学科命生学N蛋白质纯化系统SCIENCESAKTApurifier杨春燕厦门大学生命科学学院厦门大名止干至姜格王典
自强不息 止于至善 2 杨春燕 厦门大学生命科学学院 蛋白质纯化系统 AKTApurifier
运用AKTA蛋白纯化系统进行蛋白的分离纯化AKTA系统的介绍（视频）系统组成和系统流路蛋白分离纯化策略层析原理和纯化柱选择牛血清白蛋白（BSA）的脱盐实验（视频3实验流程、操作演示、注意事项碱性磷酸酶的分子筛实验4实验流程和注意事项A5思考题唐门大了止干至姜光电
自强不息 止于至善 AKTA系统的介绍（视频） 系统组成和系统流路 1 2 蛋白分离纯化策略 层析原理和纯化柱选择 3 牛血清白蛋白（BSA）的脱盐实验（视频） 实验流程、操作演示、注意事项 5 思考题 运用AKTA蛋白纯化系统进行蛋白的分离纯化 4 碱性磷酸酶的分子筛实验 实验流程和注意事项
AKTA系统介绍唐门大了止干至姜格工典
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蛋白分离纯化策略唐门大了止干至姜格工典
自强不息 止于至善 蛋白分离纯化策略
学科命生学五种层析类型来ALARSCIENCESXI离子交换疏水层析lon ExchangeHydrophobic interaction分子筛亲和层析反相层析Gel FiltrationAffinity0离子交换层析是一种吸附层疏水层析是一种液相吸附层析，根据带电荷的分子和层析系，它是依据生物分子之间填料上相反电荷之间可逆的的疏水性的差别来进行分离的。相互作用进行分离反相层析根据分子疏水性的根据分子的大小不同来分离亲和层析是一种通过生物分子不同进行分离。但是反相层的，大分子由于进入不到填之间的特异性的相互作用来分析介质的表面通常比疏水层料孔径内，走的路径短所以离物质的层析方法.如酶和底物析介质的疏水性更强，因此先从层析柱中流出来，小分抗原与抗体的非常专一的相需要用非极性的有机溶剂比互作用。将配基固定在填料上子相反。如乙睛或甲醇进行洗脱。用就可以结合相应的生物分子于纯化和分析蛋白、肽和享，再采用合适的方法使之解离核苷酸。唐门大了止干至姜鑫子典
自强不息 止于至善 五种层析类型 Gel Filtration Ion Exchange Affinity Hydrophobic interaction Reversed phase 根据分子的大小不同来分离 的，大分子由于进入不到填 料孔径内，走的路径短所以 先从层析柱中流出来，小分 子相反。 离子交换层析是一种吸附层 析,根据带电荷的分子和层析 填料上相反电荷之间可逆的 相互作用进行分离. 亲和层析是一种通过生物分子 之间的特异性的相互作用来分 离物质的层析方法.如酶和底物 、抗原与抗体的非常专一的相 互作用。将配基固定在填料上 ，就可以结合相应的生物分子 ，再采用合适的方法使之解离 。 疏水层析是一种液相吸附层 系，它是依据生物分子之间 的疏水性的差别来进行分离 的。 反相层析根据分子疏水性的 不同进行分离。 但是反相层 析介质的表面通常比疏水层 析介质的疏水性更强， 因此 需要用非极性的有机溶剂比 如乙腈或甲醇进行洗脱。 用 于纯化和分析蛋白、肽和寡 核苷酸
纯化柱的选择Superdex200分析型分子筛柱位阀凝胶过滤层析分子筛）Gel Filtration脱盐柱Hitrapn5mlDesatting唐门大了止干至姜糯无典
自强不息 止于至善 纯化柱的选择 Gel Filtration 脱盐柱 Superdex200 分析型分子筛 柱位阀
科命生学分子筛（凝胶过滤层析）格1.Sphericalparticlespacked intoa column.根据分子的大小不同来分离的，大分子由于进入不到填料孔径内，走的路径短所3以先从层析柱中2.Sampleapplied.3.Buffer(mobilephase)andsample4.Largemoleculesleavethecolumn流出来，小分子firstfollowedbysmallermoleculesinmovethroughcolumn.Moleculesdiffuseinandoutofmatrixorderofsize.Moleculeslargerthanthe相反。matrixporespassstraightthroughiDsionot废门大王强子典止干至1
自强不息 止于至善 1. Spherical particles packed into a column. 2. Sample applied. 3. Buffer (mobile phase) and sample move through column. Molecules diffuse in and out of matrix 4. Large molecules leave the column first followed by smaller molecules in order of size. Molecules larger than the matrix pores pass straight through. Diffusion Buffer Diffusion into the pores Diffusion out of the pores Buffer 分子筛（凝胶过滤层析） 根据分子的大小 不同来分离的， 大分子由于进入 不到填料孔径内 ，走的路径短所 以先从层析柱中 流出来，小分子 相反
ForverysmallFor peptides and globularForlargermoleculesmoleculesproteinsorparticles1k100k10k1000k102103104105106107108SuperdexPeptideSuperdex 30prepgradeSuperdercpreegedSuperdex 200 prep grade不同填料有Sephacryl S-100High ResoluticSephacrytS-200HighResotutionSephacryS-3ooHioh Reso特定的分离SephacryfS-400HighResoiutioephacryiS-500HighResolutionSephacryi S-1000S范围Sepharose6FastFlowSepharose 4Fast FiowSepharose CL-28Sepharose CL-4BSepharoseCL-68Superose6Superose12Sephadex G-10Sephadex G-15SephadexG25FS-超圳SephatexG-25MSephadexG-25CF-SephedixG-25SFM-中SephadexG-50FSephadex G-50MC=粗Sephadex G-50 CSephadexG-50SSephadexG-75Sephadex G-75 SFSephadex G-100SephadexG-100SFSephadex G-150唐门大了止干舌真光电
自强不息 止于至善 1k 10k 100k 1000k 不同填料有 特定的分离 范围
Superdex200过柱流速的选择分析型分子筛脱盐柱HTrap5ml根据纯化柱说明书进行Desalting选择5 ml柱：一般5 ml/minColumn dataTable 1. HiTrap Desalting characteristicsMotrixComposite of cross-linked ogorose ond dextronMatrixSephadex G-25 Superfine.Bed dimensions10300310mmcross-linked dextranBedvolumeApproximotely 24 ml1ml柱：一般1ml/minSeparation mechanismAccordingtosizeColumn efficiency, N/M>30 000m13 jmColumn volume5mlAverage ParticleSizepH stobility rongeColumn dimension1.6 ×2.5 cm181regularustVoid volume1.5 mlcleaningTemperotureRecommended sample volume0.1-1.5ml分析型分子筛4 *C to 40 *Coperoting1.3-4.0×applied volumeSompledilution,syringeoperation4°Cto30*CstorogeM.5000Exclusion limitSuperdex75Superdex 2000.5-1 ml/minBeadsize15-70μmExcusion limit, M,Approx.1×10%Approx13×10mglobudlor proteinsMaximumflow rote*15ml/minOptimumseporation.tonge1-10 ml/minRecommendedflowrote*3 00070 00010 000600 000alobulorproteins,MBack pressureat10 ml/min*0.25 bardextrons50030 0001000100 000Maximum backpressure3 bor,0.3 MPoFlow rate (water at room temperaturel)制备型分子筛0.5-10 m/min0.25-0.75 ml/minrecommendedAllcommonlyused buffersChemicalstabilitymoximun1.5ml/min1ml/min2-13pH stobility.short ond long termPressure over columrStorage20% ethanol4ml/min1.,8 MPo, 18 bor, 261 psi1.5 MPo,15 bor, 218 psimaiimum度门大王止干至美招子电
自强不息 止于至善 过柱流速的选择 • 根据纯化柱说明书进行 选择 • 5 ml柱：一般5 ml/min • 1 ml柱：一般1 ml/min • 分析型分子筛 0.5-1 ml/min • 制备型分子筛 4ml/min 脱盐柱 Superdex200 分析型分子筛
上样方式·上样环：0.01~5ml上样环?超级上样环：1ml~150ml上样泵系统泵·上样泵：0.5~1L·系统泵：>50ml废门大王强不息上干至善
自强不息 止于至善 上样方式 •上样环：0.01~5ml •超级上样环: 1ml~150ml •上样泵: 0.5~1L •系统泵: >50ml 系统泵 上样环 上样泵