实验二、三 斯达油脂酵母胞外多糖 发酵、 提取及测定 一 教学要求 了解微生物液体培养法。 了解微生物胞外多糖的发酵及制备过程。 二 实验原理 微生物多糖从其在细胞中的分布可分为细胞外多 糖、细胞壁多糖和细胞内多糖。细胞外多糖（EPS）是 指分布于细胞壁之外，以荚膜的形式附到细胞壁上或 以粘液的形式分泌于胞外环境的同多糖或异多糖。EPS 不但对微生物具有重要的生物学作用，而且在食品、 化妆品、造纸、纺织印染和石油开采等工业上有广泛 的用途
实验二、三 斯达油脂酵母胞外多糖 发酵、 提取及测定 一 教学要求 了解微生物液体培养法。 了解微生物胞外多糖的发酵及制备过程。 二 实验原理 微生物多糖从其在细胞中的分布可分为细胞外多 糖、细胞壁多糖和细胞内多糖。细胞外多糖（EPS）是 指分布于细胞壁之外，以荚膜的形式附到细胞壁上或 以粘液的形式分泌于胞外环境的同多糖或异多糖。EPS 不但对微生物具有重要的生物学作用，而且在食品、 化妆品、造纸、纺织印染和石油开采等工业上有广泛 的用途
许多微生物均能产生胞外多糖，但只有在合 适的培养条件下才能大量产生积累该产物。本实 验以斯达油脂酵母为生产菌种，选用高碳氮比的 液体发酵培养基及高通气量等有利于菌株多糖合 成的培养条件进行EPS发酵。 本实验多糖的定量测定采用苯酚—硫酸法。多 糖在浓硫酸作用下生成糠醛，糠醛能与酚类化合 物作用生成有色物质，在490nm处有最大吸收值， 且颜色深浅在一定范围内与糖含量呈线性关系， 因此可采用分光光度法进行定量测定
许多微生物均能产生胞外多糖，但只有在合 适的培养条件下才能大量产生积累该产物。本实 验以斯达油脂酵母为生产菌种，选用高碳氮比的 液体发酵培养基及高通气量等有利于菌株多糖合 成的培养条件进行EPS发酵。 本实验多糖的定量测定采用苯酚—硫酸法。多 糖在浓硫酸作用下生成糠醛，糠醛能与酚类化合 物作用生成有色物质，在490nm处有最大吸收值， 且颜色深浅在一定范围内与糖含量呈线性关系， 因此可采用分光光度法进行定量测定
三 材料与器材 ⚫ 菌种：斯达油脂酵母（Lipomyces starkeyi）2. 1390. ⚫ 试剂： （1）无机盐溶液：MgSO4 .7H2O 0.4 % ， ⚫ MnSO4 .H2O 0.2 %， FeSO4 .7H2O 0.2 % ，NaCl 0.2 % ⚫ （2）种子培养基：蔗糖2%，酵母膏0.5%， pH6.5. ⚫ （3）摇瓶发酵培养基：蔗糖8%，蛋白胨0.3% ， K2HPO4 0.35% ，KH2PO4 0.35% ，无机盐溶液5mL/L pH6.5. ⚫ 种子培养基和发酵培养基装量为250 mL 三角瓶30 mL， 8层纱布塞于瓶口，并用牛皮纸包扎，培养基121 ℃灭 菌20 min
三 材料与器材 ⚫ 菌种：斯达油脂酵母（Lipomyces starkeyi）2. 1390. ⚫ 试剂： （1）无机盐溶液：MgSO4 .7H2O 0.4 % ， ⚫ MnSO4 .H2O 0.2 %， FeSO4 .7H2O 0.2 % ，NaCl 0.2 % ⚫ （2）种子培养基：蔗糖2%，酵母膏0.5%， pH6.5. ⚫ （3）摇瓶发酵培养基：蔗糖8%，蛋白胨0.3% ， K2HPO4 0.35% ，KH2PO4 0.35% ，无机盐溶液5mL/L pH6.5. ⚫ 种子培养基和发酵培养基装量为250 mL 三角瓶30 mL， 8层纱布塞于瓶口，并用牛皮纸包扎，培养基121 ℃灭 菌20 min
四 操作步骤 1、胞外多糖发酵 斜面培养 将斯达油脂酵母2.1390菌株接在斜面培养 基上,28℃培养48h 。 种子培养 在种子培养基中接入斜面菌种一环，用8层 纱布展平包扎于瓶口，然后置28℃摇床（200 r/min）振荡培养36 h。 多糖发酵 在发酵培养基中接入种子液1.5ml，用8层 纱布展平包扎于瓶口后，放置28℃摇床（200 r/min）振荡培养108 h
四 操作步骤 1、胞外多糖发酵 斜面培养 将斯达油脂酵母2.1390菌株接在斜面培养 基上,28℃培养48h 。 种子培养 在种子培养基中接入斜面菌种一环，用8层 纱布展平包扎于瓶口，然后置28℃摇床（200 r/min）振荡培养36 h。 多糖发酵 在发酵培养基中接入种子液1.5ml，用8层 纱布展平包扎于瓶口后，放置28℃摇床（200 r/min）振荡培养108 h
2、多糖的提取及测定 粗多糖的提取及测定样品液的制备 发酵液用蒸馏水稀释3倍，3500r/min离心 15min除菌体。取上清液1ml，调pH至6.0，加95% 乙醇3ml，氯化钾饱和液1滴，混匀。静置让多糖 充分沉淀，然后在3500r/min离心10min，弃上清液。 沉淀用75%乙醇洗至无还原糖反应，经洗涤后的 沉淀即为胞外粗多糖。将其溶于水并稀释至适当 浓度（样品液）
2、多糖的提取及测定 粗多糖的提取及测定样品液的制备 发酵液用蒸馏水稀释3倍，3500r/min离心 15min除菌体。取上清液1ml，调pH至6.0，加95% 乙醇3ml，氯化钾饱和液1滴，混匀。静置让多糖 充分沉淀，然后在3500r/min离心10min，弃上清液。 沉淀用75%乙醇洗至无还原糖反应，经洗涤后的 沉淀即为胞外粗多糖。将其溶于水并稀释至适当 浓度（样品液）
甘露糖标准曲线的制作 取6支干净试管，分别加入100μg /ml甘露糖标准溶液0、 0.2、0.4、0.6、0.8、1.0ml，不足1ml管用蒸馏水补足至 1ml，各管再加6%苯酚溶液1.0ml ，摇匀，再加入浓硫酸 5.0ml,混匀静置10min后在25～30℃水浴中放置20min，取 出。用1cm 玻璃吸收池，以空白管溶液为参比，在波长 490nm处依次测定各管溶液的光密度值（OD）。 样品测定 取样品液1.0ml，同制作标准曲线步骤操作
甘露糖标准曲线的制作 取6支干净试管，分别加入100μg /ml甘露糖标准溶液0、 0.2、0.4、0.6、0.8、1.0ml，不足1ml管用蒸馏水补足至 1ml，各管再加6%苯酚溶液1.0ml ，摇匀，再加入浓硫酸 5.0ml,混匀静置10min后在25～30℃水浴中放置20min，取 出。用1cm 玻璃吸收池，以空白管溶液为参比，在波长 490nm处依次测定各管溶液的光密度值（OD）。 样品测定 取样品液1.0ml，同制作标准曲线步骤操作
四、注意事项 1、注意无菌操作 2、多糖测定时，注意控制好供测样品的稀释倍数。 五、思考题 1、为什么在高碳氮比的液体发酵培养基中及高通 气量进行发酵有利于菌株多糖的合成？ 2、用苯酚—硫酸法测定多糖有何优缺点？
四、注意事项 1、注意无菌操作 2、多糖测定时，注意控制好供测样品的稀释倍数。 五、思考题 1、为什么在高碳氮比的液体发酵培养基中及高通 气量进行发酵有利于菌株多糖的合成？ 2、用苯酚—硫酸法测定多糖有何优缺点？