一 教学要求 ⚫ 多克隆抗体血清含有多种蛋白质组分，不适 用于实验室分析、检测应用。根据实验目的不 同，可按照不同的方法对有效的抗体成分进行 分离、纯化。 ⚫ 如作为ELISA检测时的抗体，部分情况下 饱和硫酸铵纯化即可。 ⚫ 免疫放射测定的标记用抗体必须达到双级 纯才可应用（亲和层析+SDS聚丙烯酰胺凝胶电 泳纯）。 实验六 血清抗体的分离与纯化
一 教学要求 ⚫ 多克隆抗体血清含有多种蛋白质组分，不适 用于实验室分析、检测应用。根据实验目的不 同，可按照不同的方法对有效的抗体成分进行 分离、纯化。 ⚫ 如作为ELISA检测时的抗体，部分情况下 饱和硫酸铵纯化即可。 ⚫ 免疫放射测定的标记用抗体必须达到双级 纯才可应用（亲和层析+SDS聚丙烯酰胺凝胶电 泳纯）。 实验六 血清抗体的分离与纯化
二 实验原理 常用盐析法、凝胶柱层析、离子交换剂层析 以及免疫亲和层析等技术对血清抗体进行分离 纯化
二 实验原理 常用盐析法、凝胶柱层析、离子交换剂层析 以及免疫亲和层析等技术对血清抗体进行分离 纯化
盐析法原理 水膜与同性电荷的排斥作用是蛋白质胶体稳 定的基础，在蛋白质胶体溶液中加入一定量的 （NH4）2SO4或Na2SO4盐类，使溶液中大部分自由 水分子转变为离子水化分子，降低蛋白质极性基 团与水分子的相互作用，破坏蛋白质水膜，蛋白 质溶解度也随之降低。蛋白质由于分子质量和携 带的电荷不同，可在不同浓度的高盐溶液内分级 析出。33% （NH4）2SO4为沉淀IgG的最适饱和度
盐析法原理 水膜与同性电荷的排斥作用是蛋白质胶体稳 定的基础，在蛋白质胶体溶液中加入一定量的 （NH4）2SO4或Na2SO4盐类，使溶液中大部分自由 水分子转变为离子水化分子，降低蛋白质极性基 团与水分子的相互作用，破坏蛋白质水膜，蛋白 质溶解度也随之降低。蛋白质由于分子质量和携 带的电荷不同，可在不同浓度的高盐溶液内分级 析出。33% （NH4）2SO4为沉淀IgG的最适饱和度
离子交换层析原理 利用蛋白质的酸碱性质，使蛋白质混合物与 离子交换纤维素的酸性基或碱性基相结合。由 于盐类的存在可以降低离子交换剂的离子基团 和蛋白质的相反电荷基团之间的静电相互吸引， 通过改变溶液中盐类离子强度和PH可以将蛋白 质分离。层析血清IgG的常用纤维素为DEAE-32
离子交换层析原理 利用蛋白质的酸碱性质，使蛋白质混合物与 离子交换纤维素的酸性基或碱性基相结合。由 于盐类的存在可以降低离子交换剂的离子基团 和蛋白质的相反电荷基团之间的静电相互吸引， 通过改变溶液中盐类离子强度和PH可以将蛋白 质分离。层析血清IgG的常用纤维素为DEAE-32
免疫亲合层析法 ⚫ 采用化学方法将抗原或抗体偶联到固相 载体上，使之成为不溶性结构。再经层 析法吸附液体中的相应抗体或抗原，成 为抗原抗体复合物。然后改变条件，使 该免疫复合物解离，洗脱得到纯化的相 应抗体或抗原
免疫亲合层析法 ⚫ 采用化学方法将抗原或抗体偶联到固相 载体上，使之成为不溶性结构。再经层 析法吸附液体中的相应抗体或抗原，成 为抗原抗体复合物。然后改变条件，使 该免疫复合物解离，洗脱得到纯化的相 应抗体或抗原
目前，普遍采用的方法是将硫酸铵盐析与 DEAE-32离子交换柱层析法结合起来，即先采 用2步硫酸铵盐析法粗提，再经离子交换柱层 析得到较纯的IgG
目前，普遍采用的方法是将硫酸铵盐析与 DEAE-32离子交换柱层析法结合起来，即先采 用2步硫酸铵盐析法粗提，再经离子交换柱层 析得到较纯的IgG
三 材料与器材（略）
三 材料与器材（略）
四 操作步骤 ⚫ ⚫ 免疫血清 1 mL ⚫ ↓加 1mL 生理盐水 ⚫ 逐滴加入饱和（NH4）2 SO4 2 mL（此时为50%饱和度） ⚫ 4℃，静置 20 min↓3000 r/min 离心 20 min ⚫ 取沉淀溶于 2 mL 生理盐水中 ⚫ ↓ ⚫ 逐滴加入饱和（NH4）2SO4 1 mL（此时为33%饱和度） ⚫ 4℃，静置 20 min↓3000 r/min 离心 20 min ⚫ 取沉淀溶于0.5 mL 生理盐水中 ⚫ ↓ ⚫ 装入透析袋 ⚫
四 操作步骤 ⚫ ⚫ 免疫血清 1 mL ⚫ ↓加 1mL 生理盐水 ⚫ 逐滴加入饱和（NH4）2 SO4 2 mL（此时为50%饱和度） ⚫ 4℃，静置 20 min↓3000 r/min 离心 20 min ⚫ 取沉淀溶于 2 mL 生理盐水中 ⚫ ↓ ⚫ 逐滴加入饱和（NH4）2SO4 1 mL（此时为33%饱和度） ⚫ 4℃，静置 20 min↓3000 r/min 离心 20 min ⚫ 取沉淀溶于0.5 mL 生理盐水中 ⚫ ↓ ⚫ 装入透析袋 ⚫
↓ 对0.0175mol/L pH 6.3 PB透析1d，其间换液6次 ↓ DEAE纤维素层析 ↓ 将蛋白含量高的收集管内液合并，测蛋白含量 （mg/mL)并进行纯度鉴定
↓ 对0.0175mol/L pH 6.3 PB透析1d，其间换液6次 ↓ DEAE纤维素层析 ↓ 将蛋白含量高的收集管内液合并，测蛋白含量 （mg/mL)并进行纯度鉴定
五 注意事项 （1）.盐析时注意饱和硫酸铵加入血清中 的速度和方式，边加边缓慢摇动，并避 免产生气泡。 （2）.注意区别前后2次盐析所采用的饱和 硫酸铵的终浓度。 （3）.注意检查层析住的情况，主要明确 层析住是否均匀，表面是否平整，有无 气泡、裂隙
五 注意事项 （1）.盐析时注意饱和硫酸铵加入血清中 的速度和方式，边加边缓慢摇动，并避 免产生气泡。 （2）.注意区别前后2次盐析所采用的饱和 硫酸铵的终浓度。 （3）.注意检查层析住的情况，主要明确 层析住是否均匀，表面是否平整，有无 气泡、裂隙