第四章 核酸杂交技术 肖代敏 遵义医科大学检验医学院 临床分子生物学检验技术
教学要求 1 掌握 核酸杂交的基本原理 2 掌握 核酸探针、核酸分子杂交的类型 3 熟悉 影响核酸分子杂交的因素 4 了解 影响核酸分子杂交的因素 5 自学基因芯片技术 临床分子生物学检验技术
教学要求 1 2 4 3 5
第一节核酸分子杂交 核酸分子杂交技术：利用核酸分子杂交检测靶序列的一 类技术称核酸分子杂交技术。核酸分子杂交技术目前广泛应 用于分子生物学、生物化学、病毒检测、疾病诊断、基因工 程等学科领域中，是定性或定量检测特异RNA或DNA序列片 段的有力工具。 N 变性 复性 八N八 杂化双链 NNN 临床分子生物学检验技术
第一节 核酸分子杂交 变性 复性 杂 化 双 链
利用形成异质双链的这一原理， 用已知序列的单链核酸片段作为探针， 去查找各种不同来源的基因组DNA分 子中的同源基因或同源序列
利用形成异质双链的这一原理， 用已知序列的单链核酸片段作为探针， 去查找各种不同来源的基因组DNA分 子中的同源基因或同源序列
核酸探针 探针(probe).: 在核酸分子杂交实验室中，与特定的靶分子特异性 结合的能被检测的特定核苷酸序列。 选择探针的最基本的要求： 。高度特异性 标记荧光染料 。 探针的来源是否方便 DNA探针 ·制备探针的难易程度 变性&杂交 临床分子生物学检验技术
一、核酸探针 • 高度特异性 • 探针的来源是否方便 • 制备探针的难易程度
(一)核酸探针的种类 从理论上说，任何一种核酸，如双链DNA、单链DNA、 寡核苷酸、mRNA以及总RNA,均可以作为探针使用。 1.基因组DNA探针 2.cDNA探针 3.RNA探针 4.寡核苷酸探针 prob 临床分子生物学检验技术
从理论上说，任何一种核酸，如双链DNA、单链DNA、 寡核苷酸、mRNA以及总RNA，均可以作为探针使用。 1.基因组DNA探针 2.cDNA探针 3.RNA探针 4.寡核苷酸探针
1、DNA探针 三大优点： ① 这类探针大多克隆在质粒载体中，可以无限繁殖，制 备方法简便； ② DNA探针相对不易被降解，一般DNA酶活性能有效地被 抑制 ③DNA探针的标记方法较成熟，有多种方法可供选择， 如缺口平移法、随机引物法、PC标记法等，能用于放射性核素和 非放射性物质标记。 临床分子生物学检验技术
1、DNA探针
基因组DNA探针 来源： 这类探针来源于某种生物的基因组，多为某一基因的全 部或部分序列。 制备方法： -基因克隆的方法 -聚合酶链反应(PCR) 特点： -克隆在载体中的DNA片段，可无限繁殖，取之不尽 一PCR制备探针简便和省时 -相对RNA而言，DNA探针不易降解，标记方法也较成熟 临床分子生物学检验技术
基因组DNA探针 来源： 这类探针来源于某种生物的基因组，多为某一基因的全 部或部分序列。 制备方法: – 基因克隆的方法 – 聚合酶链反应(PCR) 特点: – 克隆在载体中的DNA片段，可无限繁殖，取之不尽 – PCR制备探针简便和省时 – 相对RNA而言，DNA探针不易降解，标记方法也较成熟
cDNA探针 cDNA (complementary DNA): 是指与mRNA互补的DNA分子，是由RNA经过逆转 录酶催化产生的逆转录产物。 特点： Reporter and quencher-marked 不存在内含子和高度重复序列， probe 是一种较理想的核酸探针，尤其 是用于基因表达的研究； 排除了RNA酶的影响，现己 成为分子生物学实验室的常规 Target DNA strand hybridized with probe 实验。 临床分子生物学检验技术
cDNA探针 cDNA（complementary DNA）： 是指与mRNA互补的DNA分子，是由RNA经过逆转 录酶催化产生的逆转录产物。 特点: 不存在内含子和高度重复序列， 是一种较理想的核酸探针，尤其 是用于基因表达的研究； 排除了RNA酶的影响，现已 成为分子生物学实验室的常规 实验
2.RNA探针 ·RNA探针与靶序列的杂交效率较高，稳定性也高 -NA分子大多以单链形式存在，几乎不存在互补双链的竞争结合 ·RNA分子中不存在高度重复序列，非特异性杂交少，杂交后未 杂交的探针分子可用RNA酶水解去除，本底的千扰低。 ·RNA探针有易降解和标记方法复杂等缺点，限制了其广泛应用。 mRNA Capture Reporter Probes 临床分子生物学检验技术
2.RNA探针 • RNA探针与靶序列的杂交效率较高，稳定性也高 – RNA分子大多以单链形式存在，几乎不存在互补双链的竞争结合 • RNA分子中不存在高度重复序列，非特异性杂交少，杂交后未 杂交的探针分子可用RNA酶水解去除，本底的干扰低。 • RNA探针有易降解和标记方法复杂等缺点，限制了其广泛应用