食品产业中的PCR技术 陈辰17307130233 PCR( Polymerase Chain Reaction)即聚合酶链式反应是一种用于放大扩增特定的 DNA片段的分子生物学技术,可看作是生物体外的特殊DNA复制。它的最大特点,是能 将微量的DNA大幅增加,在许多领域得到广泛的应用,比如为食品微生物的检测分析提供 了新的快捷方法。 技术原理 PCR技术是根据已知的待扩增的片段序列、人工合成与该两条链末端互补的两段寡核 苷酸引物,在体外将待检DNA序列模板在酶促作用下进行扩增。 PCR全过程可分为模板变性、退火、延伸三个连续步骤,经若干个循环所组成。首先 高温(93-94C)作用使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离成为单链,然 后降低温度(55C°)使人工合成的两个寡核苷酸引物与模板DNA链3端的互补序列配对 结合退火,在高温下也不会失活的耐热 TaqDNA聚合酶的作用下,有4种dNTP底物存在 时,引物链将按碱基互补配对与半保留复制原理,沿着5-3方向延伸与模板互补的新 链,同时新链又可以作为下一次反应的模板,由于每一循环的产物都可作为下一循环反应 的模板,因此扩増产物的量以指数级方式增加。每完成一个循环需2~4分钟,2~3小时 就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。 PCR反应体系主要由引物、 dNTPs、DNA聚合酶、缓冲液、Mg+及核苷酸模板组
食品产业中的 PCR 技术 陈辰 17307130233 PCR（Polymerase Chain Reaction）即聚合酶链式反应是一种用于放大扩增特定的 DNA 片段的分子生物学技术，可看作是生物体外的特殊 DNA 复制。它的最大特点，是能 将微量的 DNA 大幅增加，在许多领域得到广泛的应用，比如为食品微生物的检测分析提供 了新的快捷方法。 技术原理 PCR 技术是根据已知的待扩增的片段序列、人工合成与该两条链末端互补的两段寡核 苷酸引物，在体外将待检 DNA 序列模板在酶促作用下进行扩增。 PCR 全过程可分为模板变性、退火、延伸三个连续步骤，经若干个循环所组成。首先 高温（93-94℃）作用使模板 DNA 双链或经 PCR 扩增形成的双链 DNA 解离成为单链，然 后降低温度（55℃）使人工合成的两个寡核苷酸引物与模板 DNA 链 3’端的互补序列配对 结合退火，在高温下也不会失活的耐热 TaqDNA 聚合酶的作用下，有 4 种 dNTP 底物存在 时，引物链将按碱基互补配对与半保留复制原理，沿着 5‘-3’方向延伸与模板互补的新 链，同时新链又可以作为下一次反应的模板，由于每一循环的产物都可作为下一循环反应 的模板，因此扩增产物的量以指数级方式增加。每完成一个循环需 2～4 分钟，2～3 小时 就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。 PCR 反应体系主要由引物、dNTPs、DNA 聚合酶、缓冲液、Mg++及核苷酸模板组 成
技术应用 可用于食品微生物检测 1.啤酒腐败菌的鉴定 乳杆菌对啤酒花中有抑菌作用的异α酸有抗性,可造成啤酒腐败。经研究发现,凡是 能引起啤酒腐败的乳杆菌,均含有似hoA基因。根据hoA的部分基因顺序可人工合成2 段特异性引物,使用 TaqDNA聚合酶,从一系列乳杆菌中提取DNA溶液,加人含特异性 引物的反应混合物中,进人热循环,最终的反应产物经琼脂糖凝胶电泳检测。 2.乳酸细菌的检测和鉴定 双歧杆菌现有的32个种及相关种的16S「RNA基因序列中1414-1432位的寡核苷酸碱 基序列相同,可用其作为PCR的引物来扩增双歧杆菌16 SrRNA的基因片断。通过简单的 裂解菌体细胞,再用蛋白酶K去除蛋白即可获得模板。在此条件下,其它细菌不能产生此 核苷酸片断,故能够进行乳酸菌的检测、鉴定及分类。 3.水体微生物的检测 利用PCR技术可直接从海水样品中特异性地扩增出一种目前常规方法无法培养的菌株 的固氮基因片断。对于生物污染严重的污水中的军团菌用常规的分离培养法不可能检出 饮用水中的需7~10天;而用PCR方法则可极其准确地检出污水中的军团菌,检测时间仅 为4小时。贾第虫、隐孢子虫、肠道病毒等也适用。 技术优缺点 1.优点 PCR技术能够指导特定的DNA序列的合成和使特定的DNA区段得到迅速大量的扩 增。因此,被广泛应用于食品微生物检测,有检测时间短、灵敏度高、检测对象范围广的 优势 2.缺点 PCR反应能被一些物质显著抑制。例如胡敏酸、富里酸、某些离子及糖类物质等可以 干扰Taq聚合酶的作用。在保存和提纯的过程中可能从环境以及中间处理环节带来一些如 十二烷基硫酸钠的潜在的反应抑制剂。另外还可能有一些共存物质可能抑制反应或造成假 阳性结果。 PCR技术不能区分活细胞和死细胞。例如在水体微生物检测中不能确定检出的病毒粒 子是否带有感染能力。 参考文献 1.《PCR在食品微生物检测中的应用》常世敏
技术应用 可用于食品微生物检测： 1. 啤酒腐败菌的鉴定 乳杆菌对啤酒花中有抑菌作用的异α酸有抗性，可造成啤酒腐败。经研究发现，凡是 能引起啤酒腐败的乳杆菌，均含有似 horA 基因。根据 horA 的部分基因顺序可人工合成 2 段特异性引物，使用 TaqDNA 聚合酶，从一系列乳杆菌中提取 DNA 溶液，加人含特异性 引物的反应混合物中，进人热循环，最终的反应产物经琼脂糖凝胶电泳检测。 2. 乳酸细菌的检测和鉴定 双歧杆菌现有的 32 个种及相关种的 16SrRNA 基因序列中 1414-1432 位的寡核苷酸碱 基序列相同，可用其作为 PCR 的引物来扩增双歧杆菌 16SrRNA 的基因片断。通过简单的 裂解菌体细胞，再用蛋白酶 K 去除蛋白即可获得模板。在此条件下，其它细菌不能产生此 核苷酸片断，故能够进行乳酸菌的检测、鉴定及分类。 3. 水体微生物的检测 利用 PCR 技术可直接从海水样品中特异性地扩增出一种目前常规方法无法培养的菌株 的固氮基因片断。对于生物污染严重的污水中的军团菌用常规的分离培养法不可能检出， 饮用水中的需 7~10 天；而用 PCR 方法则可极其准确地检出污水中的军团菌，检测时间仅 为 4 小时。贾第虫、隐孢子虫、肠道病毒等也适用。 技术优缺点 1. 优点 PCR 技术能够指导特定的 DNA 序列的合成和使特定的 DNA 区段得到迅速大量的扩 增。因此，被广泛应用于食品微生物检测，有检测时间短、灵敏度高、检测对象范围广的 优势。 2. 缺点 PCR 反应能被一些物质显著抑制。例如胡敏酸、富里酸、某些离子及糖类物质等可以 干扰 Taq 聚合酶的作用。在保存和提纯的过程中可能从环境以及中间处理环节带来一些如 十二烷基硫酸钠的潜在的反应抑制剂。另外还可能有一些共存物质可能抑制反应或造成假 阳性结果。 PCR 技术不能区分活细胞和死细胞。例如在水体微生物检测中不能确定检出的病毒粒 子是否带有感染能力。 参考文献： 1. 《PCR 在食品微生物检测中的应用》常世敏