (·)基础培养基的制备： 1、普通肉汤培养基：用新鲜牛肉先制成肉浸液。取新鲜牛肉去脂肪和筋膜，切成小块， 称重，按肉水比1：2的比例加水浸泡过夜（夏季应置于冰箱内），煮沸约h后用纱布 滤去肉渣挤出肉水，然后用滤纸过滤肉浸液，补足原有水量，装入锥形瓶中用高压灭菌 器灭菌(0.105Mpa,20min)后，置阴凉暗处保存。取上述肉浸液1000ml于锥形瓶中， 称取蛋白胨10g、磷酸氢二钾1g,氯化钠5g,加入肉浸液中充分搅拌溶解，必要时可稍 加温促进溶解。测定和调整pH为7.4-7.6，用滤纸过滤，置高压过滤器内灭菌(0.105Mpa, 20min)后，于无菌室或超净台内分装于试管内，每管约10ml,无此设备者可先分装后 灭菌。如无新鲜牛肉，也可用牛肉浸膏代替。用量是每1000ml培养基3一5g。 2、普通琼脂培养基：取1000ml普通肉汤培养基于烧杯中，加入20一30g琼脂，煮沸使 琼脂充分融化，趁热用2一4层纱布过滤，补充蒸馏水至1000ml,测定和调节pH至所 需标准。高压灭菌后无菌分装于试管（装量为14一13管）中趁热斜置，冷却即成琼脂 斜面：或分装平皿（厚度为2一3mm)中，水平静置冷却即成琼脂平板。也可先分装于 试管中，再进行高压灭菌，然后趁热斜置冷却。 (二)营养培养基的制备： 1、鲜血琼脂培养基：亦称为血液琼脂培养基。将灭菌后的普通琼脂培养基加热溶解， 冷却至45一50℃时加入无菌鲜血（每100ml普通琼脂中加入鲜血5一6ml),摇匀后趁热 分装于试管中制成斜面，或分装于平皿中制成平面。若温度过高时加入鲜血，则血液变 为暗褐色，称为巧克力琼脂。 2、血清琼脂培养基：方法同鲜血琼脂培养基，血清用量是每100ml普通琼脂中加入5 -6ml。 (三)其他常用培养基的制备： 1、半固体培养基：制备方法同普通琼脂，只是将琼脂的用量减少为0.5%一0.7%。 2、马铃薯琼脂培养基：马铃薯200g,去皮后切成小块，加蒸馏水煮沸30min,用4层 纱布过滤，加入葡萄糖20g,加入融化后补充蒸馏水至1000ml,调节pH至4.5，灭菌后 分装即可。主要用于霉菌和担子菌的分离培养。 3、麦抗凯琼脂培养基：蛋白胨2g、乳糖1g、氯化钠0.5g、胆盐0.5g、1%中性红水溶 液0.5ml、蒸馏水加至1000ml
1、要求学生掌握常用培养基的制备过程 2、要求学生掌握培养基 pH 的测定和调节方法 二、设备材料： 灭菌锥形瓶 烧杯 试管 平皿 天平 高压灭菌器 过滤装置 漏斗 纱布 电炉 玻棒 新鲜牛肉或牛肉浸膏 蛋白胨 磷酸氢二钾 氯化钠 琼脂 蒸馏水 0.1 mol/l 氢氧化钠溶液 精密 pH 试纸等 三、实验实训内容： （一）基础培养基的制备： 1、普通肉汤培养基：用新鲜牛肉先制成肉浸液。取新鲜牛肉去脂肪和筋膜，切成小块， 称重，按肉水比 1：2 的比例加水浸泡过夜（夏季应置于冰箱内），煮沸约 1h 后用纱布 滤去肉渣挤出肉水，然后用滤纸过滤肉浸液，补足原有水量，装入锥形瓶中用高压灭菌 器灭菌（0.105Mpa，20min）后，置阴凉暗处保存。取上述肉浸液 1000ml 于锥形瓶中， 称取蛋白胨 10g、磷酸氢二钾 1g，氯化钠 5g，加入肉浸液中充分搅拌溶解，必要时可稍 加温促进溶解。测定和调整 pH 为 7.4-7.6，用滤纸过滤，置高压过滤器内灭菌（0.105Mpa， 20min）后，于无菌室或超净台内分装于试管内，每管约 10ml，无此设备者可先分装后 灭菌。如无新鲜牛肉，也可用牛肉浸膏代替。用量是每 1000ml 培养基 3－5g。 2、普通琼脂培养基：取 1000ml 普通肉汤培养基于烧杯中，加入 20－30g 琼脂，煮沸使 琼脂充分融化，趁热用 2－4 层纱布过滤，补充蒸馏水至 1000ml，测定和调节 pH 至所 需标准。高压灭菌后无菌分装于试管（装量为 1/4－1/3 管）中趁热斜置，冷却即成琼脂 斜面；或分装平皿（厚度为 2－3mm）中，水平静置冷却即成琼脂平板。也可先分装于 试管中，再进行高压灭菌，然后趁热斜置冷却。 （二）营养培养基的制备： 1、鲜血琼脂培养基：亦称为血液琼脂培养基。将灭菌后的普通琼脂培养基加热溶解， 冷却至 45－50℃时加入无菌鲜血（每 100ml 普通琼脂中加入鲜血 5－6ml），摇匀后趁热 分装于试管中制成斜面，或分装于平皿中制成平面。若温度过高时加入鲜血，则血液变 为暗褐色，称为巧克力琼脂。 2、血清琼脂培养基：方法同鲜血琼脂培养基，血清用量是每 100ml 普通琼脂中加入 5 －6ml。 （三）其他常用培养基的制备： 1、半固体培养基：制备方法同普通琼脂，只是将琼脂的用量减少为 0.5%－0.7%。 2、马铃薯琼脂培养基：马铃薯 200g，去皮后切成小块，加蒸馏水煮沸 30min，用 4 层 纱布过滤，加入葡萄糖 20g，加入融化后补充蒸馏水至 1000ml，调节 pH 至 4.5，灭菌后 分装即可。主要用于霉菌和担子菌的分离培养。 3、麦抗凯琼脂培养基：蛋白胨 2g、乳糖 1g、氯化钠 0.5g、胆盐 0.5g、1％中性红水溶 液 0.5ml、蒸馏水加至 1000ml
4、SS琼脂培养基：蛋白陈5g、牛肉浸音5g、乳糖10g、胆盐10g、枸機酸钠10-14g 硫代硫酸钠8.5g、枸橼酸铁0.5g、0.5%中性红水溶液4.5ml、0.1%亮绿溶液0.33ml、琼 脂25-33g、蒸馏水加至1000ml。 (四)pH测定法： 1、精密pH试纸法：取该试纸一条浸入欲测的培养基中，0.5s后取出与标准比色卡比较， 如为酸性，滴加1moM氢氧化钠溶液至pH在所需范围之间。在滴加1moM氢氧化钠溶 液时，应充分摇匀，再用试纸测定。 2、标准比色管法：一般细菌生长的pH为7.6-7.8，测定方法如下： (1)取大小相同的比色管4支，每管分别加入不同的溶液：①培养基管（对照管）加 肉汤培养基5ml:②标准比色管：③加有指示剂的培养基管（内装5ml肉汤培养基和0.02% 酚红指示剂0.25ml)④蒸馏水管。 (2)对光观察：比较两侧观察孔内颜色是否相同，若培养基为酸性（一般为酸性），则 向③管内慢慢滴入滴加0.lmol1氢氧化钠溶液，每滴一次，将试管内液体摇匀，直至 ④两管相加的颜色与①②两管相同为止。 (3)记录5ml培养基用去滴加0.Imol氢氧化钠溶液的用量，按下列公式计算培养基 总量中需加滴加Imol/氢氧化钠溶液的用量。 全部培养基加滴力 5ml 培养基所需 培养基总毫升 1molM氢氧化钠溶液 23 4 B 养基的分装装置与棉塞 四、教学组织：实验2-3人一组，教师认真讲解操作规程，边讲解边示 范，学生理解、操作，在学生基本清楚的下，教师进行分别指导教学。 五、作业：1、实验报告。2、心得体会。 实验实训五 细菌的分离培养及培养性状的观察
4、SS 琼脂培养基：蛋白胨 5g、牛肉浸膏 5g、乳糖 10g、胆盐 10g、枸橼酸钠 10－14g、 硫代硫酸钠 8.5g、枸橼酸铁 0.5g、0.5％中性红水溶液 4.5ml、0.1%亮绿溶液 0.33ml、琼 脂 25－33g、蒸馏水加至 1000ml。 （四）pH 测定法： 1、精密 pH 试纸法：取该试纸一条浸入欲测的培养基中，0.5s 后取出与标准比色卡比较， 如为酸性，滴加 1mol/l 氢氧化钠溶液至 pH 在所需范围之间。在滴加 1mol/l 氢氧化钠溶 液时，应充分摇匀，再用试纸测定。 2、标准比色管法：一般细菌生长的 pH 为 7.6-7.8，测定方法如下： （1）取大小相同的比色管 4 支，每管分别加入不同的溶液：①培养基管（对照管）加 肉汤培养基5ml；②标准比色管；③加有指示剂的培养基管（内装5ml肉汤培养基和0.02% 酚红指示剂 0.25ml）④蒸馏水管。 （2）对光观察：比较两侧观察孔内颜色是否相同，若培养基为酸性（一般为酸性），则 向③管内慢慢滴入滴加 0.1mol/l 氢氧化钠溶液，每滴一次，将试管内液体摇匀， 直至 ④两管相加的颜色与①②两管相同为止。 （3）记录 5ml 培养基用去滴加 0.1mol/l 氢氧化钠溶液的用量，按下列公式计算培养基 总量中需加滴加 1mol/l 氢氧化钠溶液的用量。 全部培养基加滴加 5ml 培养基所需 培养基总毫升 1/10 1mol/l 氢氧化钠溶液 0.1mol/l 氢氧化钠（ml）50 培养基的分装装置与棉塞 四、教学组织：实验 2-3 人一组，教师认真讲解操作规程，边讲解边示 范，学生理解、操作，在学生基本清楚的下，教师进行分别指导教学。 五、作业：1、实验报告。2、心得体会。 实验实训五 细菌的分离培养及培养性状的观察
一、目的要求： 1、要求学生掌握细菌的分离培养、纯化的操作机能： 2、要求学生掌握细菌在培养基上的生长特性： 二、设备材料： 恒温培养箱病料或细菌培养物接种环接种针酒精灯灭菌吸管各种细菌培 养基无水碳酸钠氢氧化钠或氢氧化钾凡士林及生理盐水 三、实验实训内容： (一)细菌的分离培养： 1、病料的采取：将新鲜肛门拭子用灭菌生理盐水洗涤，洗涤液可用于分离培养；无菌 采取新鲜粪便的中心部分，用灭菌生理盐水稀释搅匀后澄清，其上清液可用于分离培养： 如为病理组织，可用烧红的刀片在其表面烫一下，随即用此刀片在烫过的地方切开一小 口，用灭菌接种环在切口内蘸一下即可用于分离培养。 2、平板划线分离培养：目的是将病理材料中的细菌分散，以便使细菌单在，从而发育 成单个菌落，防止长成菌苔。 (1)直接划线分离培养：点燃酒精灯后，左手持皿，底朝下，盖在上，以无名指和小 指托底，拇指、食指和中指将皿盖揭开成20度的角度，角度不宜过大，以防空气进入： 右手持接种环，在火焰上烧灼后取少许的材料涂在培养基边缘，将接种环上多余的材料 在火焰上烧掉，然后在培养基表面进行“Z”字形划线，然后将平皿盖好，倒置于恒温 培养箱中培养。 (2)分区划线分离培养：用玻璃铅笔在皿底外面划线，将培养基分成3一6个小区，持 皿方法同直接划线，但每划完一个小区应将平皿旋转一定角度，以便于划线。 平板划线操作示意图
一、目的要求： 1、要求学生掌握细菌的分离培养、纯化的操作机能； 2、要求学生掌握细菌在培养基上的生长特性； 二、设备材料： 恒温培养箱 病料或细菌培养物 接种环 接种针 酒精灯 灭菌吸管 各种细菌培 养基 无水碳酸钠 氢氧化钠或氢氧化钾 凡士林及生理盐水 三、实验实训内容： （一）细菌的分离培养： 1、病料的采取：将新鲜肛门拭子用灭菌生理盐水洗涤，洗涤液可用于分离培养；无菌 采取新鲜粪便的中心部分，用灭菌生理盐水稀释搅匀后澄清，其上清液可用于分离培养； 如为病理组织，可用烧红的刀片在其表面烫一下，随即用此刀片在烫过的地方切开一小 口，用灭菌接种环在切口内蘸一下即可用于分离培养。 2、平板划线分离培养：目的是将病理材料中的细菌分散，以便使细菌单在，从而发育 成单个菌落，防止长成菌苔。 （1）直接划线分离培养：点燃酒精灯后，左手持皿，底朝下，盖在上，以无名指和小 指托底，拇指、食指和中指将皿盖揭开成 20 度的角度，角度不宜过大，以防空气进入； 右手持接种环，在火焰上烧灼后取少许的材料涂在培养基边缘，将接种环上多余的材料 在火焰上烧掉，然后在培养基表面进行“Z”字形划线，然后将平皿盖好，倒置于恒温 培养箱中培养。 （2）分区划线分离培养：用玻璃铅笔在皿底外面划线，将培养基分成 3－6 个小区，持 皿方法同直接划线，但每划完一个小区应将平皿旋转一定角度，以便于划线。 平板划线操作示意图
开始处 A 划线分离示意图 (3)斜面划线分离培养：左手持试管，手掌朝上，食指和拇指夹住试管：右手持接种 环，先将试管的棉塞端在酒精灯火焰上方旋转两周，然后用右手小指和手掌边缘夹住棉 塞，打开试管，保持试管口在火焰上方进行操作，在斜面上从试管底部向试管口作“Z” 字形划线，接种完毕，在酒精灯火焰附近塞上棉塞后，在火焰上方旋转两周。用铁丝篓 或试管架直立放置于恒温培养箱中培养。 (4)增菌培养：当病料中的细菌很少时，直接进行分离培养往往不易成功，常先用液体 培养基进行增菌培养。方法是取少许病理材料直接加入培养基中，置恒温培养箱中培养 24一48后，可取少量培养液作划线分离培养。 (二)细菌的纯化：操作方法基本同分离培养，但进行斜面纯化移植时左手应同时握住 原培养管和待接种管，右手小指和手掌边缘夹住一个棉塞，无名指和中指夹住一个棉塞， 必要时中指和食指还可夹住第三个棉塞，液体培养基的纯化移植同液体培养基初次分离 培养。 (三)细菌在培养基上的生长特性观察： 1、固体培养基上的生长特性：细菌在固体培养基上生长繁殖，可形成菌落。观察菌落 时，主要看以下内容： (1)大小：不同细菌，其菌落大小变化很大。常用其直径来表示，单位是m或μm。 (2)形状：主要有圆形、露滴状、乳头状或油煎蛋状、云雾状、放射状或蛛网状、同 心圆状、扁平和针尖状等。 (3)边缘特征：有整齐、波浪状、锯齿状、卷发状等。 (4)表面性状：有光滑、粗糙、皱褶、颗粒状、同心圆状、放射状等。 (5)湿润度：有干燥和湿润两种。 (6)隆起度：有隆起、轻度隆起、中央隆起和云雾状等。 (7)色泽和透明度：色泽有白、乳白、黄、橙、红及无色等：透明度有透明、半透明 不透明等。 (8) 质地：有坚硬、柔软和粘稠等
划线分离示意图 （3）斜面划线分离培养：左手持试管，手掌朝上，食指和拇指夹住试管；右手持接种 环，先将试管的棉塞端在酒精灯火焰上方旋转两周，然后用右手小指和手掌边缘夹住棉 塞，打开试管，保持试管口在火焰上方进行操作，在斜面上从试管底部向试管口作“Z” 字形划线，接种完毕，在酒精灯火焰附近塞上棉塞后，在火焰上方旋转两周。用铁丝篓 或试管架直立放置于恒温培养箱中培养。 (4)增菌培养：当病料中的细菌很少时，直接进行分离培养往往不易成功，常先用液体 培养基进行增菌培养。方法是取少许病理材料直接加入培养基中，置恒温培养箱中培养 24－48h 后，可取少量培养液作划线分离培养。 （二）细菌的纯化：操作方法基本同分离培养，但进行斜面纯化移植时左手应同时握住 原培养管和待接种管，右手小指和手掌边缘夹住一个棉塞，无名指和中指夹住一个棉塞， 必要时中指和食指还可夹住第三个棉塞，液体培养基的纯化移植同液体培养基初次分离 培养。 （三）细菌在培养基上的生长特性观察： 1、固体培养基上的生长特性：细菌在固体培养基上生长繁殖，可形成菌落。观察菌落 时，主要看以下内容： （1）大小：不同细菌，其菌落大小变化很大。常用其直径来表示，单位是 mm 或μm。 （2）形状：主要有圆形、露滴状、乳头状或油煎蛋状、云雾状、放射状或蛛网状、同 心圆状、扁平和针尖状等。 （3）边缘特征：有整齐、波浪状、锯齿状、卷发状等。 （4）表面性状：有光滑、粗糙、皱褶、颗粒状、同心圆状、放射状等。 （5）湿润度：有干燥和湿润两种。 （6）隆起度：有隆起、轻度隆起、中央隆起和云雾状等。 （7）色泽和透明度：色泽有白、乳白、黄、橙、红及无色等；透明度有透明、半透明、 不透明等。 （8） 质地：有坚硬、柔软和粘稠等
(9)溶血性：分为a一溶血、B一溶血和Y一溶血三种： 2、液体培养基上的生长特性： (1)浑浊度：有强度浑浊、轻微浑浊和透明三种。 (2)底层情况：包括有沉淀和无沉淀两种，有沉淀又可分为颗粒状和絮状两种。 (3)表面性状：分为形成荚膜、菌环和无变化三种情况。 (4)产生气体和气味：很多细菌在生长繁殖的过程中能分解一些有机物产生气体，可 通过观察是否产生气泡或收集产生的气体来判断：另一些细菌在发酵有机物时能产生特 殊气味，如鱼腥味、醇香味等。 (5)色泽：细菌在生长繁殖的过程中能使培养基变色，如绿色、红色、黑色等。 3、半固体培养基上的生长特性：有运动性的细菌会沿穿刺线向周围扩散生长，形成侧 松树状、试管刷状：无运动性的细菌则只沿穿刺线呈线状生长。 注竟事项： 1、细菌的分离培养必须严格无菌操作。 2、接种环或接种针在挑取菌落之前应先在培养基上无菌落处冷却，否则会将所挑的茵 落烫死而使培养失败。 3、划线接种时应先将接种环的环部稍弯曲，同时用力适度：分区接种时，每区开始的 第一条线应通过上一区的划线。 4、不同细菌所需要的培养时间相差很大，应根据不同的菌种培养观察足够的时间。 四、教学组织：实验2-3人一组，教师认真讲解操作规程，边讲解边示范，学生操作， 在学生基本清楚的下，教师进行分别指导教学 五、作业：1、实验报告。2、心得体会 实验实训六细菌的药物敏感试验（纸片法）技术 一、目的要求： 1、掌握消毒药及治疗药物的杀菌或抑菌作用。 2、学会药物敏感性试验的操作技术。 二、设备材料： 接种环酒精灯试管架恒温箱镊子常用消毒剂浸有药物的干燥滤纸片普 通琼脂平板大肠杆菌枯草杆菌和金黄色葡萄球菌的培养物各种抗生素 三、实验实训内容： (一)化学消毒剂的杀菌作用： 1、以接种环取大肠杆菌及葡萄球菌菌液(18一24h肉汤培养物)，用连续划线法分别接 种于两个琼脂平板上，使菌液密布于培养基表面。 2、以灭菌镊子夹取纸片（直径6m)分别浸于0.1%升汞、5%石炭酸、2%来苏儿、2%
（9）溶血性：分为α－溶血、β－溶血和γ－溶血三种； 2、液体培养基上的生长特性： （1）浑浊度：有强度浑浊、轻微浑浊和透明三种。 （2）底层情况：包括有沉淀和无沉淀两种，有沉淀又可分为颗粒状和絮状两种。 （3）表面性状：分为形成荚膜、菌环和无变化三种情况。 （4）产生气体和气味：很多细菌在生长繁殖的过程中能分解一些有机物产生气体，可 通过观察是否产生气泡或收集产生的气体来判断；另一些细菌在发酵有机物时能产生特 殊气味，如鱼腥味、醇香味等。 （5）色泽：细菌在生长繁殖的过程中能使培养基变色，如绿色、红色、黑色等。 3、半固体培养基上的生长特性：有运动性的细菌会沿穿刺线向周围扩散生长，形成侧 松树状、试管刷状；无运动性的细菌则只沿穿刺线呈线状生长。 注意事项： 1、细菌的分离培养必须严格无菌操作。 2、接种环或接种针在挑取菌落之前应先在培养基上无菌落处冷却，否则会将所挑的菌 落烫死而使培养失败。 3、划线接种时应先将接种环的环部稍弯曲，同时用力适度；分区接种时，每区开始的 第一条线应通过上一区的划线。 4、不同细菌所需要的培养时间相差很大，应根据不同的菌种培养观察足够的时间。 四、教学组织：实验 2-3 人一组，教师认真讲解操作规程，边讲解边示范，学生操作， 在学生基本清楚的下，教师进行分别指导教学。 五、作业：1、实验报告。2、心得体会。 实验实训六 细菌的药物敏感试验（纸片法）技术 一、目的要求： 1、掌握消毒药及治疗药物的杀菌或抑菌作用。 2、学会药物敏感性试验的操作技术。 二、设备材料： 接种环 酒精灯 试管架 恒温箱 镊子 常用消毒剂 浸有药物的干燥滤纸片 普 通琼脂平板 大肠杆菌 枯草杆菌和金黄色葡萄球菌的培养物 各种抗生素 三、实验实训内容： （一）化学消毒剂的杀菌作用： 1、以接种环取大肠杆菌及葡萄球菌菌液（18－24h 肉汤培养物），用连续划线法分别接 种于两个琼脂平板上，使菌液密布于培养基表面。 2、以灭菌镊子夹取纸片（直径 6mm）分别浸于 0.1%升汞、5％石炭酸、2％来苏儿、2％