实验二人源过氧化氢酶重组克隆的构建 实验目的 ▣ 掌握目的基因与载体连接并导入宿主菌的技术方法 掌握蓝白斑筛选阳性重组克隆的原理和操作 目的基因与质粒载 将重组质粒载体 鉴定连接和转化结 体连接 转化入宿主菌 果，筛选出阳性 重组克隆
实验二 人源过氧化氢酶重组克隆的构建 实验目的 掌握目的基因与载体连接并导入宿主菌的技术方法 掌握蓝白斑筛选阳性重组克隆的原理和操作 目的基因与质粒载 体连接 将重组质粒载体 转化入宿主菌 鉴定连接和转化结 果，筛选出阳性 重组克隆
人源过氧化氢酶重组酵母工程菌的构建过程 大量复制 PMD19T-CAT CAT基因 鉴定 筛选 重组克隆质粒 转化大肠杆菌 pMD19T-CAT pMD19T (克隆载体) 用来克隆和扩增DNA片段（基因）的载体，带有松弛 的复制子，能带动外源基因在宿主细胞中复制扩增。 么 酶切下 CAT基因 使目的基因能够表达的载体，其在克隆载体基本骨架的基 础上增加表达元件（如启动子、RBS、终止子等）。 pPICZaA (表达载体) 鉴定 线性化 88 筛选 重组表达质粒 电转化酵母 大量复制 转化大肠杆菌 pPICZaA-CAT pPICZaA-CAT
人源过氧化氢酶重组酵母工程菌的构建过程 酶切下 CAT基因 转化 大肠杆菌 电转化 酵母 转化 大肠杆菌 CAT基因 pMD19T pPICZαA 线性化 重组表达质粒 pPICZαA-CAT pMD19T-CAT 重组克隆质粒 （克隆载体） （表达载体） 用来克隆和扩增DNA片段（基因）的载体，带有松弛 的复制子，能带动外源基因在宿主细胞中复制扩增。 使目的基因能够表达的载体，其在克隆载体基本骨架的基 础上增加表达元件（如启动子、RBS、终止子等）。 大量复制 pPICZαA-CAT 大量复制 pMD19T-CAT 鉴定 筛选 鉴定 筛选
实验材料 ▣ 目的基因DNA、T载体、感受态细胞DH5a 1DNA Ligation Kit T4 DNA Ligase) ②LB-Amp培养基平板、X-gal(5-溴-4-氯-3-吲1哚- B-D-半乳糖苷)、IPTG(异丙基硫代-B-D-半乳糖苷) ③琼脂糖、TAE、Yea-Red染料 ▣ 移夜器、EP管、Tips、细胞推棒 ▣ 水浴锅、摇床、电泳仪、电泳槽
实验材料 目的基因DNA、T载体、感受态细胞DH5α ① DNA Ligation Kit （ T4 DNA Ligase ） ② LB-Amp培养基平板、X-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚- β-D-半乳糖苷)、IPTG(异丙基硫代-β-D-半乳糖苷） ③ 琼脂糖、TAE、Yea-Red染料 移夜器、 EP管、Tips 、细胞推棒 水浴锅、摇床、电泳仪、电泳槽
T载体克隆连接的原理 T载体是一种高效克隆PCR产物的专用质粒载体，为线性化载体，无需 酶切可直接与具有A末端的PCR产物连接，属于非定向克隆。 大部分耐热性DNA聚合酶进行PCR反应时都具有在PCR产物的3'末端添加一 个“A"的特性，而T载体在线性化平末端载体的两端分别又人工加上一个额外 的T碱基，所以可与PCR克隆产物的A末端互补配对，实现与PCR产物的高效 连接和克隆。 PCR产物 T载体
T载体克隆连接的原理 T载体是一种高效克隆 PCR 产物的专用质粒载体，为线性化载体，无需 酶切可直接与具有A末端的PCR产物连接，属于非定向克隆。 大部分耐热性DNA聚合酶进行PCR反应时都具有在PCR产物的3’末端添加一 个“A”的特性，而T载体在线性化平末端载体的两端分别又人工加上一个额外 的T碱基, 所以可与PCR克隆产物的A末端互补配对，实现与PCR产物的高效 连接和克隆。 PCR 产 物 T 载体
基因工程载体的特性要求 1.具有对受体细胞的亲缘性或亲和性（可转移性），能运送外源基因高效转入受体细胞 2.在宿主细胞内可自主地复制且不影响受体细胞正常的生命活动 3.分子量小，拷贝数多 4.具有多种单一的酶切位点或多克隆位点(multiple cloning site,MCS) 5.具有合适的选择性标记，便于筛选阳性克隆 抗生素抗性基因：Amp'上生化标记基因：acZ(B-半乳糖苷酶基因)
基因工程载体的特性要求 1. 具有对受体细胞的亲缘性或亲和性（可转移性）,能运送外源基因高效转入受体细胞 2. 在宿主细胞内可自主地复制且不影响受体细胞正常的生命活动 3. 分子量小，拷贝数多 4. 具有多种单一的酶切位点或多克隆位点(multiple cloning site，MCS) 5. 具有合适的选择性标记，便于筛选阳性克隆 抗生素抗性基因: Ampr ； 生化标记基因： lacZ（β-半乳糖苷酶基因）
实验步骤 1.目的基因片段连接T载体及转化感受态细胞DH5a ▣ (1)调节水浴温度至16℃。 (2)在EP管中配制下列溶液，全量为5μL。 试剂 使用量 PMD19-T vector 1pL ddH,O 3μL 目的基因DNA 1μL ▣ (3)再加入5μL的Solution I,短暂离心。 (4)16℃反应30分钟
实验步骤 1. 目的基因片段连接T 载体及转化感受态细胞DH5α （1）调节水浴温度至16℃。 （2）在EP管中配制下列溶液，全量为5 μL。 （3）再加入5 μL的 Solution I，短暂离心。 （4） 16℃反应30分钟。 试剂 使用量 PMD19-T vector 1μL ddH2O 3μL 目的基因DNA 1μL
(5)加入1支感受态细胞悬液（约100μL)，冰浴30分钟。 (6)42℃加热60-70秒钟 短暂的热刺激使细胞膜的液晶结构发生剧烈扰动，并随机出现许多 间隙，从而外源DNA被细胞摄入 (7)再在冰中放置1分钟（细胞孔隙闭合） (8)加入LB培养液1支（约900μL)，37℃振荡培养45分钟（细胞恢复正常状态）
（5）加入1支感受态细胞悬液（约100μL ），冰浴30分钟。 （8）加入LB培养液1支（约900 μL ），37℃振荡培养45分钟(细胞恢复正常状态) （6）42℃加热60-70秒钟 （7）再在冰中放置1分钟(细胞孔隙闭合) 短暂的热刺激使细胞膜的液晶结构发生剧烈扰动，并随机出现许多 间隙，从而外源DNA被细胞摄入
蓝白斑筛选 对载体连接和转化的结果进行鉴定，筛选出载体连接有目 的基因并成功转化入宿主菌的克隆 宿主菌：DH5a,acZ△M15基因型，其编码的B-半乳糖苷酶缺失N端一个 146个氨基酸的短肽（即a肽链），不具酶活性。 T载体： 多克隆位点(multiple MCS cloning site) Ampicillin lacZa resistance gene gene 氨苄青霉素抗性基 因，用于鉴定转化 T Vector 编码β-半乳糖苷酶a肽链， 用于鉴定外源基因连接 X-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-B-D-半乳糖苷)：生色底物，被B-半乳糖苷酶分 解产生蓝色物质5-溴-4-氯靛蓝。 IPTG(异丙基硫代-B-D-半乳糖苷)：β-半乳糖苷酶的活性诱导物质 LB-Amp平板：含氨苄青霉素的LB培养基平板
蓝白斑筛选 IPTG(异丙基硫代-β-D-半乳糖苷):β–半乳糖苷酶的活性诱导物质 X-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷)： 生色底物，被β-半乳糖苷酶分 解产生蓝色物质5-溴-4-氯靛蓝。 宿主菌: DH5α, lacZ△M15基因型，其编码的β-半乳糖苷酶缺失N端一个 146个氨基酸的短肽（即α肽链），不具酶活性。 T载体： 编码β-半乳糖苷酶α肽链， 用于鉴定外源基因连接 多克隆位点（multiple cloning site） 氨苄青霉素抗性基 因，用于鉴定转化 对载体连接和转化的结果进行鉴定，筛选出载体连接有目 的基因并成功转化入宿主菌的克隆 LB-Amp平板 :含氨苄青霉素的LB培养基平板
T载体 宿主菌 T载体+外源DNA 空载体转入宿主菌 无载体转入宿主菌 重组载体转入宿主菌 Amp敏感 Active Ampt Inactive Ampr B-半乳糖苷酶 C-肽 无菌落生成 B-半乳糖苷酶 {C-肽缺失 X-gal→ 5-溴-4-氯靛蓝 X-gal不分解 蓝白斑筛选阳性重组克隆的原理 Amp+X-gal IPTG
X-gal 5-溴-4-氯靛蓝 X-gal不分解 Amp敏感 无菌落生成 T 载体 宿主菌 T 载体+外源DNA Amp+ X-gal + IPTG Active Inactive 蓝白斑筛选阳性重组克隆的原理 空载体转入宿主菌 无载体转入宿主菌 重组载体转入宿主菌
实验步骤 2.蓝白斑筛选阳性重组克隆 室温下3000rpm离心5分钟，立即吸去大部分上清液（约900uL),然后用剩余的培养基 (约100uL)将菌体悬浮。 加入40pL2%X-gal和10μL20%IPTG,与菌液混匀，然后均匀涂布在含有 100μg/mL氨苄青霉素的LB平板上。 待菌液吸收后， 37℃倒置平板培养过夜。 平板上长出蓝色和白色菌落，挑取平板上的白色菌落（阳性重组克隆），用于后续培养和实 验操作
2. 蓝白斑筛选阳性重组克隆 平板上长出蓝色和白色菌落，挑取平板上的白色菌落（阳性重组克隆），用于后续培养和实 验操作。 待菌液吸收后, 37℃倒置平板培养过夜。 加入40μL 2%X-gal和10μL 20% IPTG ，与菌液混匀，然后均匀涂布在含有 100μg/mL氨苄青霉素的LB平板上。 室温下3000rpm离心5分钟，立即吸去大部分上清液（约900L），然后用剩余的培养基 （约100L）将菌体悬浮。 实验步骤