在人和动物周围血中，存在形态不同、功能各异的多种血细胞。它们是红细胞、粒细胞、单核细胞、淋巴细胞及血小板。其生命亦各不同，如人红细胞生命周期约120天，粒细胞约20～62小时，血小板约为5～10天，单核细胞存在于骨髓者约为50天，存在于周围血者可超过200天，而淋巴细胞可存活数月至数年。这些血细胞可不断死亡与新生以维持血细胞的动态平衡异常，可使血细胞数量和质量发生改变，将会引起名种血液病或免疫性疾病。各种血细胞都起源于共同的祖先细胞，即造血干细胞。第一节造血干细胞的特性一、造血干细胞的起源造血干细胞（hemopoietic stemcell,HSC）是存在于造血组织中的一群原始造血细胞，它不是组织固定细胞，可存在于造血组织及血液中。造血干细胞在人胚胎2周时可出现于卵黄囊，第4周开始转移至胚肝，妊娠5个月后，骨髓开始造血，出生后骨髓成为干细胞的主要来源。在造血组织中，所占比例甚少，如在小鼠骨髓中105核细胞中的有10个，在脾中105有核细胞中只有0.2个。二、造血干细胞的形态干细胞是一种嗜碱性独核细胞，其大小约为8um，呈圆形，胞核为圆形或肾形，胞核较大，具有2个核仁，染色质细质而分散，胞浆呈浅蓝色不带颗粒，在形态上与小淋巴细胞极其相似，但淋巴细胞体积较小，染色质浓染，核仁不明显且有细胞器。因此很难用形态学识别干细胞，并与其它独核细胞相区别。造血干细胞可包括三级分化水平，即多能干细胞（pleuripotentstemcell），定向干细胞（Committedstemcell）及其成熟的子代细胞。关于对造血干细胞的功能分析，长期以来仅限于对小鼠干细胞的研究，而对人干细胞的存在只是来自间接证据，因为不能在人体内进行如鼠体内的功能分析法。70年代以来，由于建立了新的体外细胞培养技术，大大促进了对人干细胞的直接研究。三、造血干细胞的表面标志由于造血组织中造血干细胞在形态学方面无法与其它单核细胞区别，而且数量极少，这为造血干细胞的分离纯化并对其功能分析和分化的研究造成极大困难。近年来由于单克隆抗体技术的进步，流式细胞仪（FACS）的应用，以及对小鼠和人造血干细胞表面标志的研究，取得了很大进展，为造血细胞的分离纯化及鉴定创造了条件。1.Thy-1与丝裂原（wheatgermagglutinin,WGA）Visseer等发现小鼠骨髓中造血干细胞对WGA有高亲和性。利用这一特性，应用FACS自骨髓中分离造血干细胞应及核系Mac-1等谱系抗原与WGA反应性相结合：即可自骨髓中Lin-/WGA+细胞群中分离造血干细胞，也获得良好结果。也有学者发现正常小鼠骨髓细胞中，也能表达低密度Thy-1抗原（Thy-ll。）。如与上述标志组合，即自骨髓Thy-11。Lin-,WGA+细胞群中，分离造血干细胞，可用于对造血细胞的功能分析
在人和动物周围血中，存在形态不同、功能各异的多种血细胞。它们是红细胞、粒细胞、单核细胞、淋 巴细胞及血小板。其生命亦各不同，如人红细胞生命周期约120天，粒细胞约20～62小时，血小板约为5～10 天，单核细胞存在于骨髓者约为50天，存在于周围血者可超过200天，而淋巴细胞可存活数月至数年。这些 血细胞可不断死亡与新生以维持血细胞的动态平衡异常，可使血细胞数量和质量发生改变，将会引起名种血 液病或免疫性疾病。各种血细胞都起源于共同的祖先细胞，即造血干细胞。 第一节 造血干细胞的特性 一、造血干细胞的起源 造血干细胞（hemopoietic stem cell,HSC）是存在于造血组织中的一群原始造血细胞，它不是组织固定细 胞，可存在于造血组织及血液中。造血干细胞在人胚胎2周时可出现于卵黄囊，第4周开始转移至胚肝，妊娠 5个月后，骨髓开始造血，出生后骨髓成为干细胞的主要来源。在造血组织中，所占比例甚少，如在小鼠骨 髓中105核细胞中的有10个，在脾中105有核细胞中只有0.2个。 二、造血干细胞的形态 干细胞是一种嗜碱性独核细胞，其大小约为8μm，呈圆形，胞核为圆形或肾形，胞核较大，具有2个核 仁，染色质细质而分散，胞浆呈浅蓝色不带颗粒，在形态上与小淋巴细胞极其相似，但淋巴细胞体积较小， 染色质浓染，核仁不明显且有细胞器。因此很难用形态学识别干细胞，并与其它独核细胞相区别。 造血干细胞可包括三级分化水平，即多能干细胞（pleuripotent stem cell），定向干细胞（Committed stem cell）及其成熟的子代细胞。 关于对造血干细胞的功能分析，长期以来仅限于对小鼠干细胞的研究，而对人干细胞的存在只是来自间 接证据，因为不能在人体内进行如鼠体内的功能分析法。70年代以来，由于建立了新的体外细胞培养技术， 大大促进了对人干细胞的直接研究。 三、造血干细胞的表面标志 由于造血组织中造血干细胞在形态学方面无法与其它单核细胞区别，而且数量极少，这为造血干细胞的 分离纯化并对其功能分析和分化的研究造成极大困难。 近年来由于单克隆抗体技术的进步，流式细胞仪（FACS）的应用，以及对小鼠和人造血干细胞表面标 志的研究，取得了很大进展，为造血细胞的分离纯化及鉴定创造了条件。 1．Thy-1与丝裂原（wheat germ agglutinin,WGA）Visseer等发现小鼠骨髓中造血干细胞对WGA有高亲和 性。利用这一特性，应用FACS自骨髓中分离造血干细胞应及核系Mac-1等谱系抗原与WGA反应性相结合， 即可自骨髓中Lin-/WGA+细胞群中分离造血干细胞，也获得良好结果。 也有学者发现正常小鼠骨髓细胞中，也能表达低密度Thy-1抗原（Thy-11。）。如与上述标志组合，即 自骨髓Thy-11。Lin-,WGA+细胞群中，分离造血干细胞，可用于对造血细胞的功能分析
2.干细胞抗原（stemcellantigen-1,Sca-1）有学者制备一种抗原前T细胞杂交瘤的单克隆抗体，用这种单抗检出的抗原分子称为干细胞抗原-1（Sca-1）。其后有人自骨髓中Thy-1lo、Lin-、Sca-1+细胞群中，可分离纯人造血干细胞。3.原癌基因（c-kit）最近证明造血干细胞与c-kit基因密切相关。C-kit可编码一种穿膜酪氨酸激酶受体分子。应用单克隆抗体证明此分子可存在于造血干细胞膜上，其后证明它的配体分子是造血干细胞因子（stemcellfactor,SCF）。它是信号传导分子，对造血干细胞的分化具有重要作用。目前，小鼠多能干细胞表面分子标志可视为Thy-llo、WGA+、c-kit+、Lin-。c-kit分子可高频率表达于多能干细胞表面，但骨髓中c-kit+细胞可分化为各种血细胞，而胸腺中c-kit细胞可分化为淋巴细胞，不能分化为髓系细胞，所以胸腺内c-kit+细胞，可能是淋巴样干细胞（表7-1）。表7-1胸腺及骨髓中c-kit+细胞分化机制胸腺c-kit骨髓c-kit+粒细胞系一+单核细胞系-+一红细胞系++T细胞++B细胞4.CD34对人体造血干细胞表面标志的研究，是用单克隆抗体CD34证明的。CD34单克隆抗体检测的抗原即为CD34分子。自人骨髓细胞中应用FACS可分离纯化CD34+细胞群，如与造血因子共同体外培养可获得含有各种血细胞的混合集落，所以CD34+细胞为骨髓中造血干细胞，CD34抗原可视为骨髓造血细胞标志之一。第二节造血于细胞的分化一、多能干细胞多能干细胞是由Till和McCulloch等在60年代初，应用脾集落形成细胞定量法，首先在小鼠体内证明的，他们给经射线照射的小鼠输入同系鼠骨髓细胞，在10～14天后在脾内形成可见的结节，它是由单一骨髓细胞发育分化而成的细胞集落，称之为脾集落形成单位（colonyformingunit-spleen,CFU-S）。集落数与输入的细胞数成正比，它可分化发育为红细胞、粒细胞及巨核细胞。CFU-S长期以来用体内集落法进行检测，在70年代后Johnson和Metcalf等应用鼠胎肝细胞体外培养法，证明具有CFU-S性质的干细胞可在体外培养成功，这是在研究干细胞方法学上的重大改进。其后，Haral等用小鼠骨髓细胞在甲基纤维素中加入红细胞生成素（erythropoietin,EPO）及脾细胞培养上清，进行体外培养，可形成含有红细胞、巨核细胞以及巨噬细胞的集落，称为混合集落形成单位（CFU-Mix）。其后，小林登等在80年代用人骨髓细胞亦报告CFU-Mix培养成功。即由多能干细胞可进一步分化为
2．干细胞抗原（stemcellantigen-1,Sca-1） 有学者制备一种抗原前T细胞杂交瘤的单克隆抗体，用这种 单抗检出的抗原分子称为干细胞抗原-1（Sca-1）。其后有人自骨髓中Thy-1Io、Lin-、Sca-1+细胞群中，可分 离纯人造血干细胞。 3．原癌基因（c-kit） 最近证明造血干细胞与c-kit基因密切相关。C-kit可编码一种穿膜酪氨酸激酶受体 分子。应用单克隆抗体证明此分子可存在于造血干细胞膜上，其后证明它的配体分子是造血干细胞因子 （stem cell factor,SCF）。它是信号传导分子，对造血干细胞的分化具有重要作用。目前，小鼠多能干细胞 表面分子标志可视为Thy-1Io、WGA+、c-kit+、Lin-。 c-kit分子可高频率表达于多能干细胞表面,但骨髓中c-kit+细胞可分化为各种血细胞，而胸腺中c-kit细胞 可分化为淋巴细胞，不能分化为髓系细胞，所以胸腺内c-kit+细胞，可能是淋巴样干细胞（表7-1）。 表7-1 胸腺及骨髓中c-kit+细胞分化机制 胸腺c-kit 骨髓c-kit 粒细胞系 － + 单核细胞系 － + 红细胞系 － + T细胞 + + B细胞 + + 4．CD34 对人体造血干细胞表面标志的研究，是用单克隆抗体CD34证明的。CD34单克隆抗体检测的抗 原即为CD34分子。自人骨髓细胞中应用FACS可分离纯化CD34+细胞群，如与造血因子共同体外培养可获得 含有各种血细胞的混合集落，所以CD34+细胞为骨髓中造血干细胞，CD34抗原可视为骨髓造血细胞标志之 一。 第二节 造血干细胞的分化 一、多能干细胞 多能干细胞是由Till和McCulloch等在60年代初，应用脾集落形成细胞定量法，首先在小鼠体内证明的。 他们给经射线照射的小鼠输入同系鼠骨髓细胞，在10～14天后在脾内形成可见的结节，它是由单一骨髓细胞 发育分化而成的细胞集落，称之为脾集落形成单位（colony forming unit-spleen,CFU-S）。集落数与输入的细 胞数成正比，它可分化发育为红细胞、粒细胞及巨核细胞。CFU-S长期以来用体内集落法进行检测。 在70年代后Johnson和Metcalf等应用鼠胎肝细胞体外培养法，证明具有CFU-S性质的干细胞可在体外培 养成功，这是在研究干细胞方法学上的重大改进。 其后，Haral等用小鼠骨髓细胞在甲基纤维素中加入红细胞生成素（erythropoietin,EPO）及脾细胞培养 上清，进行体外培养，可形成含有红细胞、巨核细胞以及巨噬细胞的集落，称为混合集落形成单位（CFUMix）。其后，小林登等在80年代用人骨髓细胞亦报告CFU-Mix培养成功。即由多能干细胞可进一步分化为
定向髓系多能干细胞及淋巴系干细胞。淋巴系干细胞是T和B细胞的共同祖先细胞，但目前尚不能用脾集落实验证明其存在。二、单能干细胞单能干细胞是一类具有向特定细胞系分化能力的干细胞，也称为祖细胞（progenitor）。如进行体内移植不能形成脾集落，但在一定造血因子的存在下，可在体外培养并形成细胞集落，称为代表外培养集落，称为体外培养集落形成单位（colonyformingunit-culture,CFU-C），因此它与多能干细胞不同，它可包括分化为红细胞的红系干细胞，可分化为粒细胞和单核细胞的粒、单核细胞干细胞系及可分化为血小板的巨核干细胞系。1.红系干细胞应用骨髓细胞加甲基纤维素在大量EPO存在下，进行体外培养可产生大型红细胞集落，可含有1000个以上的细胞，形成如爆发火花样的集落，称此干细胞为爆式红细胞集落形成细胞（burstuniterythoid，BFU-E）。如用小剂量EPO则产生小型集落，由8～50个细胞组成，称此干细胞为红细胞系集落形成细胞（colonyformingunit-E,CFU-E）BFU-E是更早期的红系干细胞，而CFU-E则为较晚期的红系干细胞。2.粒细胞-单核细胞系干细胞此系细胞在功能上与BFU-E或CFU-E属同级干细胞。应用软琼脂法将骨髓细胞进行体外培养，在集落刺激因子（CFS）存在下，可产生粒细胞和单核细胞集落，称此集落形成细胞为体外培养集落形成细胞（colonyformingunti-culture,CFU-C）。将CFU-C进行体内移植不能产生脾集落，所以CFU-D不具有CFU-S的特性，仅具有前驱细胞和前驱单核细胞的特征。3.巨核干细胞系亦称巨核细胞集落形成细胞（colonyformingunti-megakaryocyte,CFU-M），Metcalf及其分泌的细胞因子和细胞外基质（extra-cellularmatrix,ECM）组成，因此对造血干细胞发育分化过程的体外研究，有很大局限性，它不一定能真实反映体内情况，分析实验结果时，必须注意这种局限性。自前仍有很多关于造血于细胞发育分化的问题有待闻明。表7-2血细胞的分化与成熟多能定向干细胞单能定向干细胞成熟子代细胞红系干细胞红细胞髓系干细胞粒、单核系干细胞粒细胞/单核细胞多能干细胞巨核干细胞血小板前驱B细胞B细胞淋巴系干细胞T细胞前驱T细胞
定向髓系多能干细胞及淋巴系干细胞。淋巴系干细胞是T和B细胞的共同祖先细胞，但目前尚不能用脾集落 实验证明其存在。 二、单能干细胞 单能干细胞是一类具有向特定细胞系分化能力的干细胞，也称为祖细胞（progenitor）。如进行体内移 植不能形成脾集落，但在一定造血因子的存在下，可在体外培养并形成细胞集落，称为代表外培养集落，称 为体外培养集落形成单位（colony forming unit-culture,CFU-C），因此它与多能干细胞不同，它可包括分化 为红细胞的红系干细胞，可分化为粒细胞和单核细胞的粒、单核细胞干细胞系及可分化为血小板的巨核干细 胞系。 1．红系干细胞应用骨髓细胞加甲基纤维素在大量EPO存在下，进行体外培养可产生大型红细胞集落， 可含有1000个以上的细胞，形成如爆发火花样的集落，称此干细胞为爆式红细胞集落形成细胞（burstuniterythoid ,BFU-E）。如用小剂量EPO则产生小型集落，由8～50个细胞组成，称此干细胞为红细胞系集落形 成细胞（colony forming unit-E,CFU-E）BFU-E是更早期的红系干细胞，而CFU-E则为较晚期的红系干细胞。 2．粒细胞-单核细胞系干细胞 此系细胞在功能上与BFU-E或CFU-E属同级干细胞。应用软琼脂法将骨髓 细胞进行体外培养，在集落刺激因子（CFS）存在下，可产生粒细胞和单核细胞集落，称此集落形成细胞为 体外培养集落形成细胞（colonyformingunti-culture,CFU-C）。将CFU-C进行体内移植不能产生脾集落，所以 CFU-D不具有CFU-S的特性，仅具有前驱细胞和前驱单核细胞的特征。 3.巨核干细胞系亦称巨核细胞集落形成细胞（colonyforming unti-megakaryocyte,CFU-M），Metcalf及其 分泌的细胞因子和细胞外基质（extra-cellular matrix,ECM）组成，因此对造血干细胞发育分化过程的体外研 究，有很大局限性，它不一定能真实反映体内情况，分析实验结果时，必须注意这种局限性。目前仍有很多 关于造血干细胞发育分化的问题有待阐明。 表7-2 血细胞的分化与成熟 多能干细胞 多能定向干细胞 单能定向干细胞 成熟子代细胞 髓系干细胞 红系干细胞 粒、单核系干细胞 巨核干细胞 红细胞 粒细胞/单核细胞 血小板 淋巴系干细胞 前驱B细胞 前驱T细胞 B细胞 T细胞
13GMCSFG-LSFGMCSFCCSEGIU-G中华组服GM-CSEMCSFCFU-CM1单CM CSFCFU-M瑾调热M-CSF1.3GAI-CSEEpo红阳农红针组购LSCFBFU-ECFU-EIL-3M-31-013-31L5GV-CSFL-sTpolL-lC分比题CFU-MCS血小板造血巨核作OM-CSF干海跑干油跑IL-311-白我雨生CU-EO塔佳在院1L.-ACFU-S婚减性纹妞脚1.-211-110-1iL-371L-2CFUTLpr-T皮熟T细胞(pro-T)11.-7分化11-3UG巴羊干细购Hml批软利超聚细聘图7一1造血干细胞分化与造血因子第三节造血干细胞与淋巴细胞的发生由于用脾集落法未能证明淋巴细胞的发生，所以造血干细胞与淋巴细胞在发生学的关系，直到60年代Wu等建立了放射诱导染色体标记技术后才逐步得到阐明。Wu等用照射诱导小鼠骨髓干细胞染色体发生一定程度的畸变，做为标记，但又不影响其细胞分裂。将这种细胞输入另一照射小鼠体内后，可以重建其造血和免疫功能
图7－1 造血干细胞分化与造血因子 第三节 造血干细胞与淋巴细胞的发生 由于用脾集落法未能证明淋巴细胞的发生，所以造血干细胞与淋巴细胞在发生学的关系，直到60年代 Wu等建立了放射诱导染色体标记技术后才逐步得到阐明。 Wu等用照射诱导小鼠骨髓干细胞染色体发生一定程度的畸变，做为标记，但又不影响其细胞分裂。将 这种细胞输入另一照射小鼠体内后，可以重建其造血和免疫功能
由于它们具有特殊的畸形染色体，因此在照射宿主体内，任何二种细胞只要它们有共同的标记染体，应表明它们是来自同一干细胞。由于在照射诱导条件下，骨髓细胞中分化程度不同的干细胞，可以产生不同类型的染色体畸变，所以通过核型分析就能检查不同细胞的共同前体细胞。Abramon等在70年代，用上述方法，发现在受体小鼠骨髓细胞、脾集落形成细胞以及经植物血凝素（PHA）和脂多糖（LPS）等丝裂原刺激的体外培养脾细胞中，都发现了一种共同的标记染色体，这证明它们都是从供体骨髓中的多能干细胞分化而来，从而有力的证明了无论是髓系干细胞和淋巴细胞，都是来自共同的造血干细胞。目前已证明在小鼠骨髓中存在有前驱T细胞（pro-T）和前驱B细胞（pro-B）。ProT进入胸腺后可发育分化为成熟T细胞，pro-B则在骨髓内发育分化为成熟B细胞。但尚未直接证明在小鼠骨髓中存在有淋巴系干细胞。虽然如此，多数学者认为淋巴系干细胞可能是存在的。其检测困难可能是由于数量太少，或是由于对照射过于敏感，在照射过程中被选择地排除了。近年的实验证明。在小鼠骨髓中c-kit+细胞可分化为各种血细胞及T和B细胞，但如将胸腺内c-kit+细胞移植于小鼠体内，则丧失其分化为髓系细胞的能力，仍能分化为T和B细胞。提示这种胸腺c-kit细胞可能是淋巴系干细胞
由于它们具有特殊的畸形染色体，因此在照射宿主体内，任何二种细胞只要它们有共同的标记染体，应 表明它们是来自同一干细胞。由于在照射诱导条件下，骨髓细胞中分化程度不同的干细胞，可以产生不同类 型的染色体畸变，所以通过核型分析就能检查不同细胞的共同前体细胞。 Abramon等在70年代，用上述方法，发现在受体小鼠骨髓细胞、脾集落形成细胞以及经植物血凝素 （PHA）和脂多糖（LPS）等丝裂原刺激的体外培养脾细胞中，都发现了一种共同的标记染色体，这证明它 们都是从供体骨髓中的多能干细胞分化而来，从而有力的证明了无论是髓系干细胞和淋巴细胞，都是来自共 同的造血干细胞。 目前已证明在小鼠骨髓中存在有前驱T细胞（pro-T）和前驱B细胞（pro-B）。ProT进入胸腺后可发育分 化为成熟T细胞，pro-B则在骨髓内发育分化为成熟B细胞。但尚未直接证明在小鼠骨髓中存在有淋巴系干细 胞。虽然如此，多数学者认为淋巴系干细胞可能是存在的。其检测困难可能是由于数量太少，或是由于对照 射过于敏感，在照射过程中被选择地排除了。 近年的实验证明。在小鼠骨髓中c-kit+细胞可分化为各种血细胞及T和B细胞，但如将胸腺内c-kit+细胞 移植于小鼠体内，则丧失其分化为髓系细胞的能力，仍能分化为T和B细胞。提示这种胸腺c-kit细胞可能是 淋巴系干细胞