一 教学要求 ⚫ 学习免疫沉淀反应的原理,了解免疫沉 淀反应的类型 ⚫ 掌握单向琼脂扩散实验的操作方法 实验二 单向琼脂扩散试验
一 教学要求 ⚫ 学习免疫沉淀反应的原理,了解免疫沉 淀反应的类型 ⚫ 掌握单向琼脂扩散实验的操作方法 实验二 单向琼脂扩散试验
二 实验原理 ⚫ 免疫沉淀反应是指可溶性抗原与相应抗体在有 电解质存在的情况下,按适当比例所形成的可 见沉淀物现象。据此现象设计的沉淀实验主要 包括絮状沉淀试验,环状沉淀试验和凝胶内的 沉淀试验。凝胶内的沉淀试验依所用的实验方 法又可分为免疫扩散实验和免疫电泳技术2类
二 实验原理 ⚫ 免疫沉淀反应是指可溶性抗原与相应抗体在有 电解质存在的情况下,按适当比例所形成的可 见沉淀物现象。据此现象设计的沉淀实验主要 包括絮状沉淀试验,环状沉淀试验和凝胶内的 沉淀试验。凝胶内的沉淀试验依所用的实验方 法又可分为免疫扩散实验和免疫电泳技术2类
⚫ 单向琼脂扩散扩实验是凝胶内免疫沉淀反应定 量试验,一般是用已知抗体测定未知量的相应 抗原。定量抗体与加热熔化的含缓冲液的琼脂 混合后,制板,打孔,加入待检抗原,在合适 条件下,形成乳白色的沉淀环。 ⚫ 沉淀环大小与抗原(抗体)量成正相关,因而 可以根据沉淀环的大小确定相应抗原(抗体) 的量。 ⚫ 单向免疫扩散试验主要用于血清中IgG、IgM、 IgA和补体等蛋白质的定性、定量测定
⚫ 单向琼脂扩散扩实验是凝胶内免疫沉淀反应定 量试验,一般是用已知抗体测定未知量的相应 抗原。定量抗体与加热熔化的含缓冲液的琼脂 混合后,制板,打孔,加入待检抗原,在合适 条件下,形成乳白色的沉淀环。 ⚫ 沉淀环大小与抗原(抗体)量成正相关,因而 可以根据沉淀环的大小确定相应抗原(抗体) 的量。 ⚫ 单向免疫扩散试验主要用于血清中IgG、IgM、 IgA和补体等蛋白质的定性、定量测定
三 材料与器材(略)
三 材料与器材(略)
四 操作步骤 (1)制备抗体琼脂凝胶板:用生理盐水配制1.5%琼脂凝胶, 置水浴中煮沸熔化后,移置56℃水浴箱中保温。吸取 56℃的熔化琼脂置小烧杯内,加入羊抗人IgG抗体(1: 60,v/v)。 (2)铺胶:取溶化的琼脂4ml趁热均匀浇注于载玻片上, 厚度约为1.5mm。 (3) 打孔:待琼脂凝固后,用打孔器在琼脂板上打孔,孔 径3~4mm,孔距10mm。 (4) 加样:将待检血清用生理盐水稀释成1:2、1:6、1: 10 以及空白(生理盐水)加入各孔中,每孔10ul。 (5) 扩散:加样完毕,将琼脂板平放于湿盒内,置37℃ 24~28小时后观察结果
四 操作步骤 (1)制备抗体琼脂凝胶板:用生理盐水配制1.5%琼脂凝胶, 置水浴中煮沸熔化后,移置56℃水浴箱中保温。吸取 56℃的熔化琼脂置小烧杯内,加入羊抗人IgG抗体(1: 60,v/v)。 (2)铺胶:取溶化的琼脂4ml趁热均匀浇注于载玻片上, 厚度约为1.5mm。 (3) 打孔:待琼脂凝固后,用打孔器在琼脂板上打孔,孔 径3~4mm,孔距10mm。 (4) 加样:将待检血清用生理盐水稀释成1:2、1:6、1: 10 以及空白(生理盐水)加入各孔中,每孔10ul。 (5) 扩散:加样完毕,将琼脂板平放于湿盒内,置37℃ 24~28小时后观察结果
○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ 打孔方案
○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ 打孔方案
五 注意事项 ⚫ 制备抗体琼脂板时,琼脂温度必须严格 控制。温度太低会导致琼脂凝固,太高 将影响所加抗体的活性。 ⚫ 加样孔中的琼脂应挑干净,且不可损坏 孔的边缘,确保每孔的液面基本一致
五 注意事项 ⚫ 制备抗体琼脂板时,琼脂温度必须严格 控制。温度太低会导致琼脂凝固,太高 将影响所加抗体的活性。 ⚫ 加样孔中的琼脂应挑干净,且不可损坏 孔的边缘,确保每孔的液面基本一致
六 思考题 ⚫ 分析试验结果并探讨试验要点
六 思考题 ⚫ 分析试验结果并探讨试验要点