临床免疫学——免疫学及免疫学检验（免疫电泳技术）

免疫学及免疫学检验 免疫电泳技术 毛旭虎 ●医学检验系临床微生物学及免疫学教研室 二OO二年四月

免疫学及免疫学检验 免疫电泳技术 毛旭虎 ⚫ 医学检验系临床微生物学及免疫学教研室 ⚫ 二OO二年四月

免疫学及免疫学检验 第一节概述 免疫电泳技术实质上是直流电场作用下的凝胶 扩散试验 Grabar和 Williams于1953年首先将凝胶扩散置于直流 电场中进行,让电流加速抗原和抗体的扩散,并规定其 运动方向,从而使这种沉淀反应时间大缩短,敏感度显 著提高。随着现代生物学医学科学技术的发展,免疫电 泳技术有了新的发展,应用范围日益扩大,不仅用于人 与动物血清蛋白、各组织器官抗原成分及抗体的分析, 也用于细菌、植物性抗原、酶与激素的检测

免疫学及免疫学检验 第一节 概述 免疫电泳技术实质上是直流电场作用下的凝胶 扩散试验。 Grabar和Williams于1953年首先将凝胶扩散置于直流 电场中进行，让电流加速抗原和抗体的扩散，并规定其 运动方向，从而使这种沉淀反应时间大缩短，敏感度显 著提高。随着现代生物学医学科学技术的发展，免疫电 泳技术有了新的发展，应用范围日益扩大，不仅用于人 与动物血清蛋白、各组织器官抗原成分及抗体的分析， 也用于细菌、植物性抗原、酶与激素的检测

免疫学及免疫学检验 电泳的原理 带电质点在电场中向带有异相电荷的电极移 动,这种现象称为电泳。抗体及大多数抗原是 蛋白质,具有许多可解离的酸性和碱性基团如 COO及NH等,在一定pH条件下,这种两 性电解质解离成为带正电或负电的质点,其泳 动方向和泳动速度与本身净电荷量、颗粒大小 形状等有关。所带净电荷量越多,颗粒越小, 泳动速度越快

免疫学及免疫学检验 ⚫ 一、电泳的原理 ⚫ 带电质点在电场中向带有异相电荷的电极移 动，这种现象称为电泳。抗体及大多数抗原是 蛋白质，具有许多可解离的酸性和碱性基团如 COO—及NH3 +等，在一定pH条件下，这种两 性电解质解离成为带正电或负电的质点，其泳 动方向和泳动速度与本身净电荷量、颗粒大小、 形状等有关。所带净电荷量越多，颗粒越小， 泳动速度越快

免疫学及免疫学检验 二、影响因素 1.电场强度是指每厘米的电位降,以Vcm表 示。电泳时,可采用恒定电流,变动电压 也可恒定电压,变动电流。I=V/R,恒定电压 时,因R不断下降,所以电流增高,颗粒移动 速度和热效应也增大。通常采用电压在 2~10V/cm;当恒定电流时,由于R不断下降, 因此,Ⅴ也随之下降,从而蒸发较少,热效应 也小,移动率接近恒定。因此恒定电流要比 亘定电压好。常用电流为2~4mA(cm

免疫学及免疫学检验 二、影响因素 1. 电场强度 是指每厘米的电位降，以V/cm表 示。电泳时，可采用恒定电流，变动电压； 也可恒定电压，变动电流。I=V/R，恒定电压 时，因R不断下降，所以电流增高，颗粒移动 速 度和 热效应 也增大 。通 常采用 电压 在 2~10V/cm；当恒定电流时，由于R不断下降， 因此，V也随之下降，从而蒸发较少，热效应 也小，移动率接近恒定。因此恒定电流要比 恒定电压好。常用电流为2~4mA/cm

免疫学及免疫学检验 2.溶液pH值溶液pH值决定蛋白质带电 荷种类和数量。pH离等电点越远,离子 解离越多,泳动速度越快,反之则越慢 为了使电泳速度恒定,必须采用缓冲溶 液。由于大多数蛋白质的等电点较低, 一般电泳所采用的缓冲溶液均偏碱性, 因而使大部分的分子带负电荷

免疫学及免疫学检验 2. 溶液pH值 溶液pH值决定蛋白质带电 荷种类和数量。pH离等电点越远，离子 解离越多，泳动速度越快，反之则越慢。 为了使电泳速度恒定，必须采用缓冲溶 液。由于大多数蛋白质的等电点较低， 一般电泳所采用的缓冲溶液均偏碱性， 因而使大部分的分子带负电荷

免疫学及免疫学检验 3.离子强度溶液的离子强越高,电导率 越高,则带电质点泳动速度越慢并有较 高的热效应;反之,离子强度低,质点 泳动快,热效应较小

免疫学及免疫学检验 3. 离子强度 溶液的离子强越高，电导率 越高，则带电质点泳动速度越慢并有较 高的热效应；反之，离子强度低，质点 泳动快，热效应较小

免疫学及免疫学检验 4.电渗在电场中液体相对于固体的移动称为 电渗。在琼脂凝胶电泳中,由于琼脂是带负 电荷的极性基团(如SO2、COO-),使琼脂 成为负电的固相,静电感应作用使琼脂网格 附近的水带正电,因此,液体向负极流动, 形成电渗力。带电质点泳动时受电泳力和电 渗力的共同作用。如电泳力低于电渗力,则 向负极移动。如抗体,在碱性环境带负电, 应向正极移动,但由于其等电点较高,电荷 少,抵不过电渗力而泳向负极

免疫学及免疫学检验 4. 电渗 在电场中液体相对于固体的移动称为 电渗。在琼脂凝胶电泳中，由于琼脂是带负 电荷的极性基团(如SO4 2—、COO—)，使琼脂 成为负电的固相，静电感应作用使琼脂网格 附近的水带正电，因此，液体向负极流动， 形成电渗力。带电质点泳动时受电泳力和电 渗力的共同作用。如电泳力低于电渗力，则 向负极移动。如抗体，在碱性环境带负电， 应向正极移动，但由于其等电点较高，电荷 少，抵不过电渗力而泳向负极

免疫学及免疫学检验 第二节对流免疫电泳 对流免疫电泳( counter immunoelectrophoresis, CIEP)又称免疫电渗电泳( immuno osmophoresis,EOP)。是在直流电场中进行的 免疫双扩散技术

免疫学及免疫学检验 第二节 对流免疫电泳 对 流免疫 电泳 (counter immunoelectrophoresis, CIEP) 又 称 免 疫 电 渗 电 泳 (immuno￾osmophoresis, IEOP)。是在直流电场中进行的 免疫双扩散技术

免疫学及免疫学检验 )原理 在pH8.6的琼脂凝胶中,抗体球蛋白因等电点 高,只带有微弱的负电荷,而且分子又较大, 因此电泳力小,小于电渗力,泳向负极;而 般抗原蛋白质常带较强的负电荷,分子较小, 电泳力大,大于电渗力,泳向正极,电泳时抗 原放负极侧,抗体放正极侧,抗原抗体相对泳 动,一定时间后抗原和抗体将在两孔之间相遇 在比例适当处形成肉眼可见的沉淀线

免疫学及免疫学检验 (一) 原理 在pH8.6的琼脂凝胶中，抗体球蛋白因等电点 高，只带有微弱的负电荷，而且分子又较大， 因此电泳力小，小于电渗力，泳向负极；而一 般抗原蛋白质常带较强的负电荷，分子较小， 电泳力大，大于电渗力，泳向正极，电泳时抗 原放负极侧，抗体放正极侧，抗原抗体相对泳 动，一定时间后抗原和抗体将在两孔之间相遇， 在比例适当处形成肉眼可见的沉淀线

免疫学及免疫学检验 二)操作步骤 1.制备1.2%巴比妥琼脂凝胶板。 2在琼脂板上成对打孔,孔径3mm,孔距6mm。 3.于阴极侧孔内加入待检血清或阳性对照血清 阳极侧孔内加抗血清 4.电泳电泳条件34mAcm宽,电泳30min 5.观察结果或在室温放置数小时后观察沉淀线, 见图

免疫学及免疫学检验 (二) 操作步骤 1. 制备1.2%巴比妥琼脂凝胶板。 2.在琼脂板上成对打孔，孔径3mm，孔距6mm。 3.于阴极侧孔内加入待检血清或阳性对照血清， 阳极侧孔内加抗血清。 4. 电泳 电泳条件3~4mAcm宽，电泳30min。 5. 观察结果或在室温放置数小时后观察沉淀线， 见图