《生物化学》教案 授课题目 学时安排 第四章 蛋白质共价结构 4学时 学握蛋白质的化学组成、结构层次：肽及肽键等相关概 念：蛋白质测序策略；末端鉴定：二硫键断裂：多肽链 目 的断裂：二硫键位置的确定 香 熟悉蛋白质功能多样性。 了解蛋白质的分子形状和大小、氨基酸组成分析、多肽 链的性质及分离、短肽序列测定、短妝在肽链中位置的 确定。 肽和肽健、肽的性质 举 级结构测定策略 议 末端测定 二硫键断裂 多妆链的断裂 肽的性质 教学 末端测定 难点 多肽链的断裂 教学过程 讲授结合多媒体课件 作业 P194习题之2、3、4
教学内容 导言 100年前，恩格斯指出“蛋白体是生命的存在形式”；今天人们如何认识蛋白质的概念 和重要性？ 1839年荷兰化学家马尔德(G.J.Mu1er)研究了乳和蛋中的清蛋白，并按瑞，典化学家 Berzelius的提议把提取的物质命名为蛋白质(Protein,源自希腊语，意指“第一重要 的” 单细胞的大肠杆菌含有3000多种蛋白质，而人体有10万种以上结构和功能各异的蛋白 质，人体干重的45%是蛋白质。生命是物质运动的高级形式，是通过蛋白质的多种功能来实 现的。新陈代谢的所有的化学反应儿乎都是在酶的催化下进行的，已发现的酶绝大多致是蛋 白陆生命活动所需要的许多小、分子物质和离子，它们的运给由蛋白质夹密成生场的运动 生物体的防御体系离不开蛋白质。 蛋白质在遗传信息的控制、细胞膜的通透性，以及高等动 物的记比，识别机构等方面都起着重要的作用，随着蛋白质工程和蛋白质组学的兴起和发展， 人们对蛋白质的结构与功能的认识越来越深刻。 第四章蛋白质的共价结构 第一节通论 蛋白质是山20多种ā-氨基酸按一定的序列通过肽键（酰胺键）缩合而成的，具有较 稳定的构象并具有一定生物功能的大分子。 ”化学结构 一级结构 共价结构 加结构 蛋白质结构 立体结构 二级结构 空间结构 然结构 构象 四级结构 高级结构 一、元素组成和分类（掌握） 元素组成 C(50-55%)、H(68%)、0(20-23%)、N(15-18%)、S(0-4%)、 有些蛋白质还合微量的RP,C、、h、 元素组成特点 N的含量平均为16% 各种蛋白质的含氨量很接近，半均为16。因此，可以用定氨法米指算样品中蛋白质的 大致含量。 凯氏(Kjadehl)定氮法的理论基础蛋白质含量=蛋白氨×6.25 分类 蛋白质分广泛，种 为繁多 有1010种.目 E法蛋白质的化学结构 行精确的分类，一般按蛋白质的分子组成，生物功能、分子形犹进行分类■
,清蛋白 球蛋白 谷蛋白 简单蛋白 醇溶蛋白 (按溶辉度 组甄日 鱼粘蛋白 硬蛋白 据分子组成 触蛋白 脂蛋白 核蛋 结合蛋白 跳蛋白 (按辅基) 个屁蛋白 血红素蛋白 黄素蛋白 简单蛋白、结合蛋白具体内容见p158表1、2 要求分出类，举出例 简单蛋白质完全水解的产物仪为-氯基酸。这类蛋白质按其溶解度等理化性质分为7 类。包活清白、球：白，醇湾蛋白，谷蛋白，清蛋白、组蛋白和硬蛋白。 结合蛋白质山简单蛋白质和非蛋白质（铺基）组成。根据辅基的不，这类蛋白质可 分为5类。如蛋白 蛋白、脂蛋白 色蛋白和磷蛋白 翔胞核中的核蛋白是DNA与组蛋白结合而成，钢胞质中的核帮体是NA与蛋白质组 成的，已知的病青也是核蛋白。免婆球蛋白是一类游蛋白，山蛋白质与以共价键用连而成： 脂蛋白山蛋白质与脂类通过非共价键阴连，存布生物膜和动物血浆中。 按蛋白质功能分为活性蛋质和非活性蛋白质 活性蛋白质包括有催化功能的酶、有调节功能的激素、有运动、防御、接受和传递信息 的蛋白质以及毒蛋白、膜蛋白等。胶原、角蛋白、弹性蛋白、丝心蛋白等是非活性蛋白质 二、分子形状和大小（了解） 蛋白质形状球状蛋白 长轴/短轴≤5 纤维状蛋白 长轴/短轴>5 大 小 相对分子质量10 106 氨基酸残基相对分子质量以110计 氨基酸相对分子质量以128计 三、构象与结构层次（掌握） 蛋白质是具有特定天然空间结构的大分子，其空问结构称为蛋白质的构象 蛋白质结构很复杂，为研究方便，分为若干层次： 一级(1°)结构 排列顺序 二级(2°)结构 肽链缠绕或折叠所得构象主链 结构蛋白最高级 级(3)结构 二级单位折叠所得球状结构侧链 单体蛋白最高级 四级(4)结构 三级单位聚合所得构象侧链 暴聚蛋日特有
四、功能多样性（熟悉） 理论上无数，估计在1010一10 如由20种氨基酸每种 ，组成20肚，有20！-2×10“种 不限个数，组成20肚，有20”种 功能多样性决定于分子多样性 功能多样性决定生命现象多样相 五、蛋白质的生物学意义（掌握》 是生物体的基本结构物质 是生命现象的体现者 」、结构 结构蛋白：胶原蛋白、蛋白聚袖 2、催化 调节 调节蛋白 4转运 转运蛋白、授体、转位牌 5、运动 收缩蛋白、游动蛋白 6、支架 支架蛋白： 7、防和讲 保护/开发蛋白（抗体、干扰素、毒蛋白）、抗冻蛋白 8、异功能 节肢弹性蛋白、胶质蛋白 9、记忆、识别机构 10,贮存 卵请蛋白，酪蛋白，铁蛋白 第二节肽 一、肽和肽键（重点） ,个氨基酸的a羧基和另一个氨基酸的ū氨基脱水缩合而成的化合物。 氨基酸之间脱水后形成的键称肽键（酰胺链）。 H2N-CH-CO NH-CH-COOH -H20 RI 二硫键 一S一S一两个半胱氨酸之间形成 氨基木端 羧基木端 HNH-CH-CO-HN-CH-CO-HN-CH-CO OH 主链 RI Rn 侧链 氨基酸残基 二肤、三肽、…十（二）肤、 寡肽（小干20）.多肽（链） 名其氨陆某氨睛 其氨基形 氨基酸之间用“表示队键 H2N-丝氨酸-亮氨酸-苯丙氨酸-C00H Ser-Lew-Phe或(S-L-F) 丝氨酰亮氨酰苯丙氨基酸
肽健性质有部分双键性质，不可旋转为反式结构（不同基团在相同基团的两侧） N原子孤电子对与羧基碳杂化，肽键是单键 与羧基氧杂化，弘键是双键 酰胺平面、队平面、肽基平面 肽链两个原子及与之相连的4个原子共处的半面 服笼及其两端的a(共6个原子处于同一半面上，组成了肽单位（所在的半面称以键 队键C-V键长为0132m,比相的单键(017m)短，而较CY双键(0.12Sm， 长，有部分双耀的性质，木能自山旋转。服腿光面上各原子星颜反异构关系，艇半面上的 0.H以收2个a-碳原子为反式构型(ans configuration. 主辩中的C▣一C和C口一V单键可以旋转，其旋转角中，决定了两个相邻的烈键 面对关系。山于继半面的对旋转，使主链可以以非常多的构象出现。事实上，链在 构象上受到限大限制 因为主链上 13不能自山转的笔，另外链上有根多侧链R 的影啊。蛋白质的主链骨架山许多耿键平面连接而成。 二、肽的性质（了解） 解离短肤基木同氨基酸的 有二酮反应 有双指际反应 三、天然活性肽（了解） 谷胱甘肽(GSH) ￥谷氨酰半优氨洗甘氨酸 Gs SO 先基统基保护剂 是G,Gs,组成的一种，又叫r-含氨半 Gs的-S训是主婴功能基团，洲是一种抗氧化剂，是某些梅的械梅，可保护蛋白质分子叶 的-SH免遭氧化，保护旅基蛋白和南的活性。在H过氧化物游的作用下，CSH还原细胞内 产生的H22,生成20,2分子GSH放氧化成GS5G,后者在GSH还原薄催化下，又生成GS, 胰高血糖素 山胰岛▣-细胞分泌(B-细胞分泌胰岛素)，29肽。 高血 察调节维持血 农度 脑啡 脑啡肽具有强烈的镇痛作用（强于吗啡），不上瘾。 Met-脑啡肽TIyr-Gly-Gly-Phe-Met Lew-脑啡耿TyT-Gly-Gy-Phe-Leu 催产素和升压素 均为9肽，第3位和第9位氨基酸不同。 催产素使子宫和乳腺平滑肌收缩，具有催产和促使乳腺排乳作用。 升压素促进血管半滑肌收绪，升高血压，减少排尿 人体内有许多激素属察队或多耿，下正脑一垂体分泌的催产素(9肽入、创压素(9 耿人、促肾上腕皮质激素(AC7M,39队)等。催产素和加压素结构仪第3，第8位两个氯基
酸线基不同，前者使半滑贩收翁，有徙产和使乳隙泌乳的作用后者能使小动獻收翁，增高 血压，也有少排尿的作用。 神经是车冲经传导过程中起信号转导作用的服。啡(5)、B-内啡(3引 人、强啡胜(17肽)等，随若蓝科学的发展，会发现必多的生物活性肤。 第三节一级结构的测定 蛋白质是生物大分子，结构比较复杂，人们用4个层次来描述，包括蛋白质的一级， 级、一级和四线结构。一级结构描述的是茧白质的线性（或一维）结构，即共价连按的氨琴 酸线基的疗列，又称制级或化学结构.。二级以上的结构称高线结构或构象(conformation. 1953年，处国科学家Sanger首先测定了陕，岛素(insulin)的一级结构，有51个氢 基酸残基，山一条A链和一条B链组成，分子中共有3个二硫魅，其中两个本A、B菇之间， 牛胰岛素的化学结构见幻灯片15 一、测定策略（重点） 1、测多肽数目 2、拆分多以储 3、断裂二硫键 4、分析组分 5、鉴定木端 两种方法裂解成小片断 7、测定各小片断序列 8、拼凑一级结构 9、确定二硫键位置 目m,国际互联州蛋白质数据座已有3干多种一级结构清楚。 二、末端测定（重点、难点） 1、氨基木端 二硝基氟苯法 标记末端，水解，分离鉴定黄色DNP-AA 丹磺酰氯法 同上，灵敏、简便 苯异硫氢酸酯法加成，成环税离多肽，余肤可继续，用于测序 陆法 2、羧基木端 肼解法 H2N-NHz 碳端氨基酸游离，其他为氢基酰肼 还原法硼氢化锂还原α羧基成醇，再完全水解 羧肽酶法A 非Pro、Arg.Lys B 只Arg.Lys
三、断裂二硫桥（重点） 先变性 8M尿素或6M盐酸 再断裂 基乙醇还原其为一SH,再用碘乙酸烷化防其重新成二碗键 四、组成分析（了解） 完全水解酸水解（破坏全部色、部分羟基氨基酸及酰胺键） 6MHC1110C真空10-24H. 碱水解（定量色.）5 MNaOH110PC真空20H 再测氨基酸含量氨基酸仪、层析、电泳 五、部分裂解和分离纯化（重点、难点） 肤链过长，无法测序，所以先裂解之。 般用两套方法裂解，再拼接 、牌法裂解 映蛋白醇 精、赖骏基端肽 摩蛋白腾 苯丙、酪、色酸基端默键 嗜热菌蛋白南 同度但为氨基端以键 至少堂据前三个 葡萄球南蛋白密 谷、天酸堪端秋键 梭菌蛋白悔 精羧基端肚键 2、化学法裂解 溴化氟 蛋羧基端肽健 蛋氨酸交成高丝氨酸内酯 羟按 天胺甘之间 天胺变成天胺二酰羟胺 3、分离电泳、层析等 六、肽段测序（了解） 艾德曼降解法 梅解法 质谱法 核苷酸序列推定法 七、顺序决定（了解》 一个氨基木端为 个羧基术端为20，无二硫键，组成为1~20，裂解并测序后得 一套切5及其倍数，得4段 12345 678910 11121314151617181920 二套切6及其倍数，得4段 123456 789101112 1314151617181920 12345 1920 123456 1617181920 678910 131415161718 7891011L2 112131415 1234567891012121314151617181920 八、二硫键位置的确定（掌握）
对角线电泳法 陶解肽链，纸电泳，用过甲酸蒸汽熏蒸滤纸，然后垂直方向二次电泳，则含二键 的肽段成两个斑点，确定其顺子后，和上步的顺 对照 例123456 789101112 13141516171819 经鉴定， A顺字为789101112 B顺序为131415161718 C1顺序为123450 C2顺序为1920 5、10,20为半胱氨酸 所以，5、20之间成二硫键 九、测序举例 有一个A肤：①经酸解分析得知山Lys,His,Asp,Glu2、Ala及al、Tyr和两个NH3 分子组成。②当A肽与FDNB试剂反应后，得DNP-Asp:当用羧队酶处理后得游离缬氨酸。 ③用映蛋白酶降解时，得两种肽，其一(Ly、Asp、Gu、Aa、Tr)在pH6.4时，净电荷 为零，④另一(His、Gu、al)可给出DNP-His,在pH6.4时，带正电荷。⑤用糜蛋白 降解也得两种肽，其一(Asp、Aa、Tyr)在pH6.4时呈中性，@另一(Lys、His、Glu2、 阳1)在pH6.4时，带正电荷。问A肽的氨基酸序列何？ ①为8肽，两个酰胺。 N端为 sp:C端为al ③该片段为Asp-Glu,Aal,Tvr-Lys:有一酰胺。 ④该片段为His-Glu-Val:有一酰胺，为His-GlnVal。 ⑤该片段为Asp-Ala-Tyr,有一酰胺，为AsrA1aTyr @该片段为s、Glu-HisG1ul,有一酰胺， 据④为s,Glu-His-Gln-Val 综上 ②N端 Asp Val C端 Asn-Ala-Tyr ④His-Gln Val AspAal-Tyr-Glu-Lys GluLys-His:GlnVal AsnAla-Tyr-Glu-Lys His-Gln-Va 第四节肽链人工合成 一、概述（熟悉） 氨基酸1掩蔽氨基，活化羧基：氨基酸2掩蔽羧基：1、2的R基团的官能团也需掩蔽 Al A2 ↓ 掩蔽激活
Y-HN-A1-CO-X+H2N-A2-CO-Z R-M R-N ↓缩合 Y-HN-A1-CO-HN-A2-CO-Z R-M R-N ↓除去ā羧基掩蔽剂，改为活化剂 Y-HN-A1-CO-HN-A2-CO-X R-M R-N ↓掩蔽羧基的氨基酸 ↓缩合 ↓除去a羧基掩蔽剂，改为活化剂 三步循环 ↓除去所有掩蔽剂 多肽 此合成方法的方向是从氨基端到羧基端 基团的掩蔽激活见氨基酸性质。 除去方法主要有皂化、透析等 二、胰岛素人工合成（了解） 1965年，中国， 意义：理论上突破了生物大分子不能人工合成的观念， 实践上为人工合成多肽类药物开擗了广阔的前景 三、固相肽合成（了解） 在人工合成多耿的过程中，每连接一个氨基酸后，都要进行多耿分离，然后再进行下一 步。 固相肽合成是把多肽连接在一种树脂上，连接一个氨基酸后只需洗脱小分子物即可进行 下一步，极大地减轻了工作强度。 方法是把第一个氨基酸的羧基连在树脂上，然后加掩蔽了氨基的氨基酸，缩合后洗脱氨 基酸，再加第二个，…最后从树脂上水解多肽。 固相肽合成方向是从羧基端到氨基端。所以，要合成甘丙赖，应先把赖连在树脂上，加 丙，缩合，洗脱，再加甘，缩合，洗脱，最后从树脂上水解多肽