实验十四碱性磷酸酶米氏常数的测定石艳废门大#自强不息止于至善
自强不息 止于至善 实验十四 碱性磷酸酶米氏常数的测定
科命生一、目的要求景SCE1.学习分光光度法测定的原理和方法2.学习和掌握米氏常数（Km）及最大反应速度（Vm）的测定原理和方法，测出碱性磷酸酶在以对硝基苯酚磷酸为底物时的Km和Vm值。唇门大学自强不息止于至善
自强不息 止于至善 一、目的要求 1.学习分光光度法测定的原理和方法 2.学习和掌握米氏常数（Km）及最大反应速度（Vm）的测定原 理和方法，测出碱性磷酸酶在以对硝基苯酚磷酸为底物时的 Km 和Vm值
科命生学二、 原理来酶促反应v-[S]曲线Vmax [S]VoV-maVoKm(uru/rl)AAVmaxKm[S] (mM)推导出米氏方程为：Vm[S]1Km +[S]其中[S]为底物浓度；v为初速度；Vm为最大反应速度；Km为米氏常数废门大子自强不息止于至善
自强不息 止于至善 二、原理 酶促反应v-[S]曲线 推导出米氏方程为： 其中[S]为底物浓度；v为初速度；Vm为最大反应速度；Km 为 米氏常数 [ ] [ ] K S V S v m m
科命生学来动力学参数的测定1Vmax[S]VVmaxmax2Km + [S]2Km=[S]Km[S]Km值等于酶促反应速度为最大反应速度一半时的底物浓度，单位是浓度单位。废门大自强不息止于至善
自强不息 止于至善 Km ＝[S] Km值等于酶促反应速度为最大反应速度一半时 的底物浓度，单位是浓度单位。 2 ＝ Km + [S] Vmax Vmax[S] Vmax v Km [S] Vmax/2 动力学参数的测定
米氏常数Km是酶的一个基本特征常数，它包含着酶与底物结合和解离的性质。特别是同一种酶能够作用于几种不同底物时，米氏常数K?往往可以反映出酶与各种底物的亲和力的强弱。测定Km和Vm/可通过作图法求得。最常用的Lineweaver-Burk双倒数作图法。这个方法是将米氏方程转化为倒数形式，即：TS1m以1/对1/[S1作图，可得一条直线废门大子自强不息止于至善
自强不息 止于至善 米氏常数Km是酶的一个基本特征常数，它包含着 酶与底物结合和解离的性质。特别是同一种酶能够作 用于几种不同底物时，米氏常数Km往往可以反映出 酶与各种底物的亲和力的强弱。 测定Km和Vm，可通过作图法求得。 最常用的 Lineweaver-Burk双倒数作图法。这个方法是将米氏 方程转化为倒数形式，即： 以1/v对1/[S]作图，可得一条直线 m m m V S V K v 1 [ ] 1 1
科命生典Slope=Km/Vmax1 / V1Intercept=1/VmaxIntercept=-1/KmSH01 /[S]口本实验测定碱性磷酸酶催化对硝基苯磷酸钠盐(pNPP)水解的Km和 VmpNP+HPO42口反应式：pNPP+H2O黄色无色可通过分光光度法测定产物pNP的含量，求出反应速度v。度门大学自强不息止于至善
自强不息 止于至善 本实验测定碱性磷酸酶催化对硝基苯磷酸钠盐 (pNPP)水解的Km和Vm. 反应式：pNPP+H2O pNP+HPO4 2- 无色 黄色 可通过分光光度法测定产物pNP的含量，求出反应速度v。 m m m V S V K v 1 [ ] 1 1
科命生三、试剂与器材试剂:0.5μmol/mL pNP 、10 mmol/L pNPP、20mmol/L MgCl2、0.1 mol/L 碳酸钠一碳酸氢钠pH 10.1缓冲液、0.1 mol/L NaOH、实验十一制备的碱性磷酸酶粗酶液*器材：恒温水浴锅、722分光光度计Q.为什么可以用碱性磷酸酶粗酶液测定米氏常数?废门大自强不息止于至善
自强不息 止于至善 三、试剂与器材 试剂： 0.5mol/mL pNP 、10 mmol/L pNPP、20 mmol/L MgCl2、0.1 mol/L 碳酸钠—碳酸氢钠 pH 10.1缓冲液、0.1 mol/L NaOH、实验十一制 备的碱性磷酸酶粗酶液* 器材：恒温水浴锅、722分光光度计 Q.为什么可以用碱性磷酸酶粗酶液测定米氏常数？
四、操作方法（一）对硝基苯酚标准曲线的制作：取15支试管编号，0号一支，1－7号各二支，按下列表格操作5管号23701460pNP含量(μumol)0.050.100.150.200.250.300.3500.10.20.30.40.50.60.70.5μmol/mL pNP (mL)0.80.70.60.50.40.30.20.1HO (mL)各管加入1.0mLNa,CO3-NaHCO, (mL)20 mmol/L MgCl2 (mL)各管加入0.2mL0.1mol/LNaOH(mL)各管加入2.0mLOD 405 mm以对硝基苯酚的绝对量(umol数)为横坐标，OD405nm值为纵坐标，绘制标准曲线。求出斜率k或者pNP的摩尔消光系数(c)值（单位为(mol/L)-1·cm-1）。废门大王自强不息止于至善
自强不息 止于至善 四、操作方法 （一）对硝基苯酚标准曲线的制作： 取15支试管编号，0号一支，1－7号各二支，按下列表格操作。 管 号 0 1 2 3 4 5 6 7 pNP含量 (mol) 0 0.05 0.10 0.15 0.20 0.25 0.30 0.35 0.5mol/mL pNP (mL) 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 H2O (mL) 0.8 0.7 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 Na2CO3 -NaHCO3 (mL) 各管加入1.0 mL 20 mmol/L MgCl2 (mL) 各管加入0.2 mL 0.1 mol/L NaOH (mL) 各管加入2.0 mL OD 405 nm 以对硝基苯酚的绝对量(mol数)为横坐标，OD405nm值为纵坐标，绘制标准曲 线。求出斜率k或者pNP的摩尔消光系数()值（单位为( mol/L)-1﹒cm-1）
(二) 测定15支试管，1-5做两组平行测定管，01-05作为空白对照25134No.31.00.50.751.5底物终浓度[S]（mmol/L）0.10.20.30.60.1510 mmol/LpNPP(mL）0.60.550.50.40.1蒸馏水（mL）各加1.0mL碳酸盐缓冲液(pH10.1）（mL）各加0.2mL20 mmol/L MgCl2 (mL )预热混勺，37℃C，5分钟酶液 (mL)测定管各加0.1mL酶液反应时间37C，精确反应10分钟各加2mL0.1mol/L NaOH (mL)酶液(mL）空白管各补加0.1mL酶液OD405分别以01-05调零点，测定对应样品管OD405
自强不息 止于至善 (二）测定 15支试管，1-5做两组平行测定管，01-05作为空白对照。 No. 1 2 3 4 5 底物终浓度[S] (mmol/L ) 0.5 0.75 1.0 1.5 3 10 mmol/L pNPP（mL ） 0.1 0.15 0.2 0.3 0.6 蒸馏水（mL ） 0.6 0.55 0.5 0.4 0.1 碳酸盐缓冲液(pH10.1)（mL ） 各加1.0 mL 20 mmol/L MgCl2 （mL ） 各加0.2 mL 预热 混匀，37℃，5分钟 酶液（mL ） 测定管各加0.1 mL酶液 反应时间 37℃，精确反应10分钟 0.1mol/L NaOH（mL） 各加2 mL 酶液（mL ） 空白管各补加0.1 mL酶液 OD405 分别以01-05调零点，测定对应样品管OD405
命生(三)数据处理各管在722分光光度计测定波长405nm的Q值(OD405nm)。从对硝基苯酚标准曲线上查出OD405m相当于产物对硝基苯酚的含量，或者通过摩尔消光系数&换算，计算出各种底物浓度下的初速度v。（单位以μmol.L-1.min-1表示）／取倒数1/v填入表内。以1/v对1/[S]作图，求出酶催化pNPP水解的米氏常数K?和最大反应速度Vm度门大子自强不息止于至善
自强不息 止于至善 （三） 数据处理 各管在722分光光度计测定波长405nm的OD 值(OD405nm)。从对硝基苯酚标准曲线上查出OD405nm 相当于产物对硝基苯酚的含量，或者通过摩尔消光系 数换算，计算出各种底物浓度下的初速度vo（单位以 molL-1 min-1表示），取倒数1/v填入表内。以1/v对 1/[S]作图，求出酶催化pNPP水解的米氏常数Km和最 大反应速度Vm