第八章 食品氨基酸总量的测定 【教学目标】： 1.掌握氨基酸、含氮量等的概念和相关知识； 2.掌握氨基酸液氮的测定方法和操作技能； 3.了解比色法的原理，基本方法及仪器使用和维护的知识。 一、甲醛滴定法 1 原理 氨基酸具有酸性的一 COOH 基和碱性的一 N H2 基。它们互相作用使氨基酸成为中性 的内盐。加入甲醛溶液时，一 N H2 基与甲醛结合，其碱性消失。这样就可能用碱来滴定 一 COOH 基，并用间接的方法测定氨基酸的量。用碱完全中和一 COOH 基时的 pH 值为 8.4~9.2。 2 试剂 （1）40%中性甲醛：用百里酚酞作指示剂，将甲醋用碱溶液中和至淡蓝色。 （2）0.1%百里酚酞乙醇溶液。 （3）0.1N 氢氧化钠标准溶液。 3 操作方法 称取粉碎样品 5.00~10.00g 或液体样品 5~10mL,置于烧杯中，加入 50mL 水和活性碳 约 5g，加热煮沸，过滤，用 30~40mL 热水洗涤活性碳，收集滤液于三角瓶中，加入 3 滴 百里酚酞指示剂，用 0.1N 氢氧化钠标准溶液滴定至淡蓝色。加入中性甲醛 20mL，摇匀， 静置 1min，此时蓝色已经消失，再用 0.1N 氢氧化钠标准溶液滴定至淡蓝色。记录第二次 滴定时消耗的碱液毫升数。 4 计算 氨基酸态氮（%）= 100 0.014 W N V 式中：N-氢氧化钠标准溶液的当量浓度； V-氢氧化钠钠标准溶液的消耗量（第二次）（g）; W-样品溶液相当于样品的量（g）; 0．014-氮的毫克当量。 5 说明 （1）用碱性溶液第一次滴定时，用 pH 计控制滴定到溶液 pH7.5 后，然后加入中性甲醛 继续用碱液滴定，又用 pH 计控制用碱液滴定样液至 pH9.2 为终点较为正确。 （2）取相同 2 份样品溶液，其中 1 份加入中性红指示剂 3 滴，用 0.1N 氢氧化钠标准溶液 滴定至琥珀色为终点，另 1 份加入百里酚酞指示剂 3 滴和中性甲醛 20mL，静置 1min 后， 用 0.1N 氢氧化钠标准溶液滴定至淡蓝色。按下列、公式计算： 100 ( ) 0.014 (%) 2 1 − = = W N V V 氨基酸 X 式中： V2 -用百里酚蓝作指示剂时消耗氢氧化钠量（mL）； V1 -用中性红作指示剂时消耗氢氧化钠量（mL）； N -标准氢氧化钠溶液的当量浓度； W-样品重量（g）； 0.014-氮的毫克当量。 以上方法更为准确些。中性红指 0.1%中性红、50%乙醇溶液。 （3）用 pH 计控制滴定终点，可以解决样液色深问题。 二、茚三酮比色法 1 原理 氨基酸在一定的 pH 条件下与茚三酮起反应，生成蓝紫色化合物，可比色定量。最近 的研究指示，这种颜色不是由于单一物质，而是由于好几种有色物质，有些要视所用氨基
第八章 食品氨基酸总量的测定 【教学目标】： 1.掌握氨基酸、含氮量等的概念和相关知识； 2.掌握氨基酸液氮的测定方法和操作技能； 3.了解比色法的原理，基本方法及仪器使用和维护的知识。 一、甲醛滴定法 1 原理 氨基酸具有酸性的一 COOH 基和碱性的一 N H2 基。它们互相作用使氨基酸成为中性 的内盐。加入甲醛溶液时，一 N H2 基与甲醛结合，其碱性消失。这样就可能用碱来滴定 一 COOH 基，并用间接的方法测定氨基酸的量。用碱完全中和一 COOH 基时的 pH 值为 8.4~9.2。 2 试剂 （1）40%中性甲醛：用百里酚酞作指示剂，将甲醋用碱溶液中和至淡蓝色。 （2）0.1%百里酚酞乙醇溶液。 （3）0.1N 氢氧化钠标准溶液。 3 操作方法 称取粉碎样品 5.00~10.00g 或液体样品 5~10mL,置于烧杯中，加入 50mL 水和活性碳 约 5g，加热煮沸，过滤，用 30~40mL 热水洗涤活性碳，收集滤液于三角瓶中，加入 3 滴 百里酚酞指示剂，用 0.1N 氢氧化钠标准溶液滴定至淡蓝色。加入中性甲醛 20mL，摇匀， 静置 1min，此时蓝色已经消失，再用 0.1N 氢氧化钠标准溶液滴定至淡蓝色。记录第二次 滴定时消耗的碱液毫升数。 4 计算 氨基酸态氮（%）= 100 0.014 W N V 式中：N-氢氧化钠标准溶液的当量浓度； V-氢氧化钠钠标准溶液的消耗量（第二次）（g）; W-样品溶液相当于样品的量（g）; 0．014-氮的毫克当量。 5 说明 （1）用碱性溶液第一次滴定时，用 pH 计控制滴定到溶液 pH7.5 后，然后加入中性甲醛 继续用碱液滴定，又用 pH 计控制用碱液滴定样液至 pH9.2 为终点较为正确。 （2）取相同 2 份样品溶液，其中 1 份加入中性红指示剂 3 滴，用 0.1N 氢氧化钠标准溶液 滴定至琥珀色为终点，另 1 份加入百里酚酞指示剂 3 滴和中性甲醛 20mL，静置 1min 后， 用 0.1N 氢氧化钠标准溶液滴定至淡蓝色。按下列、公式计算： 100 ( ) 0.014 (%) 2 1 − = = W N V V 氨基酸 X 式中： V2 -用百里酚蓝作指示剂时消耗氢氧化钠量（mL）； V1 -用中性红作指示剂时消耗氢氧化钠量（mL）； N -标准氢氧化钠溶液的当量浓度； W-样品重量（g）； 0.014-氮的毫克当量。 以上方法更为准确些。中性红指 0.1%中性红、50%乙醇溶液。 （3）用 pH 计控制滴定终点，可以解决样液色深问题。 二、茚三酮比色法 1 原理 氨基酸在一定的 pH 条件下与茚三酮起反应，生成蓝紫色化合物，可比色定量。最近 的研究指示，这种颜色不是由于单一物质，而是由于好几种有色物质，有些要视所用氨基
酸的本性而定，但在一切事例中，都可观察到形成紫色的双一 1，3——二酮茚； 2 试剂 （1）茚三酮：分析纯。如包装不良变红色时，应按下法处理。将 5g 茚三酮溶于 20mL 热 水中，加入 0.5g 活性碳，轻轻摇动，30min 后过滤。滤液置冰箱中过夜，即出现蓝色结 晶。过滤，用 1mL 冷水洗涤结晶。然后置于干燥器中干燥，装瓶保存。 （2）2%茚三酮溶液：称取茚三酮 1.0g，溶于 25mL 热水中，加入 40mg 氯化亚锡 （ SnCI2 H2O ）拌匀（作防腐剂），过滤，滤液置冷暗处过液，定容至 25mL。 （3）磷酸盐缓冲液（pH8.04）:1/15moL/L 磷酸二氢钾 5mL 与 1/15moL/L 磷酸氢二钠 95mL 混匀[1/15moL/L 磷酸二氢钾液：取本品 9.070g 溶于水成 1000mL；1/15moL/L 磷酸氢二钠 液：取磷酸氢二钠（ Na2HPO4 12H2O ）23.876g 溶于水成 1000mL]。 （4）氨基酸标准液（ 20g / ml ）：称取纯粹干燥的氨基酸（例如白氨酸）0.2000g,用水 溶解并定容至 100mL,摇匀。吸取此液 10mL 于容量瓶中加水至 100mL，即得（ 20g / ml ） 标准液。 3 操作方法 （1）标准曲线绘制 精确吸取氨基酸标准液 0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5.mL（相当于 0、100、200、 300、400、500.g 氨基酸）分置于数个 25mL 容量瓶中，加水补充至容积各为 4.0mL, 然后各加入茚三酮和缓冲液各 1mL，摇匀，置水浴中加热 15min，取出，迅速冷至室温， 加水至刻度，摇匀。静置 15min 后，在 570nm 波长下测定光密度，绘制标准曲线。 （2）样品测定 移取澄清的样品溶液 1~4mL（样液制备方法同单指示剂法），按标准曲线制作步骤操 作，测定光密度，并扣除样液空白值后，从标准曲线上查得氨基酸微克数。按下式计算样 品的氨基酸含量（以 某种氨基酸计）； 100 1000 ( %) = W G 氨基酸总量 mg 式中：G-从标准曲线上查得的氨基酸的量（ g ）； W-测定的样品溶液相当于样品的量（g）
酸的本性而定，但在一切事例中，都可观察到形成紫色的双一 1，3——二酮茚； 2 试剂 （1）茚三酮：分析纯。如包装不良变红色时，应按下法处理。将 5g 茚三酮溶于 20mL 热 水中，加入 0.5g 活性碳，轻轻摇动，30min 后过滤。滤液置冰箱中过夜，即出现蓝色结 晶。过滤，用 1mL 冷水洗涤结晶。然后置于干燥器中干燥，装瓶保存。 （2）2%茚三酮溶液：称取茚三酮 1.0g，溶于 25mL 热水中，加入 40mg 氯化亚锡 （ SnCI2 H2O ）拌匀（作防腐剂），过滤，滤液置冷暗处过液，定容至 25mL。 （3）磷酸盐缓冲液（pH8.04）:1/15moL/L 磷酸二氢钾 5mL 与 1/15moL/L 磷酸氢二钠 95mL 混匀[1/15moL/L 磷酸二氢钾液：取本品 9.070g 溶于水成 1000mL；1/15moL/L 磷酸氢二钠 液：取磷酸氢二钠（ Na2HPO4 12H2O ）23.876g 溶于水成 1000mL]。 （4）氨基酸标准液（ 20g / ml ）：称取纯粹干燥的氨基酸（例如白氨酸）0.2000g,用水 溶解并定容至 100mL,摇匀。吸取此液 10mL 于容量瓶中加水至 100mL，即得（ 20g / ml ） 标准液。 3 操作方法 （1）标准曲线绘制 精确吸取氨基酸标准液 0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5.mL（相当于 0、100、200、 300、400、500.g 氨基酸）分置于数个 25mL 容量瓶中，加水补充至容积各为 4.0mL, 然后各加入茚三酮和缓冲液各 1mL，摇匀，置水浴中加热 15min，取出，迅速冷至室温， 加水至刻度，摇匀。静置 15min 后，在 570nm 波长下测定光密度，绘制标准曲线。 （2）样品测定 移取澄清的样品溶液 1~4mL（样液制备方法同单指示剂法），按标准曲线制作步骤操 作，测定光密度，并扣除样液空白值后，从标准曲线上查得氨基酸微克数。按下式计算样 品的氨基酸含量（以 某种氨基酸计）； 100 1000 ( %) = W G 氨基酸总量 mg 式中：G-从标准曲线上查得的氨基酸的量（ g ）； W-测定的样品溶液相当于样品的量（g）