一 教学要求 • 掌握酶联免疫吸附试验的基本方法及其 原理 • 学习双抗夹心法检测抗原物质的基本操 作 实验八 酶联免疫吸附试验（ELISA）
一 教学要求 • 掌握酶联免疫吸附试验的基本方法及其 原理 • 学习双抗夹心法检测抗原物质的基本操 作 实验八 酶联免疫吸附试验（ELISA）
二 实验原理 酶联免疫吸附测定(enzyme-linked immunosorbent assay 简 称ELISA)是在免疫酶技术(immunoenzymatic techniques) 上 发展起来的一种新型免疫测定技术，ELISA过程包括：抗原 吸附在固相载体上，这个过程称为包被，加待测抗体, 再加 相应酶标记抗体，生成抗原-待测抗体-酶标记抗体的复合 物，再与该酶的底物反应生成有色产物。借助分光光度计 的光吸收计算抗体的量。待测抗体的量与有色产物成正比。 同理也可包被抗体，测定抗原含量。 ELISA最常用的四种 方法：直接法测定抗原；间接法测定抗体；双抗体夹心法 测定抗原；竞争法测定抗原
二 实验原理 酶联免疫吸附测定(enzyme-linked immunosorbent assay 简 称ELISA)是在免疫酶技术(immunoenzymatic techniques) 上 发展起来的一种新型免疫测定技术，ELISA过程包括：抗原 吸附在固相载体上，这个过程称为包被，加待测抗体, 再加 相应酶标记抗体，生成抗原-待测抗体-酶标记抗体的复合 物，再与该酶的底物反应生成有色产物。借助分光光度计 的光吸收计算抗体的量。待测抗体的量与有色产物成正比。 同理也可包被抗体，测定抗原含量。 ELISA最常用的四种 方法：直接法测定抗原；间接法测定抗体；双抗体夹心法 测定抗原；竞争法测定抗原
（1） 直接法测定抗原 A. 将抗原吸附在载体表面； B. 加酶标抗体，形成抗原—抗体复合物； C. 加底物。底物的降解量＝抗原量
（1） 直接法测定抗原 A. 将抗原吸附在载体表面； B. 加酶标抗体，形成抗原—抗体复合物； C. 加底物。底物的降解量＝抗原量
（2）间接法测定抗体 A. 将抗原吸附于固相载体表面； B. 加抗体, 形成抗原-抗体复合物; C. 加酶标抗体； D. 加底物。 测定底物的降解量＝抗体量
（2）间接法测定抗体 A. 将抗原吸附于固相载体表面； B. 加抗体, 形成抗原-抗体复合物; C. 加酶标抗体； D. 加底物。 测定底物的降解量＝抗体量
（3）双抗体夹心法测定抗原 A. 将抗体吸附于固相表面; B. 加抗原，形成抗原-抗体复合物; C. 加酶标抗体; E. 加底物。底物的降解量＝抗原量
（3）双抗体夹心法测定抗原 A. 将抗体吸附于固相表面; B. 加抗原，形成抗原-抗体复合物; C. 加酶标抗体; E. 加底物。底物的降解量＝抗原量
（4）竞争法测定抗原 A. 将抗体吸附在固相载体表面; B. 加入酶标抗原和待测抗原，竞争结合抗体； 对照只加入酶 标抗原； C. 加底物。对照孔与样品孔底物降解量的差＝未知抗原量
（4）竞争法测定抗原 A. 将抗体吸附在固相载体表面; B. 加入酶标抗原和待测抗原，竞争结合抗体； 对照只加入酶 标抗原； C. 加底物。对照孔与样品孔底物降解量的差＝未知抗原量
三 材料与器材（略）
三 材料与器材（略）
（1）抗体包被：羊抗人IgG 酶联板每孔加100 µL，4 ℃ 过夜；甩净。 （2）封闭：2% 小牛血清，每孔加100 µL，37 ℃ 封闭30 min；封 闭后洗三次（前两次用自来水冲、甩； 第三次用洗液， 并静 置 3 min，甩） （3）加待测抗原：正常人血清稀释成,1:5,1:10,1:20,1:40,1:80 , 生理盐水作为对照，每孔加 100 µL，注意从高稀释度到低稀释 度加样，37 ℃ 孵育1h ；洗三次 （4）加酶标抗体：HRP-IgG（PBS-Tween，5%BS；1：800稀释）， 每孔加 100 µL，37 ℃，30 min；洗三次 四 操作 步骤
（1）抗体包被：羊抗人IgG 酶联板每孔加100 µL，4 ℃ 过夜；甩净。 （2）封闭：2% 小牛血清，每孔加100 µL，37 ℃ 封闭30 min；封 闭后洗三次（前两次用自来水冲、甩； 第三次用洗液， 并静 置 3 min，甩） （3）加待测抗原：正常人血清稀释成,1:5,1:10,1:20,1:40,1:80 , 生理盐水作为对照，每孔加 100 µL，注意从高稀释度到低稀释 度加样，37 ℃ 孵育1h ；洗三次 （4）加酶标抗体：HRP-IgG（PBS-Tween，5%BS；1：800稀释）， 每孔加 100 µL，37 ℃，30 min；洗三次 四 操作 步骤
（5）酶催化反应：底物显色剂（0.2 mol/L Na2HPO4 加1:1的 0.1M柠檬酸，3% H2O2 加1.5µL/mL，TMB（DMSO溶，10 mg/mL） 每孔加50 µL，37 ℃ 闭光反应15 min； （6）加2mol/L H2SO4 50 µL 终止反应，观察颜色反应，并用酶 标仪测量OD
（5）酶催化反应：底物显色剂（0.2 mol/L Na2HPO4 加1:1的 0.1M柠檬酸，3% H2O2 加1.5µL/mL，TMB（DMSO溶，10 mg/mL） 每孔加50 µL，37 ℃ 闭光反应15 min； （6）加2mol/L H2SO4 50 µL 终止反应，观察颜色反应，并用酶 标仪测量OD
五 注意事项 （1）正确洗涤酶标板，加洗涤液时要小心，勿 使洗涤液溢出，流入周围孔中，造成交叉污染。 洗涤后应尽量甩干孔内残液。洗涤液加入孔后， 须保持 3 min再弃去。 （2）加样品时应从最高稀释度逐一加至最低稀 释度，这样可以不换吸头。 （3）底物应在临用前配制，同时注意避光
五 注意事项 （1）正确洗涤酶标板，加洗涤液时要小心，勿 使洗涤液溢出，流入周围孔中，造成交叉污染。 洗涤后应尽量甩干孔内残液。洗涤液加入孔后， 须保持 3 min再弃去。 （2）加样品时应从最高稀释度逐一加至最低稀 释度，这样可以不换吸头。 （3）底物应在临用前配制，同时注意避光