一 教学要求 • 学习免疫标记技术的种类及应用 • 学习应用辣根过氧化物酶标记抗体的操 作 实验七 辣根过氧化物酶标记抗体
一 教学要求 • 学习免疫标记技术的种类及应用 • 学习应用辣根过氧化物酶标记抗体的操 作 实验七 辣根过氧化物酶标记抗体
二 实验原理 （1）免疫标记技术 免疫标记技术是将一些既易测定又具有高度敏感性 的物质标记到特异性抗原或抗体分子上，通过这些标 记物的增强放大效应来显示反应系统中抗原或抗体的 性质与含量。常用的标记物包括荧光素、酶和放射性 核素等，用这3种标记物进行标记的免疫检测技术被称 为3大免疫标记技术。目前，使用的免疫标记物还有化 学发光物质、铁蛋白和胶体金等
二 实验原理 （1）免疫标记技术 免疫标记技术是将一些既易测定又具有高度敏感性 的物质标记到特异性抗原或抗体分子上，通过这些标 记物的增强放大效应来显示反应系统中抗原或抗体的 性质与含量。常用的标记物包括荧光素、酶和放射性 核素等，用这3种标记物进行标记的免疫检测技术被称 为3大免疫标记技术。目前，使用的免疫标记物还有化 学发光物质、铁蛋白和胶体金等
（2）辣根过氧化物酶(HRP)标记抗体的原理 a. 辣根过氧化物酶(Horseradish Peroxidase, HRP ） HRP广泛分布于植物界，它是由无色的酶蛋白和棕色 的铁卟啉结合而成的糖蛋白，糖含量18％。HRP由多个同 功酶组成，分子量为40,000,等电点为pH3～9，酶催化的最 适PH因供氢体不同而稍有差异，但多在pH5左右。酶溶于 水和58％以下的硫酸铵溶液。HRP的辅基和酶蛋白最大吸 收光谱分别为403nm和275nm，一般以OD403nm ／ OD275nm的比值RZ(德文Reinheit Zahl)表示酶的纯度。 HRP的催化反应需要底物过氧化氢(H2O2 )和供氢体 (DH2 )。供氢体多为无色的还原型染料，通过反应可生成有 色的氧化型染料(D)。 HRP DH2＋H2O2────→D＋2H2O
（2）辣根过氧化物酶(HRP)标记抗体的原理 a. 辣根过氧化物酶(Horseradish Peroxidase, HRP ） HRP广泛分布于植物界，它是由无色的酶蛋白和棕色 的铁卟啉结合而成的糖蛋白，糖含量18％。HRP由多个同 功酶组成，分子量为40,000,等电点为pH3～9，酶催化的最 适PH因供氢体不同而稍有差异，但多在pH5左右。酶溶于 水和58％以下的硫酸铵溶液。HRP的辅基和酶蛋白最大吸 收光谱分别为403nm和275nm，一般以OD403nm ／ OD275nm的比值RZ(德文Reinheit Zahl)表示酶的纯度。 HRP的催化反应需要底物过氧化氢(H2O2 )和供氢体 (DH2 )。供氢体多为无色的还原型染料，通过反应可生成有 色的氧化型染料(D)。 HRP DH2＋H2O2────→D＋2H2O
b. 辣根过氧化物酶标记方法 酶标记抗体的制备方法主要有两种，即戊二醛交联法和过 碘酸盐氧化法。 辣根过氧化物酶的标记常用过碘酸盐氧化法，这种方法 法只适用于含糖量较高的酶。过碘酸钠将HRP分子表面的多 糖氧化为醛基，醛基与抗体分子上的氨基形成Schiff碱而结合。 后者可进一步用NaBH４(或乙醇胺)还原生成稳定的酶标记抗 体
b. 辣根过氧化物酶标记方法 酶标记抗体的制备方法主要有两种，即戊二醛交联法和过 碘酸盐氧化法。 辣根过氧化物酶的标记常用过碘酸盐氧化法，这种方法 法只适用于含糖量较高的酶。过碘酸钠将HRP分子表面的多 糖氧化为醛基，醛基与抗体分子上的氨基形成Schiff碱而结合。 后者可进一步用NaBH４(或乙醇胺)还原生成稳定的酶标记抗 体
在酶标过程中一般都混有未结合的酶和抗体。游离酶理 论上不影响最终的显色。但游离的抗体则不同，它会与酶标 抗体竞争固相抗原，从而减少了结合到固相上的酶标抗体的 量。因此需要对制备的酶结合物进行纯化，去除游离的酶和 抗体。纯化的方法很多，硫酸铵盐析法最为简便，但效果并 不理想。用离子交换层析、分子筛法可得到最佳的分离效果， 但费用较贵
在酶标过程中一般都混有未结合的酶和抗体。游离酶理 论上不影响最终的显色。但游离的抗体则不同，它会与酶标 抗体竞争固相抗原，从而减少了结合到固相上的酶标抗体的 量。因此需要对制备的酶结合物进行纯化，去除游离的酶和 抗体。纯化的方法很多，硫酸铵盐析法最为简便，但效果并 不理想。用离子交换层析、分子筛法可得到最佳的分离效果， 但费用较贵
三 材料与器材（略）
三 材料与器材（略）
四 操作步骤 （1）称取5mgHRP溶解于0.5ml蒸馏水中。 （2）向溶液中加入0.5ml新配的0.1M NaIO４溶液，混匀， 4℃静置30分钟。 （3）加入0.16M乙二醇水溶液0.5ml，混匀， 静置30分钟。 （4）加入含5mg抗体的水溶液1ml，混匀装入透析袋，pH9.5 碳酸盐缓冲液透析，4℃过夜
四 操作步骤 （1）称取5mgHRP溶解于0.5ml蒸馏水中。 （2）向溶液中加入0.5ml新配的0.1M NaIO４溶液，混匀， 4℃静置30分钟。 （3）加入0.16M乙二醇水溶液0.5ml，混匀， 静置30分钟。 （4）加入含5mg抗体的水溶液1ml，混匀装入透析袋，pH9.5 碳酸盐缓冲液透析，4℃过夜
（5）加0.2 mL 新配的5 mg/mL NaBH４液，混匀，再置 4 ℃, 2h。 （6）在搅拌下逐滴加入等体积饱和硫酸铵，置4 ℃ 1h。 （7）3000 r/min 离心半小时，弃上清。沉淀物用半饱 和硫酸铵洗二次，最后沉淀物溶于少量0.15moL/L pH7.4 的PBS中。 （8） 将上述溶液装入透析袋中，对0.15 moL/L pH7.4 的PB缓冲盐水透析，去除铵离子后(用萘氏试剂检测)， 10,000 r/min 离心30 min 去除沉淀，上清液即为酶结合 物，分装后，冰冻保存
（5）加0.2 mL 新配的5 mg/mL NaBH４液，混匀，再置 4 ℃, 2h。 （6）在搅拌下逐滴加入等体积饱和硫酸铵，置4 ℃ 1h。 （7）3000 r/min 离心半小时，弃上清。沉淀物用半饱 和硫酸铵洗二次，最后沉淀物溶于少量0.15moL/L pH7.4 的PBS中。 （8） 将上述溶液装入透析袋中，对0.15 moL/L pH7.4 的PB缓冲盐水透析，去除铵离子后(用萘氏试剂检测)， 10,000 r/min 离心30 min 去除沉淀，上清液即为酶结合 物，分装后，冰冻保存
五 注意事项 （1）为提高标记效率，应严格掌握整个反 应体系中的抗体含量。 （2）碘酸钠要新鲜配制
五 注意事项 （1）为提高标记效率，应严格掌握整个反 应体系中的抗体含量。 （2）碘酸钠要新鲜配制
六 思考题 试分析比较各种免疫标记技术的优缺点
六 思考题 试分析比较各种免疫标记技术的优缺点