纸色谱分离手性化合物 1951年 Kotake以纸色谱分离了谷氨酸和酪氨酸的消旋体; 1952年, Dalgliesh用纸色谱拆分了芳香氨基酸,并且提出了三 点接触的理论概念:一对对映体被固定相手性试剂识别,至少要 受到对映体和手性试剂3个位点的作用。这些作用是氢键、偶 极—偶极、π——π、静电、疏水或空间作用,也称为三点识别 模式。 纸色谱载体是纤维素,结构中不对称空腔对于两个对映体具有选 择性识别能力。不是单纯的分配技术,而是与对称的纤维素光活 性有关。用该理论知道分离氨基酸取得极大成功。 缺点:展开时间过长 Contractor改进:将纤维素作薄层,分离D—色氨酸,展开时间 由纸色谱的16小时缩短为1小时。三乙酰纤维素与纤维素有类似 的拆分机理。 目前纤维素薄层用与分离肽类及某些对映体药物
•纸色谱分离手性化合物 ◼ 1951年Kotake 以纸色谱分离了谷氨酸和酪氨酸的消旋体； ◼ 1952年， Dalgliesh用纸色谱拆分了芳香氨基酸，并且提出了三 点接触的理论概念：一对对映体被固定相手性试剂识别，至少要 受到对映体和手性试剂3个位点的作用。这些作用是氢键、偶 极—偶极、π——π、静电、疏水或空间作用，也称为三点识别 模式。 ◼ 纸色谱载体是纤维素，结构中不对称空腔对于两个对映体具有选 择性识别能力。不是单纯的分配技术，而是与对称的纤维素光活 性有关。用该理论知道分离氨基酸取得极大成功。 ◼ 缺点：展开时间过长。 ◼ Contractor改进：将纤维素作薄层，分离DL—色氨酸，展开时间 由纸色谱的16小时缩短为1小时。三乙酰纤维素与纤维素有类似 的拆分机理。 ◼ 目前纤维素薄层用与分离肽类及某些对映体药物
薄层色谱分离氟比洛芬对映体 微晶三乙酰纤维素( microcrystalline cellulose triacetate MCTA) 分离药物氟比洛芬 TCL规格;20cm×20cm( acetyl cellulose AC)(30010/AC 20和300-10/AC_40)或(MCTA粒度∠10微米),层厚250微 米 粘合剂为羧甲基纤维素钠 sodium carboxymethylcellulose CMC)或硅胶60GF24(粒度15微米)的乙酰化物水溶液 乙酰纤维素CMC薄层:取CMC1克与水10毫 升 H3C co0搅拌5分钟,再加入手性吸附剂9克和乙醇 35毫升,搅拌5分钟,匀浆后立刻铺板。 乙酰纤维素硅胶60F254薄层板:硅胶 60GF2543克与水15毫升,搅拌5分钟,加 入手性吸附剂9克和乙醇35毫升,振摇5分 钟铺板
薄层色谱分离氟比洛芬对映体 ◼ 微晶三乙酰纤维素（microcrystalline cellulose triacetate MCTA) 分离药物氟比洛芬。 ◼ TCL规格；20cm×20cm (acetyl cellulose AC) （300—10/AC— 20和300—10/AC—40）或（MCTA 粒度∠10微米），层厚250微 米。 ◼ 粘合剂为羧甲基纤维素钠（sodium carboxymethylcvellulose, CMC)或硅胶60GF254 （粒度15微米）的乙酰化物水溶液 。 ◼ 乙酰纤维素CMC薄层：取CMC1克与水10毫 升 ◼ 搅拌5分钟，再加入手性吸附剂9克和乙醇 ◼ 35毫升，搅拌5分钟，匀浆后立刻铺板。 ◼ 乙酰纤维素硅胶60GF254薄层板：硅胶 ◼ 60GF254 3克与水15毫升，搅拌5分钟，加 ◼ 入手性吸附剂9克和乙醇35毫升，振摇5分 钟铺板。 F H3C COOH
室温干燥,25小时内使用,勿于空气中久置 流动相:乙醇:水=40:60 HaC 展开时间:150分钟; 检测:UV254nm; 薄层中有CMC粘合剂时,拆分效能增加 三乙酰纤维素—硅胶60GF254薄层板展开时间1小时亦有好的效果 上述条件不能拆分苯氧布洛芬对映体(见右上图)。可能是两者所喊手 性中心在分支中位置不同所致一立体效能和疏水作用的重要作用。 卡洛芬(见右下图)对映体的分离:MCTA硅胶60GF254 流动相:异丙醇:水=40:60 H3C 展开时间6小时 NH 水和异丙醇有反响洗脱作用
◼ 室温干燥，2—5小时内使用，勿于空气中久置。 ◼ 流动相：乙醇：水 = 40：60； ◼ 展开时间：150分钟; ◼ 检测：UV254nm; ◼ 薄层中有CMC粘合剂时，拆分效能增加。 ◼ 三乙酰纤维素—硅胶60GF254薄层板展开时间1小时亦有好的效果。 ◼ 上述条件不能拆分苯氧布洛芬对映体（见右上图）。可能是两者所喊手 性中心在分支中位置不同所致—立体效能和疏水作用的重要作用。 ◼ 卡洛芬（见右下图）对映体的分离：MCTA—硅胶60GF254 ◼ 流动相：异丙醇：水 = 40：60 ◼ 展开时间6小时 ◼ 水和异丙醇有反响洗脱作用。 O H3C COOH NH H3C COOH Cl
β—环糊精(β- cyclodextrinsβ_CD)键合相 βa-Φ是℃修是_吡葡擿樹糖址苷雒瑳键而成 该分羯和有悱館卾釣方式 的方蜊映纲映俠铧复郃从而Ro-c2 在色雄禅到留差刹分目的。。00 Alk次将ΦD以噢轿镭秭鞬和于 硅胶藷表服丹鸭师酰、氟機氨1-<、°s 萘磺釅酸處騻ν爕轁茂铁类化合物。α 薄层的备制备: 取β-CD键合硅胶1.5克加入50%甲醇水溶液 CH 15毫升(含粘合剂002克)匀浆,铺3mm薄板 (5cm20cm),空气晾干,使用时75度活化15min 流动相:甲醇/三乙基醋酸铵(1:1,PH41) 荧光检出
β —环糊精（ β —cyclodextrins β —CD)键合相 ◼ β —CD是7个α—D—吡喃葡萄糖以1，4—苷键环和而成。 ◼ 该分子的缓和空腔具有手性识别能力，能以包结的方式 的方式与对映体分子形成非对映体主客复合物，从而 在色谱过程中造成滞留差异，达到分离目的。 Alak首次将β —CD以7个原子的桥键和于 硅胶表面，成功用于分离丹酰、萘取代氨 基酸及二茂铁类化合物。 薄层板的制备： O O CH2 O R O R O O H2C O R O R O O CH2 O R O R O O CH2 O R O R O O CH2 O R O R O O CH2 O R R O O O R O CH2 O R O O CH2 O R O R • β —CD是7个α—D—吡喃葡萄糖以1，4—苷键环合而成。 • 该分子的缓和空腔具有手性识别能力，能以包结的方式 的方式与对映体分子形成非对映体主客复合物，从而 在色谱过程中造成滞留差异，达到分离目的。 Alak首次将β —CD以7个原子的桥键和于 硅胶表面，成功用于分离丹酰（5—二甲氨基—1— 萘磺酰）、萘取代氨基酸及二茂铁类化合物。 薄层板的制备： 取β —CD键合硅胶1.5克加入50%甲醇水溶液 15毫升（含粘合剂0.02克）匀浆，铺3mm薄板 (5cm 20cm) ，空气晾干，使用时75度活化15min。 流动相：甲醇/三乙基醋酸铵（1：1，PH 4.1） 荧光检出
手性配体交换色谱固定相 该拆分法是利用手性配体与对映异构体之间形成具有不同稳定性铜 复合物进行色谱分离。当手性配体为羟基取代脯氨酸衍生物,待 拆分对映体为氨基酸时复合物以离子键吸附于硅胶疏水表面。手 性配体一般以氨基酸衍生物制成。如将RPC1薄层板用N,N 二正丙基L—丙氨酸铜复合物的缓冲溶液处理,制成的手性薄层板 成功分离了丹酰氨基酸各对对映体。 以多聚L—丙氨酸酰胺铜复合物的反相手性薄层板成功分离类似氨基 酸异构体 市售手性薄层板:具有浓缩区的RPC1s薄层板,硅胶平均直径5微米 所用手性配体为羟脯氨酸衍生物的铜复合物。浓缩区有孔径很大 比表面很小的惰性二氧化硅组成。惰性二氧化硅无分离作用,样 品点于浓缩区展开至两相之间时可以浓缩成很窄的点或带,经高 效薄层色谱可以达到有效分离
手性配体交换色谱固定相 该拆分法是利用手性配体与对映异构体之间形成具有不同稳定性铜 复合物进行色谱分离。当手性配体为羟基取代脯氨酸衍生物，待 拆分对映体为氨基酸时复合物以离子键吸附于硅胶疏水表面。手 性配体一般以氨基酸衍生物制成。如将RPC18薄层板用N，N— 二正丙基—L—丙氨酸铜复合物的缓冲溶液处理，制成的手性薄层板 成功分离了丹酰氨基酸各对对映体。 以多聚L—丙氨酸酰胺铜复合物的反相手性薄层板成功分离类似氨基 酸异构体。 市售手性薄层板： 具有浓缩区的RPC18薄层板，硅胶平均直径5微米， 所用手性配体为羟脯氨酸衍生物的铜复合物。浓缩区有孔径很大， 比表面很小的惰性二氧化硅组成。惰性二氧化硅无分离作用，样 品点于浓缩区展开至两相之间时可以浓缩成很窄的点或带，经高 效薄层色谱可以达到有效分离
丹酰氨基酸对映体分离实例 薄层板制备 RPC18F254TCL板(5cm×20cm)和RPC18F25 HPTCL (10αm×10αm),置于0.3moL醋酸钠/乙腈(70/30)溶液中 醋酸调节PH=7,展开后,吹去溶液,。再浸渍于含醋酸铜(0.3 mmo/L)和聚合L—苯丙酸酰胺(mmo/L)的水/乙腈(10:90) 溶液中至少1小时,取出、晾干备用 流动相:水/乙腈 点样:1mmoL浓度。 ■检出:UV360nm 结果:L—异构体的R值较小,与吸附剂作用较大。 聚合手性配体的制备和鉴定:乙二醇一二(2,3环氧丙烷)醚 (或乙二醇二缩水甘油醚 ether glycol diglycidyl ether)2mL (12.8mmo)和L—苯丙酸酰胺1.5g(9.1mmo)溶于3m.L甲醇中, 室温搅拌可以完成反应。油状产物溶解于甲醇,作为样品进行分 析
丹酰氨基酸对映体分离实例 ◼ 薄层板制备RPC18 F254TCL板（5cm × 20cm)和RPC18 F25HPTCL （10cm × 10cm)，置于0.3mol/L醋酸钠/乙腈（70/30）溶液中， 醋酸调节PH=7，展开后，吹去溶液，。再浸渍于含醋酸铜（0.3 m mol/L）和聚合L—苯丙酸酰胺（m mol/L）的水/乙腈（10：90） 溶液中至少1小时，取出、晾干备用。 ◼ 流动相：水/乙腈。 ◼ 点样：1mmoL/L浓度。 ◼ 检出：UV360nm ◼ 结果：L—异构体的Rf值较小，与吸附剂作用较大。 ◼ 聚合手性配体的制备和鉴定：乙二醇—二（2，3—环氧丙烷）醚 （或乙二醇二缩水甘油醚 ether glycol diglycidyl ether) 2 m.L. (12.8mmol)和 L—苯丙酸酰胺1.5g(9.1mmol)溶于3m.L甲醇中， 室温搅拌可以完成反应。油状产物溶解于甲醇，作为样品进行分 析
色谱柱为So- Sil TSK柱(300mm×75mm),简称额波长254nm, 流动相为0.1mo/L磷酸缓冲溶液,(PH3.5)和甲醇(9:1); 流速:1mL/min H2N H3C CH HO
◼ 色谱柱为Sio-Sil TSK柱(300mm ×75mm)，简称额波长254nm， 流动相为 0.1mol/L磷酸缓冲溶液，（PH 3.5）和甲醇（9：1）； ◼ 流速： 1mL /min。 H2 N O NH2 O O O O N O NH2 H3C O HO O HO O OH O CH3 OH
酸、碱手性试剂浸渍型手性固定相 薄层板简单的用一光活性的酸、碱或其它手性试剂浸渍,亦可制成手性 固定相。对映异构体分子在色谱过程中与薄层板上的手性试剂形成非对 映体而分离。 应用实例:L—精氨酸浸渍硅胶薄层分离布洛芬。 薄层板制备:硅胶G50g加入0.5%—精氨酸溶液100mL,匀浆铺于玻璃 板(20cm×20cm×0.5mm)上。L—精氨酸pI为8,加几滴醋酸维持PH 低于等电点。使氨基酸处于阳离子型,60度干燥过夜,备用。 样品溶液的制备:π0%乙醇为溶剂,配制1mmoL的布洛芬对映体溶液, 点样量为10uL。 维和二维展开:一维展开,对映体布洛芬和(+)布洛芬点在同一块 板上:二维展开,首先将对映体溶液点在L—精氨酸浸渍过的板上,第 次展开后(+)将布洛芬溶液点在前原斑点处。也可以将两种溶液点在 两块板上,在同样的条件下二维展开
酸、碱手性试剂浸渍型手性固定相 ◼ 薄层板简单的用一光活性的酸、碱或其它手性试剂浸渍，亦可制成手性 固定相。对映异构体分子在色谱过程中与薄层板上的手性试剂形成非对 映体而分离。 ◼ 应用实例：L—精氨酸浸渍硅胶薄层分离布洛芬。 ◼ 薄层板制备：硅胶G 50g加入0.5%L—精氨酸溶液100mL，匀浆铺于玻璃 板（20cm× 20cm× 0.5mm)上。L—精氨酸pI为8，加几滴醋酸维持PH 低于等电点。使氨基酸处于阳离子型，60度干燥过夜，备用。 ◼ 样品溶液的制备：70%乙醇为溶剂，配制1mmol/L的布洛芬对映体溶液， 点样量为10uL。 ◼ 一维和二维展开：一维展开，对映体布洛芬和（+）布洛芬点在同一块 板上；二维展开，首先将对映体溶液点在L—精氨酸浸渍过的板上，第一 次展开后（+）将布洛芬溶液点在前原斑点处。也可以将两种溶液点在 两块板上，在同样的条件下二维展开
展开剂:乙醇/甲醇/水(5/1/1)。玻璃缸温度32度(正负2度)。 展开时间30min,溶剂蒸汽预饱和15min 显色:展开结束,薄层板与60度干燥5min,置于碘蒸汽中,取出, 挥发碘。用稀盐酸喷洒,加热15min,放冷,用0.2%茚三酮显色。 维展开时间15min,二维展开时间20min 碘的作用是定位(有两个展开点) 茚三酮指示两个点均有精氨酸存在
◼ 展开剂：乙醇/甲醇/水（5/1/1）。玻璃缸温度32 度（正负2度）。 ◼ 展开时间30min,溶剂蒸汽预饱和15min。 ◼ 显色：展开结束，薄层板与60度干燥5min，置于碘蒸汽中，取出， 挥发碘。用稀盐酸喷洒，加热15min,放冷，用0.2%茚三酮显色。 ◼ 一维展开时间15min，二维展开时间20min。 ◼ 碘的作用是定位（有两个展开点）。 ◼ 茚三酮指示两个点均有精氨酸存在
手性流动相拆分法 在非手性薄层板上用含有手性试剂的流动相(CMA)的TLC法进 行对映异构体的拆分更方便。 添加手性离子对试剂利用对映体可与流动相中的手性离子对试 剂结合,形成非对映体的离子对,即可实现在非手性薄层板上分 拆对映体。 DIOLE2s4 HPTCL法拆分β—肾上腺素受体阻滞剂普萘洛尔和烯丙 洛尔的正相TCL法 色谱条件 薄层板: Lichrosorb diole24 HPTCL10m×10cm 流动相:二氯甲烷中有5mmol/LN苄氧基羰基甘氨酰基_L 脯氨酸(N- carbobenzoxy glycyl- L-proline zgp)和0.4mmol/L 的乙醇胺
手性流动相拆分法 ◼ 在非手性薄层板上用含有手性试剂的流动相（CMA）的TLC法进 行对映异构体的拆分更方便。 ◼ 添加手性离子对试剂 利用对映体可与流动相中的手性离子对试 剂结合，形成非对映体的离子对，即可实现在非手性薄层板上分 拆对映体。 ◼ DIOLF254 HPTCL法拆分β —肾上腺素受体阻滞剂普萘洛尔和烯丙 洛尔的正相TCL法。 ◼ 色谱条件 ◼ 薄层板：Lichrosorb DIOLF254 HPTCL 10cm× 10cm. ◼ 流动相：二氯甲烷中有5m mol/LN—苄氧基羰基—甘氨酰基—L— 脯氨酸（N-carbobenzoxy glycyl—L-proline ZGP)和0.4m mol/L 的乙醇胺