《生物化学》教案 授课题目 学时安排 第三章 氨基酸 4学时 掌握氨基酸的定义、 教学 结构通式、分类 目的 学握氨基酸的两性解离、 和 重摆化学性质 要求 掌程氨基酸的分配层析及离子交换层析的原理 了解其它分析分离方法 氨基酸概念： 教 通式： 学 两性解离： 氨基参与的反应： 分配层析及离子交换层析的原理 两性解离： 教学 氨基参与的反应： 难点 分配层析及离子交换层析的原理 教学过程 讲授结合多媒体课件 作业 P155习题之2,3、4.5、6
教学内容 导言 氨基酸是蛋白质的基本组成单位，有20多种，你调味使用的味精就是其中之 -一谷氨酸的钠盐。这20多种氨基酸都是谁？有何样的结构？我们如何提取氨 基酸？鉴定氨基酸？ 第三章氨基酸 第一节概述 一、概念 定义 基酸是蛋白质的构件分子（基本组成单位）。从细做到人类，所有蛋白质都山 20种标准氨基酸组成。 最先发现的是天门冬氨酸(1806年)，最后鉴定的是苏氨酸(1938年). 氨基酸品氨基取代牌酸， 氨基取代部位各种各样，BY6. 不标明的指氨基酸 á氨基酸的结构通式幻灯片4 主链侧链a碳原子a氨基α羧基 结构特点：除甘R-H外，a碳原子都是手性，所以有旋光性，有DL之分 除脯（亚氨基）外，都是氨基取代羧酸 都有（亚）氨基和羧基，所以都是两性分子，可两性解离，得两性离子 二、氨基酸的分类 共有180多种，D-,L:a、B、￥… 蛋白质中有20多种 叫蛋白质氨基酸L:a 分常见（编码） 20种 稀有（非编码》 几种（一般是编码者的修饰物，） P124表1举例 丙氨酸(alanine) Ala A 天冬氨酸(asparti) Asp D (要求堂捏)》 20种氨基酸的结构式幻灯片6、7、8、9、10 1、根据R的化学结构（掌握结构，至少结构特征） (1)脂肪族氨基酸： I)疏水性：Giy、Ala,Val,Lcu.e、Met、Cys: 2)极性：Arg、Lys、Asp、Glu、Asn、Gin,Ser、Thr
1)中性：Gly、Ala、al、Leu、le 2)含羟或硫：Ser,Thr:Cys、Met 3)酸性及其酰胺：Gu、Gln:Asp、As 4)性：Ag、Lys (2)芳香族氨基酸：Phe,Tyr、Tp (3)杂环氨基酸：His、Pro(杂环亚氨基酸) 2,根堀R的极性(pH7) (1)极性氨基酸： I)不带电：Gly、Ser、Thr、Asn、Gln、Tyr、Cys:(指pH7时大多个带电) 2)带正电：His、Lys、Arg: 3)带负电：Asp、Glu (2)非极性氨基酸： Val Leu Ile,phe,Met,Pro、Tp 不常见氨基酸、非蛋白质氨基酸自习 第二节氨基酸的性质 般物理性质 色 熔点极高(200℃以上)，不同味道：水中溶解度差别较大（极性和非极 性)，不溶于有机溶剂。 一、酸碱化学（两性解离）（重点、难点） 氨基酸在水溶液或品体状念附以两性离子的形式存在，既可作为酸（质子供体，又可 作为碳（质子受体）起作用，是两性电解质 其解离度与溶液的H有关。 1、氨基酸的两性离子形式 氨基酸在水溶液中或在晶体状念时主要以两性（兼性）离子形式存在。 证据：其熔点较高，接近离子化合物而远离酸、胺 可增加水的介电常数，即其溶液导电。 两性离子（见片4） 即带正电荷又带负电荷月正负电荷数相等的离子。 2、解离 AA± AA-十H+ AA±十H 4- 所以，一种氨基酸的水溶液中至少有4种离子。 将其完全质子化（盐酸盐形式），则： Ka Ka AA+-= AA±4H+ AA± AA-+H+ Ka=[AA±][H+]/[AA+] ① Ka2[AA-][H+]/[AA±] pH=pKa+lg [AA]/[AA+] 可见，Ka为解离一半时的H浓度
或者，pKm为解离一半时的溶液pH H=pKa十g碱/酸 或1g质子受体/质子供体 此式常用于计算给定H条件下，两种离子的比例 3、等电点(pD R 个 HaN"-CH-COOH H3N+-CH-COO H2N-CH-COO- 在酸性溶液中的氨基酸 在品体状态或 在碱性溶液中的氨基酸 水溶液中的氨基酸 pHpI 调节氨基酸溶液的pH,使氨基酸分子上的一NH3基和CO0基的解离程度完全相等 时，即所带净电荷为零，此时氨基酸所处溶液的pH值称为该氨基酸的等电点() 4、氨某酸等电点的确定： 1)酸碱滴定（滴定曲线）幻灯片17 2)根据pK值（该基团在此pH一半解离）计算： 推导 1tg K1+pk2)2 A+ Ka2【AM-]IH+]/【AA±] 两式相乘或从一式解出A±代入另一式 Ka1·Ka2-=[H+]2[AA-]/[AA+] 因为pI时[AA-]-[AA+] Kaj-Ka2 [H+]2 两边取负对数 pH=pI=1/2 pKa+pKa2) 或pl=l/2(pKa2十pKa3) 等电点等于两性离子两个K值的算术平均数 等电点等于两性离 两侧pK值的算术平均数 对于有3个解离基团的氨基酸，可能是1+2或2+3，计算时要指清 原则是氨基酸全部质子化后，K从小到大解离，因为1,2、3所指不定 经验：三个数据有两个接近，则和之二分之一。但半、组、酪例外 5、与甲醛的反应：氨基酸的甲醛滴定法 反应式幻灯片19
把氨基酸当酸，pK过低，滴定时无终点指示剂 把氮共酸当减，DK过高，滴定时无终点指示剂 用甲醛掩薇氨基，使之仅显酸性，可用酚酰为指示剂，用氧氧化钠滴定，为蛋碱滴弱 酸。简言之，就是把两性化合物转化为酸性化合物 二、氨基参加的反应（掌握） 1,与亚硝酸反应 NH OH +HNO2→ +H20+N2t R-CH-COOH R-CH-COOH 气体测量法定氮 称文司菜克法(Van Slyke) 2、与酰基化试剂反应 R-CH-COOH R'X R-CH-COOH +HX NH> NHR R '=酰基或磺酰基 X=卤素(C1、F) 常用试剂 卡(bian)氧甲酰氯丹磺酰氯(DNS) 反应式见幻灯片22 3、与烃基化试剂反应 R-CH-COOH R X ◆R-CH-COOH+HX NH> NHR R 烃基 X=卤素(C、F) 常见试剂2,4二硝基氟苯(DNFB/FDNA) 苯异硫氯酸醋(PTC) (1)与2,4二硝基氟苯DNFB)的反应 2,4二硝基氟苯十氨基酸 =2,4.二硝基苯-氨基酸十HF 叫桑格(Sanger)反应 用于测N端氨基酸 在弱碱性溶液中，氨基酸的。氨基很容易与FB作用生成稳定的黄色2，本二硝基率 氢基酸(DP氨基酸)，这一反应在蛋白质化学的酬究史上起过重要作用，Sanger等人应用 它测定陝岛素一级结构。 (2)与异硫氰酸苯指(PTC)的反应 反应式见片25 重复测定多链N端氨基酸排列顺序，设计出“多顺序自动分析仪 叫艾德曼反应(Edan) 4、与醛形成西佛碱 见氨基酸代谢 5、脱氨基作用 详见氨抹酸代读谢 脱氨牌 H2N-CHR-COOH NH3+RCOCOOH 三、羧基参加的反应（掌握）
1、成盐成反应 成盐反成 RCH-COOH NaOH RCH-COONa 掩做羧基，活化氨基 成断反应 R一CH一COOH+ROH R-CH-COOR NH NH 掩蔽羧基，活化氨基 2、成酰氯反应 Y-NH-CRH-COOH PCIs Y-NH-CRH-COCI +POCI3+HCI 酰化氨基酸 酰化氨基酰氯 Y掩蔽氨基，酰氧氯化后使氨基酸的羧基活化，易于另一氨基酸的氨基结合，在合成肽的 工作上常用。 3,脱按反应 H-N-CHR-COOH→CO+RCH-NH 4,迭氨反应 用干活化羧共 HN-CHR-COOH-YHN-CHR-COOH--YHN-CHR-COOCH:- 酞化氨基酸 酰化氨基酸甲酯 ①-→YHN-CHR-CO-NH-NH,→②YHN-CHR-CON3+2H,O 酰化氨基酸的肼衍生物 酰化氨基险迭氨 -N: 一N--N+=N ①+NH2NH2--CH3OL ②HNO2 5、成酰胺反应 有机公外： H2N-CHR-COOC2Hs+HNH2 →H2N-CHR-CONH2+CHOH 无水 有机体内： Asp (Glu)+NH Asn (Gln) Asn(Gln)合成酶 活化 羧基成酰氧(PC1,) 成益(NaOH 成叠氨（肼、亚硝酸） 成酯（醇） 氨基成盐(NaOH) 酰化（卞氧甲疏氯） 成酯（醇） 四、氨基羧基共同参加的反应 (掌握) 1、与茚二酮的反应 P0产生黄色物质，其它为蓝紫色。 在570mm(蓝紫色)或440mm(黄色)定量测定（几μg)
所有具有自山ā氨基的氨基酸与过量节二丽共热形成蓝紫色化合物（侧氨酸和羟脑氨 酸与带一酮反成立4黄色的质)。用分光光度法可定最定微最的氨基酸。蓝鬟色业合物的 最大吸收570m波长处，黄色在440m波长下测定。吸收峰值的大小与基酸释放的 氮量成正比 2、成肽反应 见代谢部分 五、侧链参加的反应（熟悉） 1。米伦反应 硝酸求及亚硝酸求混合物 红鱼 酪氨酸 2、黄色反应 浓硝酸及碱 桔黄色 苯丙 3、乙醛酸反应 乙醛酸及浓硫酸 紫色 色氨酸 4、酚试剂反应碱性硫酸铜、砖钨酸陵细酸 蓝色 酚、哚 格、色 5、坊口反应 a差畅、次溴酸钠 红鱼 爪 钻氨酸 6、Pay反应对氨基苯磺酸及亚硝酸钠 桔苗色 粉其 路氨酸 7、偶氮反应 同6 棕红色 咪唑 组氨酸 8,茚二酮反应 9、双猎脉反应 价酸铜、氢氧化钠 紫红色肽键等 肤等 1-8 为氨基酸颜色反应 】一7、9为蛋白质颜色反应 半胱氨酸的反应 半胱氨酸十二硫硝基苯甲酸 一硫硝基苯甲酸 pH8.0时硫硝基苯甲酸最大吸收为412m 用于测半或流基 六、氨基酸的光学性质（熟悉） 1光学活性 除甘外，都有手性。苏、异、胱等有两个 2、光谱性质 可见光区无吸收，所以，氨基酸无色 芳香族氨基酸共轭双键吸收紫外线，有紫外吸收 共轭双键 -C=C-C=C- 苯丙Xnax=257m路入max=275nm、色Xmax=280nm 蛋白质最大吸收在280mm 应用：测苯、形、色及含之蛋白质含量，称紫外吸收法紫外分光光度法。是分析 溶液中蛋白质帝量的快速简便的方法。 依据Lambert-Beer定律A=ecI A吸光度（光密度OD)。摩尔吸收系数摩尔消光系数 ,浓度(ml/L) 1光程(cm) 由于€是一个条件带数，与温度、气压、离子强度、机器、等因素有关 所以，测定时不能用~c】计算 一般用标准曲线来查得或与标准比例求得 A C/m 标雅曲线
第三节氨基酸的分析分离 常用方法有电泳、层析，电泳见蛋白质分房 一、分配层析（掌握） 回顾分配定律：当一种溶质在两种给定的互不相溶的溶剂（两相）系统中溶解（分配） 时，在一定温度下，溶质在两相中的浓度比值为一常数 此常数称为分配系数 分配系数 Kd=CA/CB 浓度比值 有效分配系数 Ken-CA'VA/CB VB KdRy 总量比值 逆流分溶（配） 用分配定律通过分溶（相）把混合溶质分开的方法 例1设X的Kd=1000,Y的Kd1/1000,A溶剂密度小于B 在分液漏斗中，XY混合物溶于AB等量混合液，摇匀静分层，把下层B分流于第二 容器 则第一容器中 X1000份 YI份 第二容器中 X1份 Y1000份 XY基本分离 例2物质ZKd3,64份Z转移4次的分配过程及结果 动化过程见片40 上述过程中， 始终有一相一直留在原器血中(3相入称之为固定相 始终有一相移到+1器皿中(A相)，称之为流动相。 转移n次后第K(≤n)号器皿中某一物质的含量为 n!p(n-k+1)·q(k-1) Tn,k (n-k+1)(k-1)! P是某物质在固定相中的比例 q是某物质在流动相中的比例 把上述过程搞成一个连续的自动过程就是分配层系。 分配层析 用我体周定周定相并作为流动相支持物，流动相向前流动过程中，溶质在两相依分配系 数不断分配、流动，使得分配系数个不同的混合溶质彼此分开的方法。 载体 常用纤维素，淀粉、硅胶等 固定相常用水 通过氢键被载体固定 流动相常用与水不互溶的、与载体无亲和力的有机溶剂 按载体的状态，分柱层析 载体装干玻管中成柱状 薄层层村 玻板成片层 纸层「等 用滤纸作为载体，纤维素预制的薄层 具体操作方法见实验 二、离子交换层析（掌握）
是一种利用离子交换树脂作支持物，利用溶质与树脂亲和力不同而被顺次洗脱下来，使 得混合溶质彼此分离的方法。 离子交换树脂分阳/阴两种，分别与同性电荷的溶质颗粒交换，然后改变pH质，即改 变溶质电荷性质，使之从树脂上脱离。山于个同溶质与树脂亲和力（静电引力和亲水性）不 同，脱离的次序则异，达到分离目的。 例谷、丝、丙、赖混合液。 (谷p3.22、丝pI5.68、丙pl6.02、赖pI9.74) 用阳离子树脂分离 用阴离子树脂分离 调pH全2全带正电荷 调pH全I1 全带负电荷 +谷一树一丝+ 一谷-树-丝 +丙一脂一赖+ 一丙-脂。赖 用pH4缓冲液洗脱谷脱离 用pH8缓冲液洗脱 赖脱离 用pH7缓冲液洗脱丝先脱离 用pH5缓冲液洗脱 丙先 丙后脱离 丝后 用pH11缓冲液洗脱赖脱离 用pH2缓冲液洗脱 谷脱离 综上，洗脱顺序首先是电荷相反者，电荷相同者亲水的优先 三、气液层析 当层析系统的流动佣为气体，固定相为涂渍在固体顺拉表面的液体时，叫气液层析或气 液色谱或气用层析或气相色谱 四、高效（压）液相层析HPLC 固定相烦粒很细并压的层析技术