《生物化学》教案 授课题目 学时安排 第十章 核酸性质 3学时 学握核酸的酶促降解： 骆 两性解离： 紫外吸收： 变性与复性： 袋 分子杂交。 了解核酸的酸解离、 碱解离。 紫外吸收： 教学 变性 重点 复性 教学 变性 难点 复性 教学过程 讲授结合多媒体课件 作业 P511习题之1、2、3、7、8、10
教学内容 导言 从上一章的讨论，大家知道了核酸的组成、结构、功能以及他和基因、来色体的关系， 知道了他的学说英定了分子生物学的基础。提到分子生物学，大家马上会想到DA重组、基 因工程、分子克隆、分子杂交、深针、药物导弹等等一系列当红巨星，迫不及待想认识他们， 现在就请后几位闪亮登场，接受你的检阅。前几位待到最后一幕一一DA重纽与基国工程专 场亮相 第十章核酸理化性质 一般理化性质 M为白色纤综状固体，为白色粉术：都微溶于水，不溶于一般有机溶剂。常用乙 一个如 第一节核酸的水解 可被水解的键有磷酸酯键和糖哲键 ·、酸水解（了解） 主要水解糖苷健，月嘌岭糖甘健史易。 DNA--pHl.6:37℃ 无嘌岭酸十嘌岭 核酸-一98~100%甲酸：175℃：2h一一戊糖十磷酸+嘌岭+嘧啶 二、碱水解（了解） DNA-一1mOl碱：100℃-一片段（难以水解） RNA-031ol碳：37：18 →2或3-核甘 因为磷酸先与2位羟基成环，然后再开环生成2或3”-核背酸。 DNA无2'位羟基，故较RNA时碱。 三、酶水解（掌握） 水解磷酸二笛键 据有无专一性 磷酸二酯酶底物为DNA和RNA 核酸酶 底物为DNA或RNA 据作用方式内切牌 限制性内切带 外切薛 据断裂酯键位骨3-砖酸酯键 产物为5-核苷酸或5-P片段 5磷酸酯鍵 产物为3-核苷酸或3P片段 据二级结构：双链、单链 据外切方向：3一5腾、5一3膺 核酸H:水解DNARNA杂合分子中的RNA 举例 无专一性，外切
P-RN-P-RN-P-RN-P-RN-P-RN-P-RN-P 牛脾磷酸二脂 蛇磷酸二酯酶 (SPDase (VPDase 得3”-核甘酸 得5-核甘酸 但有3-磷酸时，不 有专一性，内切（切5磷酸酯键） …p RPu-P -RG-P- RA-P- 吟 马 牛胰RNA酶 RNA酶U rnA TI RNAT2 (RNase 1 (RNaseU)(RNaseTl) (RNaseT2) 切3-磷酸酯键 单链一一 →P.约4核甘酸-OH 双链一一一→P钓4核甘酸OH HO约4核什酸P 牛脾DNA梅(DNaseⅡ) 切5‘一碳格 同上，约6个核甘酸 (注意末端磷酸位置相反) 专一，内切 限制性内切酶双链，切3·，选4~6个核甘酸序列 .12246. .12346 123456… …1234 56… 齐头木端 …123456…→ 十123456 …123456… .123456 粘性木端 第二节 核酸的酸碱性质 碱基显碱性 pK在9以上 磷酸显酸性pK1在1以下，pK2在6左右 核旮酸、核酸为两性化合物 但于砖移的酸性大于基的碱性，比L较小，在25以下 所以，凡以电荷多少分离蛋白质的方法都可分离核普酸和核酸 由于其解离相当复杂，故一级不必研讨之，掌握上述要点即。 各种核酸的大小所带的电荷不同，可用疤泳和离子交燕法分离。以在室温下易被稀 碱水解，DYM较稳定，此特性用来测定VM前碱基组成和纯化DM。 第三节 核酸的紫外吸收
核酸的碱基具有共扼双键，因而有紫外吸收性质，吸收峰在260m(蛋白质的紫外吸收 峰在280mm)。 用此性质可测定核酸，称紫外分光光度法 测定时，或者作标准曲线：或者用下列经验数据： A值为1相当于：双链DNA 50μgmL RNA/单链DNA 40u g/mL A 寡核甘酸 20ug/mL 用此性质可鉴定DNA/RNA的纯度 纯DNAA260/A280应答与1.8 纯RNAA260/A280=2.0 260 280 若小，说明有泰质，不能用分光光度法测定 核酸的光吸收值比各核甘酸》 吸收值的和少3040%，当核酸变性或降解时光吸收值显 苦增加（增色效应），但核酸复性后，光吸收值又回复到原有水平（减色效应）。 核甘酸总吸光度 变性DNA 天然DNA 用增色效应和减色效应可测定核酸变性或复性的程疫 第四节核酸的变性和复性 一、核酸的的变性（重点、难点） 变性的概念、因素、本质等同蛋白质变性 山热引起的变性称为热变性。热变性一半时的温度称为溶解温度/熔点/解链温度/Tm
DNA变性是个突变过程 类似结品的熔解。将紫外吸收的增加量达 到最大增量一半时的温度称熔解温度 (melting temperature.Tm). T .般在8095C 影响Tm的因素 (1)G-C的相对含量(mo1%) (G-C)%=(Tm-69.3)×2.44 (2)介质离子强度低，Tm低。 影响藓酸离子键，当离子强度为0时， 室温即变性。所以，要保存在较高盐溶液中 (3)pH值高pH下碱基广泛去质子而丧失形成氢键的能力。 (4)变性剂如 甲酰胺、尿素、甲醛等破坏氢键，妨碍碱基堆积，使Tm下降 (5)均一性 均质 变性温度范围牧窄 异质变性温度范围较宽 二、核酸的复性（退火）（重点、难点） 变性核酸的补旋在适当条件下重新缩合成双娱旋的过 配 然双蝶旋构象，这一现象称为 (1)溶液湿度的高低 低温利于复性从变性温度线慢降温 (2)单链片段的大小 小快 (3)单链片段浓度 大快 (4)溶液离子漏府的大小大快 (5)片段内重复序列的多少即复杂度低快 三、分子杂交（掌握） 在退火条件下，不同来源的DNA互补区形成氢键，或DNA单链和RNA链的五补区形 成DNA-RNA杂合双链的过程。所得分子叫杂交分子分子杂交是以德酸的变性和复性 为基瑞，只要不阿来漂的候酸分于的候酸仔列合有可以形成翼基五林对的片受，宽可以
形成DWA/NM,RWMM或NMRM杂化双链，这个现象称为核酸分子杂交(hvbridization.). 之所以能杂交，是其分子间有百补关系 分子杂交广泛用于分子生物学研究、如基因鉴定、探针药物导弹等等 探针：用放射性同位素或荧光标记的DNA或RNA片段。一般用P标记 标记一个米源的核酸（放射性同位素或炎光标记，通过杂交可以枪测与其有五补关系 的DM或RM,这种标记的核酸称为基因探针(gene probe.),也威是一段带有检测标记，具 颇序已机，与目的基因互补的核酸序列。基因探针的“集成化”威是基因心片(ge爬chp) 是把已经测序的基因固定在碰片或破璃片上制成的.在医疗诊断和科学研究中已被快速地运 用。 原位杂交技术：直接用探针与茵落或组织细胞中的核酸杂交，未改变核酸所在的位置。 点杂交：将核酸直接点在膜上，耳与核酸杂交。 Southern印迹法：将电泳分离后的DNA片段从凝胶转移到硝酸纤维素膜上，再进行杂 Northern印迹法：将电泳分离后的RNA吸印到纤维素膜上再进行分子杂交 Wstm印迹法：将电冰分离后的蛋日质吸印到纤维素膜上再用标记的配体进行分子杂 交。 一般用”S标记蛋白质或配体，如杭原抗体、配体受体等 步骤 、限制性内切酶水解DNA 2、琼脂糖凝胶电泳水解物 3、将电泳分离的DNA片段转移到硝酸纤维薄膜上。 4、用探针进行杂交。 5、成射性显影检测。 核酸的序列测定 DNM序列是指携带造传信息的DNA分子中的A、C、G,T的序列。分析方法主要有两种， 一种是Maxam-Gilbert化学法，另一种是Sanger的双脱氧法。现在一般都采用后者，其基本 顶理是： 1.用凝胶电泳分离待测的DN片段（用作模板） 2.将模板、引物、4种小TP,合适的聚合南胥于4个试管，每一试管按精确比例各加 入一种ddNTP,用同位素或荧光物质标记。 3.利用dNTP可特异地终止DNA链延长的特点，4个试管的聚合反应可以得到一系列 大小不等、被标记的片段。 4.将4个反应管同时加到聚丙烯凝胶上电泳，标记片段按大小分离，放射自显影后可 按请型读出DA序列 在以上两种方法的基础上，通过与计算机技术和荧光技术的结合，发明了自动测序仪。 目前，常用的测序策略是“鸟枪法”，形象地说是将较长的基因片段打断，构建一系列的随 机亚克隆，然后测定每个亚克隆的序列，用计算机分析以发现重叠区域，最终对大片段的 NA定
