《生物化学》教案 授课题目 学时安排 第二十章 DNA重组及基因工程简介 4学时 学 掌握同源重组、特异位点重组、转座重组概念。 夕 基因工程概念：基因工程技术 的 熟悉同源重组：特异位点重组：转座重组：蛋白质工程 了解基因工程应用与展望。 求 DNA重组概念 教学 基因工程概念 重点 基因工程技术 教学 转座重组 难点 基因工程技术 教学 讲授结合多媒体课件 过程 P4531、3、4、8、13 作业 P6151、3、6、10、12、20、22
教学内容 导言 终于等到了基因工程出场。 基因重组妙工程，谋求粘结入选用，人造生物成力大，工农医科显神通。 “谋求粘结入选用”，就这么简单的7个字，构成了一项成力巨大的诱人工程。我们已经实 受着他的丰硕成果：胰岛素、脑啡胀、抗虫棉、转慕因大豆等等等等。但它会不会和炸药」 原子能一样有消的一西呢？简单的7个字就真得很简单吗？学完本章，你就会知道他简单 不简单，消极不消极。 第二十章DNA重组及基因工程 第一节DNA重组 DNA重组又叫基因承组、基因重排，遗传重组是指DA分子内（如转座）或分子间 (如交换)发生遗传信息的重新组合。可发生在绷胞内（如交换、转坐）.细似（结合 转导)，基全在不同物种之（转染）：可以是分子（结合）、片新（交换：五组后仍 然具有复制和表达的功能。五潮产物为体。是人为饰，是工 基面印尽所有物可能发生的基本的传现象。无论布高等坐物体内，还是在 菌、病毒中，都存在基因重组。不仪在减数分裂过程中会发生基因重组，在高等生物的体细胞 中也会发生基因重组。基因更组不仪可以发生在钢胞核内的基因之间，也可以发生在线粒体 和叶绿体的基因之间。可以说，只要有M,就可能发生雨组。 重组的意义在于：能迅速增加群体的遗传多样性：使有利突变与不利突变分开：通过 优化组合积累有意义的遗传信息：为DM损伤或复制障碍提供修复机制：调节某因表达 从广义上讲任何造成基因型变化的基因交流过程部叫做基因重组。而获义的基因西 组仪指涉收M分子内断裂一复合的基因交流。真核生物在减数分裂时，通过非同源染色体 的自山组合形成各种不同的配子感雄子结合产生基因型各不棚回的后代这种万组过程 然也导致基因型的变化，但是山于它不涉及M分子内的裂及复合，因此，不包括在义 的基因市的范图之内。 根据玉组的机制和对蛋白质因子的要求不同，可以将获义的基因币组分为二种类型，即 同源重组、特异位点重组和转坐重组。 同源重组的发生依赖于大范围的WA同源序列的联会，在重组过程中，两条染色体或 DA分子相互交换对等的部分。真核生物的非姊妹染色单体的交换、细菌以及某些低等真核 生物的转化、细菌的转导接合、 噬菌体的 重组等都属于这种类型。大肠杆菌的同源重组需 RecA蛋白，类似的蛋白质也存在于其他细菌中 特异位点重组发生在两个DNM分子的特异位点上。它的发生依濑于小范围的DNA同源 子列的联会，重组也只限于这个小范围.两个DA分子并不交换对等的部分，有时是一个DNM 分子整合到另一个DNA分子中。这种重组不需要RecA蛋白的参与. 转座重组发生在顺序不相同的A分子间，在形成重组分子时往往依赖于DNA的复制 而完成重组过程。例，在转座过程中，转座因子从染色体的一个区段转移到另一个区段， 或从一条染色体转移到另一条染色体。这种类型的重组也不需要RcA蛋白的参与
一、同源重组（理解） 同源重组：指山两条同源区的M分子通过挥对、旋的新裂和再接，从而产生片断交换 的过程。又叫一般性重组。简言之：发生在同源DNA序列之间的重组. 这种重组方式要求两段DNA序列类似，并在特定的重组蛋白或衔(RcA蛋白、RecBCD 酶)的作用下完成。 ReeA蛋白主要有两个功能：诱发SOS反应和促进DNA单链的同化（单链与同源双链分 子发生链的交换，从而使重组过程中的DNA配对、ol1iday中间体的形成、分支移动等步 骤得已产生)。参见p441 (一)Holliday模型 山Robin Holliday于1964年提出。 关键步骤有四： ①两同源染色体整齐排列 (条线代表一条M分子，两线无配对关系) ②每分子的一条链断裂、交换并连接（形成的连接分子称为Hol1idy中间体 在特定的亚组蛋白或防(RecA蛋白，RecBCD酶)的作用下完成. ③通过分支移动产生异源双链DNA,再弯曲、旋转 旋转 ④Ho11iday中间体切开并修复，形成两个双链币组体DNA 水平方向切开并连接 垂直方向切开并连接 右
称为片断重组 称为拼接重组 (二)同源重组的类型 1.接合作用：当细胞与细胞相互接触时，DA分子即从一个细胞向另一个细胞转移， 这种遗传物质的转移方式称为接合作用， 如大肠杆菌质粒转移 致因子(F因子)通过性毛转移 有F称F菌保 无F称菌保 F整合在核DM中称Hn菌株，F中合核基因称F 菌 2.转化：生物体吸收外源（转化因子）引起遗传性状改变的现象称为转化，也指 其过程。如大家已知的肺炎双球南转化试验。 病常常可感染细胞并将其注入细胞内，也可引起细胞遗传性状的改变。 通过感染方式将外来DNA引入宿主细胞，并导致宿主细胞遗传性状变的过程称为转 染。转染是转化的一种特殊形式。 3.转导：通过缺陷型噬南体将DM(转导基因)从供体细胞转入受体（宿主）细胞的过 程。 堂菌体组装时包裹了寄主片断，称缺陷型噬菌体（部分）或定全缺陷型噬菌体（全 部)。 转导基因是任意的，称普遍性转导：转导基因是特定的，称局限性转导（只能是温和噬 菌体)。 4.细胞融合：两个细胞合二为一（基因组也合而为一）。有壁的要去壁，故常称为原生 质体融合。 以上内洋微物学 (三)同源重组的意义 是最基本的重组方式，参与各种重要的生物学过程，如复制、修复、基因工、整合、 和转化等。 二、特异位点重组（理解） 特异位点重组：在整合的催化下，两段DNA序列在特异的位点处发生整合并共价连 接。 所谓特异位点，指能产生粘性木端的序列，一般长20一200p。特异的南可识别并在木 端处切断之，然后连接不同特异位点，这样的南叫整合梅。 1某特异位点为5‘CTAG 3GATC,切点是位点木端(1C), A位点在同分子同向 …CTAG12345CTAG 3…GATC54321GATC· 切切5·磷酸酯键(C外的，非C的)
↓3'5C3‘5”第一个5是C的，两个都可是C外的 5··-PH0-CTAG12345-P 1H0-CTAG,,,,. 3…GATC-OH P-54321 GATC-OH D.。.。. 接 左右片段连热，左中和中右连接为复 5’**CTAG,* 3…GATC… 结果一段被切除 B位点在同分子异向 5÷,.CTAG12345GATC... 3…GATC54321CTAG 切 5”。0 CTAG 12345 GATC 3…GATC 54321 CTAG··· ↓接 5......CTAG54321GATC...... GATC12345CTAG.。 结果一段被转向 C位点异分子 5”0g00。CTAG000a 50".CTAG▣g0 3··GATC·· 3···GATC··· ↓切 5… CTAG… 5 CTAG… 3’…GAT 3…GAT 5…CTAG: 5eee·CTAG 3”GATC。 3。。GATC·,。 结果两分子整合 没想：一个小分子两端， 一个大分子中间有同的位点，本整合游作用下，结果如何 ·小分于子就会被整合在大分子中。原病毒的形成概是。 基因工程的，理论基酬就存于此。（利用某整合牌，把目的基因和某病毒整合在一起，再 用该病寿感染寄主，即通过转导使目的基因在寄主细胞中表达。) 我们可以看到，同源重组一搬都在染色体内仍D4序列的原来排列次序。但是在特 异位点重组中，DN4节段的棚对位发发生了移动，从而得到不同的结果DNA序列发生 重撞。 特异位点五组不依獭于DNA顺序的同源性（丝然亦可有很短的同源序列），而依赖于 能与某些梅相结合的DNA序列的存在。这些特异的梅能催化DN4链的断裂和重新连接，它 们能发动特异位点五组作。而在同源声组中，DN1链的切全是随机的，特果暴出 些能与RcA这样的蛋白质相结合的顾序，从而发动交叉币组。 特异位点重组的意义基因表达调节（如抗体基因重样），某些病青、质粒的整合 等 三、转座重组（理解） 转座又称为转位(transposition),是指DNA的片段或基因从基因组的一个位置转移到
另一个位骨的现象。 能够在基因组中自山移动的D片段（遗传因子）称为转座子或转座因子，包括插入序 列和转座子两种类 插入序列：除转座所需基因外不携带任何标记基因的转座因子，足简单转座子 转座子：除转坐所需基因外还携带某种标记基因的转坐因子，是复杂转坐子。 标记基因：编码易于检测的性状的基因。如细菌的抗青得素基因， 转座承组：话过转进行的DNA承新组合 转座的机制依赖DNA的交错剪切和复制 ,但不依赖于同源子列。转座涉及转座，解 离酶和DNA聚合，共分为复制型、非复制型两种类型。 复制型：复制并转座，转座子原位保，新位加入，成为二倍体。 非复制型：不复制只转座，转座子原位切除，新位加入，还是单倍体。 转座的过程中会形成共合体（即转座子二倍体甚全多倍体），异位，两个转座因子之间 的重组会引起缺失和倒位 第二节基因工程及蛋白质工程 、橱述（掌握） 重组DM技术又称为基因工程或分子克隆，是指采用人工方法将不同来源的DNM进行重 组，并将重组后的DM引入宿主细胞中进行增箔或表达的过程 克隆(con爬)是指延过无性繁消产生在基因型和表型上与亲代完全用而的子代群体 M克隆是指在体外对M分子按照慨定目的分离、剪切和人工距组，然后将距组分子导入 合还的宿主绑胞，使其扩增的过程。 果将一种生物的DNA中的某个遗传弃码片断逆接到另外一种生物的DNA链上古， 将DNA新织 就可以照人类的服望， 设计出新的遗传物质并剑造出新的生物为 型，这与过去培疗生物繁痘后代的传统敏法完全不同。 这种做法就像技术科学的工程设计，按照人类的需要把这种生物的这个“基因”与那种 生尘物的那个“基因“页新“施工”“叙装“成新的基因组合，创造出新的生物。这种完全按 人的意.山新组步基新物立的物科学术，域称为“基工型”或苦 是“遗传工程” 基因工程是生物工程的一个五要分支，它和细胞工程、工程，蛋白厦工程和道生塑 程传组成了生物工程。 所谓基因工程(genetic engineering)是在分子水米上对基因进行燥作的复杂技术，是 将外源基因通过体外币组后导入受体绑胞内，使这个基因能在受体细胞内复制，转采、翻泽 表达的作。它是用人为的方法将所需婴的某一供体生物的遗传物质 DNA大分子提我 出米，在离体条件下 用适当的 具进行切剂 把它与 为截体的日 分子连接起 然后与载体一起导入某一必易生长，繁的受体绷胞中，以让外源物质在其中“安家济户"： 进行正常的复制和表达，从而扑行新物种的一种崭新技术。 基因工程重要特征： 1小、目的基因转移勤越物种屏障外源酸分子在不的主生物中进行繁，能觉 越天然物种 ,把来自任何 种生物的基因放胃到新的生物中，而这种生物可以与原来 物冠无豪尖系 2、目的基因大量扩增 一种确定的DNA小片段在新的寄主细胞中进行矿，这样实 现很少最DNM样品"拷"出大量的DNM,而月是大量没有污染任何其它DNA序列的、绝
对纯净的DNA分子群体. 二、基因工程技术（重点难点） 1.载体和目的基因的分离 对截体DNA和目的基因分别进行分离纯化，得到共纯品 1)我体：携载日的基因的DA分子，要有进入寄主细胞并在其中表达的能力月对寄主无 常用的截体(vector)主要包括质粒(plasmid 、体(phage)和病毒(virus)三大类 这些我体均需经人工构建，除去致病基因，并赋予一些新的功能，如有利于进行筛选的标志 基因、单一的限制啊切点等。 ①质粒：是存在于天然细菌体内的一种独立于绑菌染色体之外的双链环状4，具有独 立每制的能力，通赏带有细葡的抗药基因 可通过转染方式将其送入翔菌体内进行增航。常用的为人工构建的1 噬体载体，当目的基因与体进行五组时，可采用插入重组方式，也可采用胥换页 组方式。 ③病毒：常用的为S40,通过感染方式将其M送入哺乳动物细胞中进行增殖。 裁体的意义把目的基因送入寄主细胞，使目的基因表达（因为目的基因一般无寄主 细胞的启动子)。 (2)目的基因：要转移表达的基因。 来源①直接从染色体DNA中分离：仪适用于原使生物基因的分璃。 ②人工合成：根据已知多队链的氨基酸顺序，利用遗传旁码表推定其核甘酸顺行 再进行人工合成。适应于编码小分子多队的基因 ③从mRNA合成cDNA:采用 化合成其五补M(cM,除去M链后，再用M聚合游合成其互补DM能，从而得到 双链DA ④从基因文库中筛选：将某一种基因A用适当的限制德切断后，与截体M 面组，再全部转化宿主细胞，得到舍全部基因组M的种群，称为G义”摩 小.将某种胞的全部mRM通过逆转合成cNM,然后转化宿主细胞 到含全部表达 的种群 称为C-(V 特异性 ⑤利用PC合成：划已知目的基因两端的序列，则可采用聚合薜能反应 (polymerase chain reaction,PCR)技术，在体外合成目的基因。 2.裁体知目的基因的切断 通常采用限制性核酸内切(restriction 简称限制。 分别对载 和目的基因进行切断，以便于五组。能够识别特定的碱基顺序并在特定的位，点降解核露 的核酸内游称为限制葱。限制遊所识的顺子往往为4一8个碳基时，且有回义结构。1山阳 制俯切惭后的木端可形成半端、粘性未端。形成粘性木端(cohesive end).者较有利于载体 DVA和目的基因的币组。 3,裁体和目的基因的重组 将带有切口的载体与所狄得的目的基因连接起来，得到重新组合后的DA分子 (1)粘性木端连接法：载体与目的基因通过粘性木端进行五补粘合，再加入连按薇， 即可封闭其缺口，得到重组体
(2②)人工接尾法：即同聚物尾连接法。在木端核甘酸转移的催化下，将脱氧棱密核苷 酸添加于载体或目的基因的半头端，线体上添一段P0l6,则可在目的基因上添加 段polC 基互补进行粘合后，序山M连接梅连接 (3)人工接头连接法：将人工连披器（即一段含有多种限切点的片段）连接到线 体和目的基因上，即有可能使用同一种限制俯对载体和目的基因进行切断，得到可以五补的 新样木端。 4.承组DNA的转化和增 将重组NA导入宿主细胞进行增殖或表达 重组质拉可通过转化方式导入宿主钢胞， 1南体作为我体的体，则需通过转 方式将重组磁菌体DM导入大肠杆茵等宿主绑胞。或人工显微注射（针头Q.1~0.5微米） 常用于微生物。或高速微弹发射。常用于动植物。把目的基因粘附在1微米的金钨粉上， 用基因枪把其时入体内。 5.重组DNA的筛选和鉴定 对含有重组体的宿主细胞进行筛选并作鉴定 )根据重组体的表型进行筛选：对于带有抗药基因的质粒重组体，可采用插入灭活法进 行筋选。 ②根据标志互补进行带选：当宿主钢胞存在某种基因及其表达产物的缺陷时，可采用此 方法箭洗体。本战D以分子中质入期应的缺哈基，主邹胸新得路其 的表达产物， 则说明该绷胞中带有 重组体 )根据限制廖清进行分析：经过相筛后的含重组体的绷商，还需进行限制裤分M 进一步鉴定 (用模酸杂交法进行分析鉴定：采用与目的基因部分互补的D财片段作为探针，与含有 更组体的绑菌菌落进行杂交，以确定更组体中带目的基因。 6增 获得带目的基因的翻前后 可将不断进行馆 从而得到大量的目的基因片段用于分 析研究。在目的基因的上游带有启动子序，则目的基因还可转水表达合成雀白质。 简言之，基因工程的般步骤如下： 1、根据需要提出设计（谋） 2、分离改浩目的基因和裁体（分） 3 使目的基因和我体有同种粘性木端（切） 把2、3体外重组（接 5、把重组的DNA分子引入受体细胞（转）》 6、分离基因工程细胞（选） 7、使目的堪因在受体细胞内表达（养） 谋求粘结入选用创寻求粘性木端结合连接进转入选出应用 基因五组妙工程，求粘结入选用，人生物威力大，工农医科显神通 三、蛋白质工程（熟悉） 1、概念 蓝白质工程是在基因重组技术、生物化学、分子生物学、分子遗传学等学科的基础之上： 融合了蛋白质品体学，蛋白质动力学，蛋白质化学和计算机辅助设计等多学科而发展起来的 新兴研究领域
其内容主要有两个方面：根据需要合成具有特定氨基酸行列和空间结构的蛋白质：鹅定 蛋白质化学组成、空结构与4物功施之的关系。本此基激之上。实厘从氨基酸字预器 蛋白质的空间结构和生物功能，设计合成具有特定生物功能的全新的蛋白质，这也是蛋白质 工程最根本的目你之 目丽，蛋质工程尚未有统一的定义， 般认为蛋白质工程就是通过基因重组技术改变或设计合成具有特定生物功能的蛋白 质。实际上蛋白质工程包括蛋白质的分离纯化，蛋白质结构和功能的分析、设计和预测，通 过基因重组或其它手段改造或创造蛋白质。从广义上来说，蛋白质工程是通过物理、化学 生物和基因重组等技术改造蛋白质或设计合成具有特定功能的新蛋白质 2、研究的核心内容 蛋白质结构分析蛋白质工程的核心内容之一就是收集大量的蛋白质分子结构的信息， 以便建立结构与功能之间创关系的效据年，为蛋白质结构与功能之间关系的理论研究典定基 品丛学的技术核磁共振持术 结构、功能的设计和预测 根缗对天然蛋白质结构与功能分析建立起来的数据库角 的数露，可以预测一定氨基酸序列链空结构和生物功能：反.之也可以根据特定的生物 能，设计萤日质的氨基酸子列和空间结构。 甚因组等实验分子动力学学 分子热力学 创造和改造蛋白质的改造，从荷单的物理、化学法到复杂的基因重组等等有多种方 物理、化学法：过蛋白质进行变性、复性处理，修饰蛋白质侧链官能团，分划财缝， 改变表面电荷分布促进蛋白质形成一定的立体构像等等：尘物化学法，使用蛋白选样性地 分蛋白质， 利用转甘、脂隙、酰等士除或连接不同化学基团， 利 转联 酶使蛋 质发生胶连等等.以上方法以能对阴同成似的基团成化学越发生作用，缺乏特异性，不能 针对特定的部位起作用。采用基因距组技术或人工合成DNA,不但可以改造蛋白质而具可 以实现从头合成全新的蛋白质。 3、实际成用举例 提高蛋白质的稳定性 前萄异构 G)在工业上应用广泛，为提高其热稳定性 米国萨等人布确定第138位甘氨G138为目标氨基酸后，用双引物法对G1基因进行从 外定点诱变，以刚氨酸(P和138)替代Gr138,含宽变体的匝组质数在大杆菌中表达 结果突变型G1比野生型的热半衰猢长一倍：最适反应温度提高10~12℃：悴比活相同。据 分折，Pm梦代G弘138后，可能加于引入了一个略坏，该☒挂妆好能感草充于Gv138路 近的空剂， 使蛋白质空间结构史具性，从而提高了的热稳定性 融合蛋白 啡EkN带5线形结构是与6型受 结合的基本功能区域， 扰素(FN)是一种广谱抗病毒抗肿抽的钢胞因子。黎盂枫等人化学合成了EkN端5耿编 码区，通过一连接3队编码区与人1型V基因连接，在大脂杆菌中表达了这一融合蛋白。 以体外人结脂腺绵绑胞和多形胶质痛钢胞为棋型，采用3H一胸隙酷硬核甘惨入法证明该融 合蛋白柳制肿胞生长的活性量著高于单纯的FN,通过Naloxone竞争阻实验证明， 抑制活性的 山Ek导向区介导 蛋白质活性的改变 通常饭后30一60min,人血液中岛素的含量达到高峰，120一 80mn内恢复到基础水半。而目心箭休上使用的陵岛制定时后120mn后才出现高峰月 持续180~240min,与人生理状况不符。实验表明，陵岛素在高浓度（大于10-5molL)时 以二聚体形式存在，低浓度时（小于10一m和L)时主要以道体形式存在，设计速放随岛 素原则就是避免陵岛素形成聚合体。类陵岛素生长因子一 1GF一)的结柏和性质与陵岛素 有高度的同源性和二维结构的似性，但1G下一1个形成 聚体。1GF-1的B结构 (与 素B链用对应)中B28一B29氨基酸列与顾岛素B链的B28一B29阴比，发生藏两。齿 此，将陵岛素B链改为B28Ls一B29P加，状得单体速效陕岛素。该速效胰岛素已通过临休
实验 四、应用与展望（掌握） 工对发酵工业和医药工业有很大促进。 例陈岛泰生产3一g需100kg陡脏 几1丁积黄发路液 生长素释放抑微素的生产5mg需50力个羊头10工程菌发辞液 农培育优良品种 例各种转基因农作物，提高品质、抗性，产量等 (转基因大豆，抗虫棉等 1998年我国科学家将：深海鱼关洲拟的抗冻基因通过柱头转入番茄，或得藏 受-4-5℃低湖的转基用番茄 理银：光和其因转入动物、固氨基因转入农作物等。 医提供医药产品、基因治疗等 岛素，干扰素 脑激素 :用房母生产的乙肝表面抗原疫苗、人病疫苗等 0年关四首创基因治疗雨度免疫缺陷证（缺膜苷脱氨薛）：91年我四首例基因治 疗B型恤友病：6年又报道可治疗尿病等。 四想遗传病、密症、心脑血管疾病、老年痴呆症、艾滋病等 科研究基因的功能 将高等生物的基因本菌体内大显表达，为结构功能研究提供极大方便 我国基因研究的成果 目前，我国在蛋白基因的突变研究、血液病的基因治疗、食管貔研究、分子进化理论 白血病相关基因的结构研究等项日的基础性研究上，有的成果已处于国际领先水平，有的已 形成了自己的技术体系。而乙肝疫苗、重组á型干扰素、重组人红细胞生成素，以及转基 因动物的药物生产器等 多个基因工程药物， 均已进入了产业化阶段 进退两难的境地和两面性的特征 转基因产品有害省？ 甚因作物在爽论架引发单议 当类国0%的农用种植了经过基因政良的作物、消费 者大都然自若地购买转基因食品时，此类食品布欧洲制遭遇一高过一浪的喊打之声。 告词：非转基因 会杏用来危害人类？ 医学界在几方面从基因研究中获利：克隆技术的进展为拯效撕危物种及探索多种人类跌 满的治疗方法提供了前所未有的机会。目前研究人员正准备将生物技术推进到宫桃战性的 领威。但近来警遗传学家的行为的声音越来越受到视 人类基因组正在破译，将为人类遗传病的预防和治疗做出巨大贡献，但它容易为种族 义提供新的遗传学方面的依据。对新的遗传学持批评态度的人总喜欢描绘出一幅可怕的 象：没完没了的测试、操纵和克隆、毫无感情的士兵、基因很完美的工厂工人…遗传索码 使基因研究人员能深入到人们的内心深处，并给他们提供了操纵生命的工具。然而他们是香 能使遗传学好的研究方向发展还完全不能预料
