第十一章食品中化学物质的神经 和神经行为毒理学 近二十年来，随着分子生物学、免疫学、神经科学等学科的不断发展，以及许多先进技 术手段的不断产生及其应用，尤其是对神经系统及各种神经活性物质、受体等的研究，促逃 了人们对神经科学及大脑的认识，也促进了毒理学一个新的分支一 一神经和神经行为毒理学 的发展，使神经及行为毒理学的方法不仅应用在药理学、药物依赖性、药物毒性的评价中， 而日也成为化学物质安全性评价中不可缺少的组成部分。今天，神经与行为毒理学，不仅在 理论和方法学上有所创新和发展，而且在实际中被越来越多的学科所应用。 第一节神经毒理学 神经毒性是指由于接触物理、化学或生物因素而引起神经系统的结构或功能改变，从毒 理学角度来进，品指对正常的神经系统结构和功能带来的损害性改变。神经毒理学 cology)是毒理学的 门分支学科 与神经科学有者密切的联系。 神经毒理学不仅 研究接触毒物号玫的神经系统疾精，而且已成为神经生物学所究装城的共点。神经毒理学主 要研究环境中存在的毒物对人的神经系统毒性效应，包括神经毒物的代谢、毒物的损伤效应 及特性，并研究生化及分子生物学机理，以及神经细胞学及分子生物学机理。 神经毒理学的特点：①是研究低剂量慢性神经毒性的方法：②敏感：③能定量：④可早 期检出亚临床表现，获得早期预防及治疗的机会，可防止不可逆的神经损伤：⑤是监护职业 人群健康的重要措施的补充 一、神经毒性的损伤类型及机理 (一)血-脑及血-神经屏障与神经毒性损伤 血脑屏障系基于脑的微血管周围的特异的内皮细胞及胶质细胞的相互作用。神经系统内 皮细胞的特点为相互联结很紧密，外源性分子必须能通过内皮细胞的细胞膜，而不是通过内 皮细胞之间的间隙。因此某些毒物分子是否能进入脑组织 ,取决于其脂溶性及能否通过内皮 细胞的浆膜。而脑室周围的器官由于不具备紧密连结的特异的内皮细胞，因此血脑屏障功能 薄弱。血液与脑、脊髓及周围神经之间均由连续紧密的特异细胞被盖，在脑及脊髓由脑膜及 脊髓膜在表面被盖，而周围神经则在每根神经纤维均由神经周围细胞包围。胶质细胞如星形 细胞、雪旺(Schwann)细胞竿在血脑屏中的作用研究诉年右新的发展 脑组织中50%的容积为非兴奋性细胞 即神经胶质细胞，其中最多的为星形细胞 其 作用主要是支持神经元，己明确寡树突胶质细胞为髓鞘细胞。星形细胞在谷氨酸代谢中占有 重要位置，谷氨酸是一种兴奋性神经递质，在脑缺血或其他病理情况时，主要由于谷氨酸不 适当地释放，过度激活兴奋性氨基酸受体，导致某些神经元死亡。另外星形细胞可摄取谷氨 酸并通过谷氨酰胺合成酶转化为谷氨酰胺，在氨NH4)存在的条件下可控制细胞外谷氨酸的 浓度，因此对神经元有保护作用。曾有学者用脑皮质培养比 对谷氨酸的敏感度，即脑皮质 与不同浓度的谷氨酸共同培养18~24小时，结果在缺乏星形细胞的环境中神经元死亡较严 重，在缺乏星形细胞的培养液中谷氨酸ECs0为1.9士0.6μmol/L,而在富于星形细胞的培 261
267 第十一章 食品中化学物质的神经 和神经行为毒理学 近二十年来，随着分子生物学、免疫学、神经科学等学科的不断发展，以及许多先进技 术手段的不断产生及其应用，尤其是对神经系统及各种神经活性物质、受体等的研究，促进 了人们对神经科学及大脑的认识，也促进了毒理学一个新的分支——神经和神经行为毒理学 的发展，使神经及行为毒理学的方法不仅应用在药理学、药物依赖性、药物毒性的评价中， 而且也成为化学物质安全性评价中不可缺少的组成部分。今天，神经与行为毒理学，不仅在 理论和方法学上有所创新和发展，而且在实际中被越来越多的学科所应用。 第一节 神经毒理学 神经毒性是指由于接触物理、化学或生物因素而引起神经系统的结构或功能改变，从毒 理学角度来讲，是指对正常的神经系统结构和功能带来的损害性改变。神经毒理学 (Neurotoxicology)是毒理学的一门分支学科，与神经科学有着密切的联系。神经毒理学不仅 研究接触毒物导致的神经系统疾病，而且已成为神经生物学研究领域的热点。神经毒理学主 要研究环境中存在的毒物对人的神经系统毒性效应，包括神经毒物的代谢、毒物的损伤效应 及特性，并研究生化及分子生物学机理，以及神经细胞学及分子生物学机理。 神经毒理学的特点：①是研究低剂量慢性神经毒性的方法；②敏感；③能定量；④可早 期检出亚临床表现，获得早期预防及治疗的机会，可防止不可逆的神经损伤；⑤是监护职业 人群健康的重要措施的补充。 一、神经毒性的损伤类型及机理 （一）血-脑及血-神经屏障与神经毒性损伤 血脑屏障系基于脑的微血管周围的特异的内皮细胞及胶质细胞的相互作用。神经系统内 皮细胞的特点为相互联结很紧密，外源性分子必须能通过内皮细胞的细胞膜，而不是通过内 皮细胞之间的间隙。因此某些毒物分子是否能进入脑组织，取决于其脂溶性及能否通过内皮 细胞的浆膜。而脑室周围的器官由于不具备紧密连结的特异的内皮细胞，因此血脑屏障功能 薄弱。血液与脑、脊髓及周围神经之间均由连续紧密的特异细胞被盖，在脑及脊髓由脑膜及 脊髓膜在表面被盖，而周围神经则在每根神经纤维均由神经周围细胞包围。胶质细胞如星形 细胞、雪旺(Schwann)细胞等在血脑屏障中的作用研究近年有新的发展。 脑组织中 50％的容积为非兴奋性细胞，即神经胶质细胞，其中最多的为星形细胞，其 作用主要是支持神经元，已明确寡树突胶质细胞为髓鞘细胞。星形细胞在谷氨酸代谢中占有 重要位置，谷氨酸是一种兴奋性神经递质，在脑缺血或其他病理情况时，主要由于谷氨酸不 适当地释放，过度激活兴奋性氨基酸受体，导致某些神经元死亡。另外星形细胞可摄取谷氨 酸并通过谷氨酰胺合成酶转化为谷氨酰胺，在氨(NH4)存在的条件下可控制细胞外谷氨酸的 浓度，因此对神经元有保护作用。曾有学者用脑皮质培养比较对谷氨酸的敏感度，即脑皮质 与不同浓度的谷氨酸共同培养 18~24 小时，结果在缺乏星形细胞的环境中神经元死亡较严 重，在缺乏星形细胞的培养液中谷氨酸 EC50 为 1.9±0.6μmol／L，而在富于星形细胞的培
养液中则为194士43μmol/L,即谷氨酸毒性在显形细胞缺乏的条件较富于星形细胞者高 OO倍。其机理可能是星形细胞的保护作用，即树突草NMDACN-methvl-D-as 的星形细胞的物理性的防护作用。此类受体可能对谷氨酸毒性更敏感，是由于树突对巨大而 强的NMD 受体激发的钙内流有 一种特殊的机理。还有 种解释，即星形细胞有 一种 谷氨酸的摄取系统，可减少细胞外的谷氨酸的浓度。而事实上如在缺氧、低血糖、肝性脑病 代谢性毒物，使星形细胞功能改变时，则可因谷氨酸毒性导致神经元损伤或致死。重金属导 致的神经毒时，在是形细胞内聚集甲基汞、铅。成人不易发生铅脑病，主要由于星形细胞可 如星形细胞与甲基汞 三甲基锡的神经毒的关系。观察甲基 三甲 KATP酶 性及离 子通透性的影响，证实 者的浓 年低 10mc /L,即可改变K的流入及流出，K*流入受抑主要由于Na-K-ATP酶受抑。另外如1.甲基 -4酚基四氢吡啶(l-methyl-4 phenyl-l,2,3,6 -tetrahydro pyridine)MPTP导致的神经毒见于 人的黑质纹状体的多巴胺能神经元，已证实在MPTP导致的神经毒性中基因表达与星形细 胞代谢有关。 形细胞在中枢神经系统及免疫系统间的作用：星形细胞参与自身免疫异常的多发性硕 化症。新生小鼠的脑培养加入脂多糖后，发现星形细胞可分泌白细胞介素-1(L1),山】可 激活脑内的T细胞，因L1可促使产生L-2及在T细胞的L-2表达的受体，据此说明在中 枢神经系统的星形细胞介入免疫过程。此外星形细胞尚分泌L3样因子及颗粒巨噬细胞刺 激因子，这些因子也参与免疫过程。 之 评价化 学物导致的细胞毒性在动物整体探索很困难，因涉及很多因素如神经、体 液及体内血液动力学。因此可利用星形细胞与脑实质共同培养来探索显形细胞在神经变性类 的疾患中的作用及机理。 (二)神经元员伤Neurononathies 某些毒物对一些神经元或某种神经元旱特异损伤，若亚重时可使神经元死亡。一个神经 元丢失不但不可修复，而且使树突及轴和轴的髓鞘均出现变性，这些改变可见于周围神经及 中枢神经系统。神经元开始出现损伤，继之发4 ,最终导致永久性丢尖 毒物作用呈选 择性地损伤一种神经元，也可选择不同神经元的亚群，表现为弥漫性脑病，但症状根据神经 毒的选择性毒性往往仅表现一种特殊的功能障碍，如甲基汞(methyl mercury)污染的食物，可 引起居民中毒，临床表现根据接触毒物的程度及年龄的不同表现不一致，在成人最严重的损 伤为视皮层的神经元及小脑皮层的小的内颗粒细胞神经元出现大量的变性传导性明显的运 动失调。儿童可见广泛的神经元丢失 重时可导致智力迟钝及麻痹。 对损伤机理己进行了 大量研究，并对各种细胞功能如糖分解、核酸生物合成、有氧呼吸、蛋白合成及递质释放等 的障碍进行了探索，但致细胞死亡的机理尚不明确。另外，如三甲基锡((trimeyltin)多用于增 塑剂、抗真菌药或其他农药。三甲基锡中毒在人可表现为严重不可修复的边缘一脑综合征 (Limbie.,cerebellar syndrome。在灵长类可表现为相似的行为变化。主要病变为欧漫性神经 元病，损伤的机理未定。损伤的表现开始呈神经系统的神经元聚积包含高尔基体(Cg)样结 构的细胞浆体，继之出现细胞肿胀及坏死。在此损伤过程中海马受损严重。关于 三甲基锡 经毒的机理，存在某些假说，如能量的丧失及兴奋性毒性的损伤。此外，在三甲基锡敏感的 神经元中存在一种蛋白即stannin,其作用尚待研究确定。 (三)轴病(Axonopathies) 268
268 养液中则为 194±43μmol／L，即谷氨酸毒性在星形细胞缺乏的条件较富于星形细胞者高 100 倍。其机理可能是星形细胞的保护作用，即树突膜 NMDA(N-methyl-D-as-partate)—受体 的星形细胞的物理性的防护作用。此类受体可能对谷氨酸毒性更敏感，是由于树突对巨大而 强的 NMDA—受体激发的钙内流有一种特殊的机理。还有一种解释，即星形细胞有一种对 谷氨酸的摄取系统，可减少细胞外的谷氨酸的浓度。而事实上如在缺氧、低血糖、肝性脑病、 代谢性毒物，使星形细胞功能改变时，则可因谷氨酸毒性导致神经元损伤或致死。重金属导 致的神经毒时，在星形细胞内聚集甲基汞、铅。成人不易发生铅脑病，主要由于星形细胞可 摄取铅。探讨较多者，如星形细胞与甲基汞、三甲基锡的神经毒的关系。观察甲基汞、三甲 基锡对星形细胞的 Na+ -K+ -ATP 酶活性及离子通透性的影响，证实二者的浓度低至 10-5mol ／L，即可改变 K+的流入及流出，K+流入受抑主要由于 Na+ -K+ -ATP 酶受抑。另外如 1-甲基 -4-酚基四氢吡啶(1-methyl-4-phenyl-1，2，3，6-tetrahydro pyridine)MPTP 导致的神经毒见于 人的黑质纹状体的多巴胺能神经元，已证实在 MPTP 导致的神经毒性中基因表达与星形细 胞代谢有关。 星形细胞在中枢神经系统及免疫系统间的作用：星形细胞参与自身免疫异常的多发性硬 化症。新生小鼠的脑培养加入脂多糖后，发现星形细胞可分泌白细胞介素-1(IL-1)，IL-1 可 激活脑内的 T 细胞，因 IL-1 可促使产生 IL-2 及在 T 细胞的 IL-2 表达的受体，据此说明在中 枢神经系统的星形细胞介入免疫过程。此外星形细胞尚分泌 IL-3 样因子及颗粒-巨噬细胞刺 激因子，这些因子也参与免疫过程。 总之，评价化学物导致的细胞毒性在动物整体探索很困难，因涉及很多因素如神经、体 液及体内血液动力学。因此可利用星形细胞与脑实质共同培养来探索星形细胞在神经变性类 的疾患中的作用及机理。 （二）神经元损伤(Neuronopathies) 某些毒物对一些神经元或某种神经元呈特异损伤，若严重时可使神经元死亡。一个神经 元丢失不但不可修复，而且使树突及轴和轴的髓鞘均出现变性，这些改变可见于周围神经及 中枢神经系统。神经元开始出现损伤，继之发生坏死，最终导致永久性丢失。毒物作用呈选 择性地损伤一种神经元，也可选择不同神经元的亚群，表现为弥漫性脑病，但症状根据神经 毒的选择性毒性往往仅表现一种特殊的功能障碍，如甲基汞(methyl mercury)污染的食物，可 引起居民中毒，临床表现根据接触毒物的程度及年龄的不同表现不一致，在成人最严重的损 伤为视皮层的神经元及小脑皮层的小的内颗粒细胞神经元出现大量的变性传导性明显的运 动失调。儿童可见广泛的神经元丢失，严重时可导致智力迟钝及麻痹。对损伤机理已进行了 大量研究，并对各种细胞功能如糖分解、核酸生物合成、有氧呼吸、蛋白合成及递质释放等 的障碍进行了探索，但致细胞死亡的机理尚不明确。另外，如三甲基锡(trimeyltin)多用于增 塑剂、抗真菌药或其他农药。三甲基锡中毒在人可表现为严重不可修复的边缘—脑综合征 (Limbie，cerebellar syndrome)。在灵长类可表现为相似的行为变化。主要病变为弥漫性神经 元病，损伤的机理未定。损伤的表现开始呈神经系统的神经元聚积包含高尔基体(Colgi)样结 构的细胞浆体，继之出现细胞肿胀及坏死。在此损伤过程中海马受损严重。关于三甲基锡神 经毒的机理，存在某些假说，如能量的丧失及兴奋性毒性的损伤。此外，在三甲基锡敏感的 神经元中存在一种蛋白即 stannin，其作用尚待研究确定。 （三）轴病(Axonopathies)
神经毒性原发部位在轴即称为轴病。轴及包围轴的髓鞘均发生变性，但神经元的胞体完 好无损。过去(Caranogh,1964)将“返死轴病”称为轴病，认为毒性作用部位包括神经元细 延瑞精从突触返向细胞然发生进行性变性。现代通过大量研究。轴病可的不 沿轴 长的某些点从轴的远端发生 “化学性横 体生物 式分 由于毒性损伤的靶点长轴较短轴多，所以长轴易受毒物损伤出现轴病。中枢神经系统长轴损 伤如后索的上行性感觉轴或下行性运动轴，沿长的周围神经系统的感觉及运动轴上行及下 行，毒性轴病易发生于远端轴，因此称为“中枢周围的远端轴病”。但中枢神经系统的轴变 性与周围神经系统的轴变性完全不同，在同样的损伤条件下后者可部分修复，轻症时可完全 修复，但前者则否 致轴病的神经毒物很多，许多工业化学毒物、农药、某些食物添加剂、治疗用药物、重 金属均为神经毒物。 常见的轴病如有机磷三磷甲苯磷酸酯(TOCP,Tri-o-cmsyl phoshate)引起的中枢周围远端 轴病，此种轴病并非胆碱能中毒。在美国曾发生饮料的TOCP污染、橄横油掺入TOCP等， 人误用后，出现麻痹 疏水性的有机磷化合物易进入神经系统，其作用机理为有机磷化合物使生物大分子烷化 或磷酸化，可导致人或动物的迟发性神经毒。有机磷酯在神经系统存在多种靶，目前对导到 迟发性神经毒的靶尚未清楚。其他的酯酶活性或“神经酯酶”N正)可被神经毒性有机磷 指抑制。有机魔指对轴毒性的效能及其抑制NE的效能，在体内或培养系统中呈相关关系。 并非所有的有机磷酯均可导致迟发性神经毒。 在急性有 磷酯接触 后 ,并非立 出现轴变性 般在急性高剂量接触及临床出现轴病 之间间隔7~10天。周围神经系统的轴病可逐步修复，但若反复接触可导致顽固性脊随的轴 变性，且进行性发展为类似于多发性硬化症的病变。 (四)微管相关的神经毒一一周用神经病(neuropathy) 关于微管在轴的转运及保留轴的功能方面尚待阐明。在从植物提取某些生物碱后，对研 究此方面工作创造了条件。长春花碱及秋水仙素可结合微管蛋白以阻止这种蛋白的亚基缔合 而形成微管。长春新碱为长春花生物碱的一种，临床利用此生物碱对微管的直接作用 有丝分裂活性治疗白血病。秋水仙素在临床用于治疗痛风。此两种微管抑制物在临床成为周 围神经病的原因。 近年从植物提取紫杉醇(tax),与微管呈明显不同的相互作用。当微管堆集及稳定于微 物神经病。 己证实秋水仙素及长春花生物碱可致微管的去极化，而紫杉醇使微管稳定导致轴病。己 证明微管在体外呈动态平衡，微管呈平衡状态的同时，解离亚基。在体内此过程发生时微管 蛋白移入轴。因出微管经常地缔合及解离。在动态平的状态时，紫杉醇及长春花生物破发 挥其毒性作用阻止微管蛋白的两个池的交换（即阻止缔合及解离的交换）。形态学上此两种情 况不同，在用秋水仙素时，轴呈菱缩状态，轴内微管较少。相反，接触紫杉醇时，在轴内微 管很多聚积为排列的微管。此两种情况干扰了轴的快速转运，但紫杉醇接触后的情况尚未非 常肯定。总之，此两种情况均可导致周围神经病。 269
269 神经毒性原发部位在轴即称为轴病。轴及包围轴的髓鞘均发生变性，但神经元的胞体完 好无损。过去(Caranogh，1964)将“返死轴病”称为轴病，认为毒性作用部位包括神经元细 胞体及远端轴从突触返向细胞体发生进行性变性。现代通过大量研究，轴病可由不同的病因 引起，沿轴长的某些点从轴的远端发生“化学性横断”样变性，与胞体以生物学方式分离。 由于毒性损伤的靶点长轴较短轴多，所以长轴易受毒物损伤出现轴病。中枢神经系统长轴损 伤如后索的上行性感觉轴或下行性运动轴，沿长的周围神经系统的感觉及运动轴上行及下 行，毒性轴病易发生于远端轴，因此称为“中枢周围的远端轴病”。但中枢神经系统的轴变 性与周围神经系统的轴变性完全不同，在同样的损伤条件下后者可部分修复，轻症时可完全 修复，但前者则否。 致轴病的神经毒物很多，许多工业化学毒物、农药、某些食物添加剂、治疗用药物、重 金属均为神经毒物。 常见的轴病如有机磷三磷甲苯磷酸酯(TOCP，Tri-o-cmsyl phoshate)引起的中枢周围远端 轴病，此种轴病并非胆碱能中毒。在美国曾发生饮料的 TOCP 污染、橄榄油掺入 TOCP 等， 人误用后，出现麻痹。 疏水性的有机磷化合物易进入神经系统，其作用机理为有机磷化合物使生物大分子烷化 或磷酸化，可导致人或动物的迟发性神经毒。有机磷酯在神经系统存在多种靶，目前对导致 迟发性神经毒的靶尚未清楚。其他的酯酶活性或“神经靶酯酶”(NTE)可被神经毒性有机磷 酯抑制。有机磷酯对轴毒性的效能及其抑制 NTE 的效能，在体内或培养系统中呈相关关系。 并非所有的有机磷酯均可导致迟发性神经毒。 在急性有机磷酯接触后，并非立即出现轴变性，一般在急性高剂量接触及临床出现轴病 之间间隔 7～10 天。周围神经系统的轴病可逐步修复，但若反复接触可导致顽固性脊髓的轴 变性，且进行性发展为类似于多发性硬化症的病变。 （四）微管相关的神经毒——周围神经病(neuropathy) 关于微管在轴的转运及保留轴的功能方面尚待阐明。在从植物提取某些生物碱后，对研 究此方面工作创造了条件。长春花碱及秋水仙素可结合微管蛋白以阻止这种蛋白的亚基缔合 而形成微管。长春新碱为长春花生物碱的一种，临床利用此生物碱对微管的直接作用——抗 有丝分裂活性治疗白血病。秋水仙素在临床用于治疗痛风。此两种微管抑制物在临床成为周 围神经病的原因。 近年从植物提取紫杉醇(taxd)，与微管呈明显不同的相互作用。当微管堆集及稳定于微 管的聚集型时，紫杉醇与微管结合，在低温或钙存在时微管可正常地解离为微管蛋白的亚基。 紫杉醇已用于临床治疗某些癌。但已发现大量使用这种化合物的患者出现感觉运动轴病或植 物神经病。 已证实秋水仙素及长春花生物碱可致微管的去极化，而紫杉醇使微管稳定导致轴病。已 证明微管在体外呈动态平衡，微管呈平衡状态的同时，解离亚基。在体内此过程发生时微管 蛋白移入轴。因此微管经常地缔合及解离。在动态平衡的状态时，紫杉醇及长春花生物碱发 挥其毒性作用阻止微管蛋白的两个池的交换(即阻止缔合及解离的交换)。形态学上此两种情 况不同，在用秋水仙素时，轴呈萎缩状态，轴内微管较少。相反，接触紫杉醇时，在轴内微 管很多聚积为排列的微管。此两种情况干扰了轴的快速转运，但紫杉醇接触后的情况尚未非 常肯定。总之，此两种情况均可导致周围神经病
(五)髓特病(mvelinopathies 毒物可导致髓鞘板分离称为髓鞘内水肿，洗择性的髓鞘手失称之为脱骑鞘。萄鞘内水时 可由 髓鞘基础 mRNA转录水平改变，在发展的早期可修复。但在开始期可发展为 段性脱髓鞘，髓鞘从轴脱尖 ,节段性脱髓鞘也可由于对髓鞘细胞直接毒作用。在节段性脱金 鞘后，在周围神经系统常见由雪旺细胞将裸露的结间(intemode)再髓鞘化，在中枢神经系统 仅见有限的范围进行再髓鞘化。在周围神经节段性脱髓鞘后再髓鞘化涉及多数雪旺细胞，结 果结间长度即朗飞结Ranvier node)间的距离1较正常明显减短，而且为股髓销的永久的改 变。 导致脱髓鞘的化合物有的在人体己有接触，且己明确其导致脱髓鞘的过程及再修复的过 一般脱髓鞘的功能上的改变与脱髓鞘的范围可局限于中枢神经系统或周围神经系统，或 其效应更弥漫。这些中毒性脱髓椭病，其髓鞘破坏若呈弥漫性，可发生严重的神经病，如限 于周围神经系统，则仅表现周围神经病的症状」 铅1cad: 动物接铅可导致周用神经 并出现的节性髓魈改变。对人的 神经毒性较大鼠变异大 在其他器官的铅的毒性也不同。数个世纪以来已重视铅的神经毒性 现代成人职业接触铅污染机会增多，有些地区环境中含铅水平较高，致居民血中铅水平较高 儿童尤其小于5岁的儿童在同样环境中血铅水平比成人高，此多由于经口接触铅，如接触合 铅的颜料碎屑等所致。 年幼的儿童急性接触大量铅污染而导致严重的脑水肿，或损伤内皮细胞。铅性脑病儿童 较成人明品 成人慢性铅中毒易导致周围神经病，且伴随神经系统以外的病，如胃 、腹部绞痛、贫 血，及铅在特殊解剖部位沉着，如在齿龈的沿线及在长骨骨髓的铅线。对人体周围神经的铅 效应不完全清楚，通过电生理的观察证实神经传导减慢，在动物实验见到节段性脱髓鞘。在 人出有铅导致的神经病可见到典型的轴病，而日主要侵犯云动轴的病人出有运动性神经病】 虽然急性及慢性铅接触的表现早己明确，在近年才注意到接触很低水平的铅的儿童虽无 状，但实际存在智能方面的有害效应。开始的报告提示儿童的血铅轻度升高 其在学校的 为相关：最近注意到儿童脱落的牙齿中铅的水平升高及行为测试用词能力、注意力和非适应 性行为相关。关于此问题存在某些争议，如认为儿童有较高水平的血铅，可能与其他某些环 境因素，如社会经济状态、双亲的教有水平等有关。但虽然人的情况较复杂，而铅的接触对 儿童智力有有害影响，动物实验模型证实接触铅及脑功能障碍一者是伴随的 (六)神经传递与神经毒性 多数神经毒物可损伤神经系统细胞结构，并有解剖学根据。在某些情况下，神经系 统的功能障碍并未见细胞结构的改变，但在行为功能测试时神经毒的表现为行为改变或行为 障碍。事实上神经毒物导致的有解剖根据的细胞损伤，首先通过测试神经病学的功能障碍， 而证实是由于神经毒所致的细胞损伤。 这些毒物的分子生物学机理现尚不清楚，但这些化合物的化学作用的基础是明确的 这些化合物主要使神经传递过程发生障碍。根据神经药理学提出有时神经传导中断对 体是有利的。但过度或不适合的接触化学物所出现的神经传导改变可能系神经毒理学的 特点。 此类化合物如尼古丁(nicotine)、可卡因(cocaine)、兴奋性氨基酸(excitatory amino acids)
270 （五）髓鞘病(myelinopathies) 毒物可导致髓鞘板分离称为髓鞘内水肿，选择性的髓鞘丢失称之为脱髓鞘。髓鞘内水肿 可由于髓鞘基础蛋白 mRNA 转录水平改变，在发展的早期可修复。但在开始期可发展为节 段性脱髓鞘，髓鞘从轴脱失。节段性脱髓鞘也可由于对髓鞘细胞直接毒作用。在节段性脱髓 鞘后，在周围神经系统常见由雪旺细胞将裸露的结间(intemode)再髓鞘化，在中枢神经系统 仅见有限的范围进行再髓鞘化。在周围神经节段性脱髓鞘后再髓鞘化涉及多数雪旺细胞，结 果结间长度[即朗飞结(Ranvier node)间的距离]较正常明显减短，而且为脱髓鞘的永久的改 变。 导致脱髓鞘的化合物有的在人体已有接触，且已明确其导致脱髓鞘的过程及再修复的过 程。一般脱髓鞘的功能上的改变与脱髓鞘的范围可局限于中枢神经系统或周围神经系统，或 其效应更弥漫。这些中毒性脱髓鞘病，其髓鞘破坏若呈弥漫性，可发生严重的神经病，如限 于周围神经系统，则仅表现周围神经病的症状。 铅(1ead)：动物接触铅可导致周围神经病，并出现显著的节段性脱髓鞘改变。铅对人的 神经毒性较大鼠变异大，在其他器官的铅的毒性也不同。数个世纪以来已重视铅的神经毒性。 现代成人职业接触铅污染机会增多，有些地区环境中含铅水平较高，致居民血中铅水平较高。 儿童尤其小于 5 岁的儿童在同样环境中血铅水平比成人高，此多由于经口接触铅，如接触含 铅的颜料碎屑等所致。 年幼的儿童急性接触大量铅污染而导致严重的脑水肿，或损伤内皮细胞。铅性脑病儿童 较成人明显。 成人慢性铅中毒易导致周围神经病，且伴随神经系统以外的病，如胃炎、腹部绞痛、贫 血，及铅在特殊解剖部位沉着，如在齿龈的沿线及在长骨骨髓的铅线。对人体周围神经的铅 效应不完全清楚，通过电生理的观察证实神经传导减慢，在动物实验见到节段性脱髓鞘。在 人患有铅导致的神经病可见到典型的轴病，而且主要侵犯运动轴的病人患有运动性神经病。 虽然急性及慢性铅接触的表现早已明确，在近年才注意到接触很低水平的铅的儿童虽无症 状，但实际存在智能方面的有害效应。开始的报告提示儿童的血铅轻度升高与其在学校的行 为相关；最近注意到儿童脱落的牙齿中铅的水平升高及行为测试用词能力、注意力和非适应 性行为相关。关于此问题存在某些争议，如认为儿童有较高水平的血铅，可能与其他某些环 境因素，如社会经济状态、双亲的教育水平等有关。但虽然人的情况较复杂，而铅的接触对 儿童智力有有害影响，动物实验模型证实接触铅及脑功能障碍二者是伴随的。 （六）神经传递与神经毒性 1. 多数神经毒物可损伤神经系统细胞结构，并有解剖学根据。在某些情况下，神经系 统的功能障碍并未见细胞结构的改变，但在行为功能测试时神经毒的表现为行为改变或行为 障碍。事实上神经毒物导致的有解剖根据的细胞损伤，首先通过测试神经病学的功能障碍， 而证实是由于神经毒所致的细胞损伤。 这些毒物的分子生物学机理现尚不清楚，但这些化合物的化学作用的基础是明确的。 这些化合物主要使神经传递过程发生障碍。根据神经药理学提出有时神经传导中断对个 体是有利的。但过度或不适合的接触化学物所出现的神经传导改变可能系神经毒理学的 特点。 此类化合物如尼古丁(nicotine)、可卡因(cocaine)、兴奋性氨基酸(excitatory amino acids)
等可中断冲动的传导，阻滞或加强突触的传递或干扰第二信号系统。这些化合物的急性效应 直接与在作用部位的即刻浓度有关，即直接与药物在血中浓度有关。许多结构类似的化学物 的作用也相似。如某些药物的作用与交感神经系统的神经传导过程相似，即称为拟交感神经 化学物 于这些药物的靶分布全身，其副作用持 续时间 ,易修复 用其拮抗物得 修复，如长时间使用则可导致不可修复。如吩噻嗪(phenothiazines)长期治疗精神分裂症，可 出现迟发性运动困难，且水久在面部遗留怪相。 2.神经毒性影响神经传递的机理 神经传递参与主要环节有神经元的突触、神经递质、第二信号系统，离子通道等。 神经毒物作用于突触可影响递质合成 、储存及释放 并干扰递质的灭活和清除，递质与 受体的作用，或毒物与受体结合，改变膜的离子泵和离子通道。 神经毒物作用于神经递质的代谢，可影响递质中间代谢、合成及降解。 3.神经毒性影响神经细胞的第二信号系统，受体的特异激动剂肌醇磷酸酯及其分解产 物P3等的研究可了解毒物对受体的特异激动剂的影响。 钙在第二信号系统中有重要作用，如神经毒物可使细胞内Ca增高，胞内游离钙升高又 可通过钙调素CaM依赖性早反 因发 1cfos和cmc快速短时间表达。 观察C 及c-fos及c-myc均可提示神经毒物对第二信号系统的影响. 近年的研究发现一氧化氮NO)的神经毒性，尤其是兴奋性神经毒性：已证实O介入谷 氨酸的神经毒性」 4离子诵道与神经毒性，钙诵道及钠道均系申压门控离子诵道。钙诵道对神经递丽 和激素释放、动作年 位生成和兴奋收缩等均很重要 是神 毒素及神经毒物的靶。钙通道 为4型，即T、L、N、P型。神经毒性可阻断不同型的钙通道，发挥不同的作用。可通过形 片钳方法研究某些毒物或药物与受体钙通道复合体的相互作用。杀虫剂、重金属、某些药物 均可干扰钠通道，多为阻断钠通道的作用，如拟除虫菊酯主要使神经元钠通道关闭延迟，神 经元持续夫极化，导致神经系统讨度兴奋，出现惊厥抽搐、需额、易激惹、舞丽、云动失语 综合征。局部麻醉药如普鲁卡因等的作用为阻 新钠及钾通道 达到局部麻醉的作用。其他如 抗精神病药物可以通过阻断神经元及心肌细胞的钠及钙通道达到治疗作用 二、迟发性神经毒性 迟发性神经毒性(delayed toxicity),于1930年已有报道，见于人及动物，多见于有机磷 农药中毒后，此类农药为胆碱酯酶抑制剂，但并非所有这种抑制剂均有迟发性神经毒性作用。 迟发性神经毒性是指中毒症状发生之后约814天，再出现较持久的神经中毒症状，主要表 现为弛缓性麻 界马 ,而后出现脊随损伤体征，如共济失调或强直等 。神经细胞损伤的特 点是轴突变性，引起维发性髓鞘变化： 一)迟发性神经毒性的表现及神经组织学所见 迟发性神经毒性的种属差异较明显，人最敏感。动物以成年母鸡最敏感，猫次之，大、 小鼠敏感性低。人及敏感性高的动物表现较严重，橘感性弟的动物表现轻。 人的临床表现为坐骨神经麻痹 轻症者多呈弛缓性麻痹 一般经2年可恢复。严重者呈 痉挛性麻痹，可持续多年，有的甚至持续至死亡。 动物的表现开始呈全身无力状态，下肢衰弱。后出现步态异常或运动共济失调，逐步发 展为站立困难，甚至下肢活动受限，下肢弛缓性麻痹或轻瘫，一般从下肢远端开始，后扩展 210
271 等可中断冲动的传导，阻滞或加强突触的传递或干扰第二信号系统。这些化合物的急性效应 直接与在作用部位的即刻浓度有关，即直接与药物在血中浓度有关。许多结构类似的化学物 的作用也相似。如某些药物的作用与交感神经系统的神经传导过程相似，即称为拟交感神经 化学物。由于这些药物的靶分布全身，其副作用持续时间短，易修复，也可用其拮抗物得到 修复，如长时间使用则可导致不可修复。如吩噻嗪(phenothiazines)长期治疗精神分裂症，可 出现迟发性运动困难，且永久在面部遗留怪相。 2. 神经毒性影响神经传递的机理 神经传递参与主要环节有神经元的突触、神经递质、第二信号系统，离子通道等。 神经毒物作用于突触可影响递质合成、储存及释放，并干扰递质的灭活和清除，递质与 受体的作用，或毒物与受体结合，改变膜的离子泵和离子通道。 神经毒物作用于神经递质的代谢，可影响递质中间代谢、合成及降解。 3. 神经毒性影响神经细胞的第二信号系统，受体的特异激动剂肌醇磷酸酯及其分解产 物 IP3 等的研究可了解毒物对受体的特异激动剂的影响。 钙在第二信号系统中有重要作用，如神经毒物可使细胞内 Ca2+增高，胞内游离钙升高又 可通过钙调素 CaM 依赖性早反应基因如 c-fos 和 c-myc 快速短时间表达。观察 Ca2+、CaM 及 c-fos 及 c-myc 均可提示神经毒物对第二信号系统的影响。 近年的研究发现一氧化氮(NO)的神经毒性，尤其是兴奋性神经毒性：已证实 NO 介入谷 氨酸的神经毒性。 4. 离子通道与神经毒性；钙通道及钠通道均系电压门控离子通道。钙通道对神经递质 和激素释放、动作电位生成和兴奋收缩等均很重要，是神经毒素及神经毒物的靶。钙通道分 为 4 型，即 T、L、N、P 型。神经毒性可阻断不同型的钙通道，发挥不同的作用。可通过膜 片钳方法研究某些毒物或药物与受体钙通道复合体的相互作用。杀虫剂、重金属、某些药物 均可干扰钠通道，多为阻断钠通道的作用，如拟除虫菊酯主要使神经元钠通道关闭延迟，神 经元持续去极化，导致神经系统过度兴奋，出现惊厥抽搐、震颤、易激惹、舞蹈、运动失调 综合征。局部麻醉药如普鲁卡因等的作用为阻断钠及钾通道，达到局部麻醉的作用。其他如 抗精神病药物可以通过阻断神经元及心肌细胞的钠及钙通道达到治疗作用。 二、迟发性神经毒性 迟发性神经毒性(delayed toxicity)，于 1930 年已有报道，见于人及动物，多见于有机磷 农药中毒后，此类农药为胆碱酯酶抑制剂，但并非所有这种抑制剂均有迟发性神经毒性作用。 迟发性神经毒性是指中毒症状发生之后约 8~14 天，再出现较持久的神经中毒症状，主要表 现为弛缓性麻痹或轻瘫，而后出现脊髓损伤体征，如共济失调或强直等。神经细胞损伤的特 点是轴突变性，引起继发性髓鞘变化。 （一）迟发性神经毒性的表现及神经组织学所见 迟发性神经毒性的种属差异较明显，人最敏感。动物以成年母鸡最敏感，猫次之，大、 小鼠敏感性低。人及敏感性高的动物表现较严重，敏感性差的动物表现轻。 人的临床表现为坐骨神经麻痹，轻症者多呈弛缓性麻痹，一般经 2 年可恢复。严重者呈 痉挛性麻痹，可持续多年，有的甚至持续至死亡。 动物的表现开始呈全身无力状态，下肢衰弱。后出现步态异常或运动共济失调，逐步发 展为站立困难，甚至下肢活动受限，下肢弛缓性麻痹或轻瘫，一般从下肢远端开始，后扩展
至下肢近端即大腿部，最后可见脊髓损伤表现，如运动共济失调和痉挛。 神经组织学所见，最多见的病理学政变为轴突的肿胀，此可见于华骨神经及着骑的切片 继之发展为轴突的退行性变性 可见空泡化、凝聚及碎片化，最后可见鞘降解或消 重的病变可见脊随 织结构的部分消尖 。根据组织病理学所见，提示神经组织损伤的严重性 及损伤程度与染毒剂量有关，呈剂量反应关系。 申锫所见：临床定状出现第一天，脊骑的白质已出现异常结构变化。在开始期轴奖的沿 面内质网，出现空泡扩张，正常的壶结构呈管样伸长，并伴随空泡结构增殖形成致密的堆 积，同时出现正常的神经细丝轴的亚结构减少，而且有一部分形成颗粒样碎片。在退 期髓 李成为g 状或卵圆 聚政变在 质的 前的终端较脊髓白 质者明 有些神经终端明显增大，而且最多的结构异常为增殖的囊胞成分的聚积及凝集。扭曲的神经 细丝结构也可在突触前终端见到，较多的见于致密的亚细胞结构。 (二)影响迟发性神经毒性作用的因素①有机磷化合物的结构及剂量大小，接触频率 和持续的时间。②染毒方式（经口或经皮 有机磷化合物生物转化及代谢动力学的不同 不同的物种 对同 物铺成性 不同主要 于此化合 物 不同的 内的代谢动力学不 同。如对溴磺，大鼠及小鼠对其不很敏感 主要由于在大及小鼠体内代谢转化快，且代谢 物迅速经尿排出，而母鸡及猫体内代谢转化及排出体外的速度仅为小鼠的1/31，所以母鸡 及猫比较敏感。在体内代谢和排泄相对较慢，且中等度急性毒性的有机磷化合物才能在体内 靶部位蓄积达到迟发性神经毒性作用的阀剂量 )迟发性神经毒性的作用机理 以前，对迟发性神经毒性作用的机理仅基于成年鸡 的试验所见到的有机磷化合物引起的神经麻骋与人的神经毒靶酯酶的抑制相符，提出迟发性 神经毒性作用的机理为神经毒酯酶(NE)持久的抑制。近年发现有机磷酸酯与神经系统中 靶蛋白（丁酰胆碱酯酶和神经毒酯酶）亲和力较强，与有机磷酸酯类结合，并暂时贮存，使动 物避免受到有机磺化合物的急性责性损害。此后非脚蛋白结合的有机砖酸类家步被释放」 通过蛋白转运过程到达神经毒靶组织，并逐渐蓄积， 当达到中作用制量时，即出现中动 症状。动物试验结果损 示有机磷化合物 一次剂量或多次剂量与非靶蛋白的特异性结合，均 达到阈剂量，且其释放与蓄积达到岗剂重的时间即相当于染毒一次剂量后到出现运动共济 调的时间间隔。神经细胞变性及溶酶体膜受损与迟发性神经毒性作用也有关，同时可见血浆 中酸性碳酸酶活性增加。另外，有机磷化合物对神经细胞中快速抽浆运转过程有干扰作用 致使快辣轴浆运转发生障碍。对迟发性神经毒性的出现有一定的作用。 四)具有迟发性神经毒性作用的有机磷化合 二甲苯磷酸酯(TOCP 丙胺氟磷 丙氯磷(DFP),对溴磷（即溴苯磷）， 三硫磷，苯硫磷(EPN)、脱叶磷(DEF,皮蝇磷，壤虫磷 草特磷(DMPA),敌敌畏和敌百虫等 975年WHO(世界卫生组织)已将迟发性神经毒性试验列入有机磷农药毒性试验的观察 项目。 (五)识发性神经瘴性试路 迟发性神经毒性试验的要点如下 选用遗传背景明确、健康、步态正常的母鸡（莱享鸡），鸡龄814个月，体重1.5-2kg 每剂量组母鸡数量应保证在观察结束时存活至少有6只。一般设高、中、低三个剂量组， 一个阳性对照组和一个阴性对照组。高剂量一般采用LD50剂量，观察期结束时可引起试验
272 至下肢近端即大腿部，最后可见脊髓损伤表现，如运动共济失调和痉挛。 神经组织学所见，最多见的病理学改变为轴突的肿胀，此可见于坐骨神经及脊髓的切片， 继之发展为轴突的退行性变性，可见空泡化、凝聚及碎片化，最后可见髓鞘降解或消失。严 重的病变可见脊髓组织结构的部分消失。根据组织病理学所见，提示神经组织损伤的严重性 及损伤程度与染毒剂量有关，呈剂量-反应关系。 电镜所见：临床症状出现第一天，脊髓的白质已出现异常结构变化。在开始期轴浆的滑 面内质网，出现空泡扩张，正常的囊胞结构呈管样伸长，并伴随空泡结构增殖形成致密的堆 积，同时出现正常的神经细丝轴的亚结构减少，而且有一部分形成颗粒样碎片。在退行变末 期髓鞘破碎成为罗纹状或卵圆形。轴浆改变在灰质的突触前的终端较脊髓白质者明显增多。 有些神经终端明显增大，而且最多的结构异常为增殖的囊胞成分的聚积及凝集。扭曲的神经 细丝结构也可在突触前终端见到，较多的见于致密的亚细胞结构。 （二）影响迟发性神经毒性作用的因素 ①有机磷化合物的结构及剂量大小，接触频率 和持续的时间。②染毒方式(经口或经皮)。③有机磷化合物生物转化及代谢动力学的不同， 不同的物种对同一化合物敏感性不同主要由于此化合物在不同的物种体内的代谢动力学不 同。如对溴磷，大鼠及小鼠对其不很敏感，主要由于在大及小鼠体内代谢转化快，且代谢产 物迅速经尿排出，而母鸡及猫体内代谢转化及排出体外的速度仅为小鼠的 1／31，所以母鸡 及猫比较敏感。在体内代谢和排泄相对较慢，且中等度急性毒性的有机磷化合物才能在体内 靶部位蓄积达到迟发性神经毒性作用的阈剂量。 （三）迟发性神经毒性的作用机理 以前，对迟发性神经毒性作用的机理仅基于成年鸡 的试验所见到的有机磷化合物引起的神经麻痹与人的神经毒靶酯酶的抑制相符，提出迟发性 神经毒性作用的机理为神经毒酯酶(NTE)持久的抑制。近年发现有机磷酸酯与神经系统中非 靶蛋白(丁酰胆碱酯酶和神经毒酯酶)亲和力较强，与有机磷酸酯类结合，并暂时贮存，使动 物避免受到有机磷化合物的急性毒性损害。此后非靶蛋白结合的有机磷酸酯类逐步被释放， 通过蛋白转运过程到达神经毒靶组织，并逐渐蓄积，当达到中毒作用阈剂量时，即出现中毒 症状。动物试验结果提示有机磷化合物一次剂量或多次剂量与非靶蛋白的特异性结合，均可 达到阈剂量，且其释放与蓄积达到阈剂量的时间即相当于染毒一次剂量后到出现运动共济失 调的时间间隔。神经细胞变性及溶酶体膜受损与迟发性神经毒性作用也有关，同时可见血浆 中酸性磷酸酶活性增加。另外，有机磷化合物对神经细胞中快速轴浆运转过程有干扰作用， 致使快速轴浆运转发生障碍，对迟发性神经毒性的出现有一定的作用。 （四）具有迟发性神经毒性作用的有机磷化合物 三磷甲苯磷酸酯(TOCP)、丙胺氟磷、 丙氯磷(DFP)，对溴磷(即溴苯磷)，三硫磷，苯硫磷(EPN)、脱叶磷(DEF)，皮蝇磷，壤虫磷， 草特磷(DMPA)，敌敌畏和敌百虫等。 1975 年 WHO(世界卫生组织)已将迟发性神经毒性试验列入有机磷农药毒性试验的观察 项目。 （五）迟发性神经毒性试验 迟发性神经毒性试验的要点如下。 选用遗传背景明确、健康、步态正常的母鸡(莱享鸡)，鸡龄 8~14 个月，体重 1.5~2kg。 每剂量组母鸡数量应保证在观察结束时存活至少有 6 只。一般设高、中、低三个剂量组， 一个阳性对照组和一个阴性对照组。高剂量一般采用 LD50 剂量，观察期结束时可引起试验
动物胆碱酯酶活性下降，以及部分动物死亡。低剂量，可能引起或不引起迟发性神经毒症状， 其剂量一般为高剂量的1/5至1/10左右。在高低之间，设中剂量组。阳性对照组为500mg /kgTOCP. 通常采用经口途径。隔夜禁食，经口给药前10mn内，所有试验鸡均肌肉注射10mgkg 硫酸阿托品作保护处理。 急性试验观察期一般为21天。如未见异常反应或有可疑反应时，须再次给药，继续观 察21天。到期处死做组织病理学检查。如特殊需要，部分动物可延长2一4周或更长时间观 察恢复情况。亚慢性试验是连续给药13周并观察，停药后再观察一周。 每天观察记录试验鸡的外观候 征，行为活动 特别是鸡的站立和运动姿势及运动失调程 度。迟发性神经毒性体征的分级标准为：1.步态稍异常：Ⅱ.步态严重异常：Ⅲ。能以 站立：V.不能站立。一般迟发性神经毒性反应在第7一10天开始出现并逐新加重。每周称 体重一次 对死亡动物和到期处死的动物检查证髓/桥脑、大脑皮质、小藏皮质、脊髓并做组织切 片。坐骨神经切片要作髓鞘和轴索的特殊染色。 光镜观察，必要时可作电镜观察检查。 评定试验农药能 引起迟发性神经毒性及其反应，应结合所观察到的神经毒性效应和神 经病理组织学检查结果综合考虑。 一般认为，对有机磷酸酯毒性的基本资料应包括NT正试验。在安全性评价中，脑乙酰 旧碱酯夜的资料比红细胞乙酰胆碱酯酶中有价值。而血浆胆碱酯丁酰胆碱酯德)抑制不是 毒理学的有害作用。 三、神经毒性的研究方法 )人体的研究 人体的研究与动物试验方法不同，有的研究方法，组织病理学检查中枢神经系统及周 用神经系统的变化，仅能在死后进行。另外，神经毒性化学物不可能在人体进行观察其毒性 效应等，因此人体的研究仅能在人体接触毒物后，在临床观察神经系统某些功能的改变，如 感觉功能、运动功能、 心理功 、神经病学临床检查 如腱反射包括病理反射。电生理检在 如EEG(脑电图、EMG(肌电图)、ENG(神经电图)等。利用CT核磁共振、PET等观察脑定 位的损伤等。 此外，近代提出某些指标可提示神经毒性化学物的接触水平，利用检测人的外周血，尿、 便进行分析。 (一)动物模型研究 建立模拟人体神经系统神经毒性损伤模型，即动物模型，进行各种研究。 1.形态学方法组织病理学观察，包括中枢及周围神经系统的光镜及电镜的观察，神 经细胞的数目及结构的变化、神经细胞轴及髓鞘的变化等。 2.各种神经递质，第二信使的cAMP、cGMP、NO、磷酸肌醇酯、IP3等的测定。 3膜的各种离子通道的测定方法如膜片钳法。 A 全脑、神经细胞培养等体外试验可观察神经毒性化学物的靶部位 及其他上述指标 5.分子生物学技术检测神经细胞特异性基因表达的变化，可早期检出神经毒性的号 期微细效应。建立表达特异性神经细胞的标志物的杂交细胞系，通过体外试验，研究体外毒 理学筛洗方法。 210
273 动物胆碱酯酶活性下降，以及部分动物死亡。低剂量，可能引起或不引起迟发性神经毒症状， 其剂量一般为高剂量的 1／5 至 1／10 左右。在高低之间，设中剂量组。阳性对照组为 500mg ／kgTOCP。 通常采用经口途径。隔夜禁食，经口给药前 10min 内，所有试验鸡均肌肉注射 10mg/kg 硫酸阿托品作保护处理。 急性试验观察期一般为 21 天。如未见异常反应或有可疑反应时，须再次给药，继续观 察 21 天。到期处死做组织病理学检查。如特殊需要，部分动物可延长 2～4 周或更长时间观 察恢复情况。亚慢性试验是连续给药 13 周并观察，停药后再观察一周。 每天观察记录试验鸡的外观体征，行为活动，特别是鸡的站立和运动姿势及运动失调程 度。迟发性神经毒性体征的分级标准为： I．步态稍异常；Ⅱ．步态严重异常；Ⅲ．能以跗 站立；Ⅳ．不能站立。一般迟发性神经毒性反应在第 7～10 天开始出现并逐渐加重。每周称 体重一次。 对死亡动物和到期处死的动物检查延髓／桥脑、大脑皮质、小脑皮质、脊髓并做组织切 片。坐骨神经切片要作髓鞘和轴索的特殊染色。光镜观察，必要时可作电镜观察检查。 评定试验农药能否引起迟发性神经毒性及其反应，应结合所观察到的神经毒性效应和神 经病理组织学检查结果综合考虑。 一般认为，对有机磷酸酯毒性的基本资料应包括 NTE 试验。在安全性评价中，脑乙酰 胆碱酯酶的资料比红细胞乙酰胆碱酯酶更有价值。而血浆胆碱酯酶(丁酰胆碱酯酶)抑制不是 毒理学的有害作用。 三、神经毒性的研究方法 （一）人体的研究 人体的研究与动物试验方法不同，有的研究方法，如组织病理学检查中枢神经系统及周 围神经系统的变化，仅能在死后进行。另外，神经毒性化学物不可能在人体进行观察其毒性 效应等，因此人体的研究仅能在人体接触毒物后，在临床观察神经系统某些功能的改变，如 感觉功能、运动功能、心理功能、神经病学临床检查，如腱反射包括病理反射。电生理检查 如 EEG(脑电图)、EMG(肌电图)、ENG(神经电图)等。利用 CT 核磁共振、PET 等观察脑定 位的损伤等。 此外，近代提出某些指标可提示神经毒性化学物的接触水平，利用检测人的外周血，尿、 便进行分析。 （二）动物模型研究 建立模拟人体神经系统神经毒性损伤模型，即动物模型，进行各种研究。 1. 形态学方法 组织病理学观察，包括中枢及周围神经系统的光镜及电镜的观察，神 经细胞的数目及结构的变化、神经细胞轴及髓鞘的变化等。 2. 各种神经递质，第二信使的 cAMP、cGMP、NO、磷酸肌醇酯、IP3 等的测定。 3. 膜的各种离子通道的测定方法如膜片钳法。 4. 全脑、神经细胞培养等体外试验可观察神经毒性化学物的靶部位、及其他上述指标。 5. 分子生物学技术 检测神经细胞特异性基因表达的变化，可早期检出神经毒性的早 期微细效应。建立表达特异性神经细胞的标志物的杂交细胞系，通过体外试验，研究体外毒 理学筛选方法
第二节神经行为毒理学 一、神经行为毒理学的概念 行为毒性是指各种各样的化学物质对行为方面所产生的有害影响。通常是指感觉、学习 和记忆、运动等中枢神经系统的功能障碍。神经行为毒理学(nearobehavioral toxicology)是 门边缘科学，是应用心理学的一个分支，是神经毒理学的研究方法之一。神经行为毒理学主 要研究外源化学物特别是低剂量慢性接触对人的神经行为，即人的心理功能的毒性效应。近 代已成为筛选神 经毒性化学物及药物的重要 法》 是评价化学物神经毒性的重要方法 随着行为毒理学方法学的逐步完善，一方面促进了实验心理学的一个分支 行为分析学的 发展，另一方面，也在化学物质的安全性评价方法中，战来裁多地应用行为毒理学的方法。 发展神经行为毒理学的必要性：①环境污染，神经毒性化学物分布较广：②生态平衡破 怀危去人的健底，@高量神经毒性化学物的重大中适事件已逐浙诚少，而低剂量神经 人的危害逐渐被人重视。神经行为毒理学的研究方法特点之 是在临床症状出 现前即可检出神经行为的变化即亚临床表现。 行为毒性的发生机制，与其他一般毒性的发生机制是不同的。通常一般毒性是器质性的 损伤而引起明显的功能性变化。而仅仅停留在功能性改变，并未明显地出现器质性障碍的情 况下，可以依靠行为检测方法来进行评价（如图11-1）。 生物体（脑功能》 感觉功能 外部刺激 运动功能 一行为变化（反应） 其他的内在功能（情感、动机、生理、功能等） 图1 行为的发生顺序 近十几年来，神经生化学、神经生理学等学科的日新月异发展，促进了行为异常发生机 制的探讨和研究。在环境和食品中存在的许多具有潜在的神经毒性的化学物质，在低剂量， 无明显形态学改变的条件下，对其毒性的评价成为可能。 二、行为毒理学的方法 行为毒 式验 法可以分为 没行为毒理学和行为致畸学两大类。 般行为毒理学主 要包括①一般行为：②学习能力：③感觉功能：④活动能力：⑤药理学反应性：⑥神经运动 能力等六个方面。 人和动物的行为致畸学主要包括生长、发育过程中，尤其是胚胎发育期间接触某些化学 物质所引起的行为和发有异常。 一)化学物质行为毒性研究问愿的提出 第二次世界大战之前，评价 一种化学物质是否具有毒性是以半数致死量(LD0)为指标 这是人类对化学物质安全性毒理学评价的最初阶段：自第二次世界大战到本世纪六十年代末 期，人们开始将亚急性和慢性毒理学试验用于评价化学物质的毒性：五十年代末期，震惊世 界的“反应停”(halidomide)事件，对毒理学发展起到一个巨大的推动作用，使人们认识 之
274 第二节 神经行为毒理学 一、神经行为毒理学的概念 行为毒性是指各种各样的化学物质对行为方面所产生的有害影响。通常是指感觉、学习 和记忆、运动等中枢神经系统的功能障碍。神经行为毒理学(nearobehavioral toxicology)是一 门边缘科学，是应用心理学的一个分支，是神经毒理学的研究方法之一。神经行为毒理学主 要研究外源化学物特别是低剂量慢性接触对人的神经行为，即人的心理功能的毒性效应。近 代已成为筛选神经毒性化学物及药物的重要方法之一，是评价化学物神经毒性的重要方法。 随着行为毒理学方法学的逐步完善，一方面促进了实验心理学的一个分支——行为分析学的 发展，另一方面，也在化学物质的安全性评价方法中，越来越多地应用行为毒理学的方法。 发展神经行为毒理学的必要性：①环境污染，神经毒性化学物分布较广；②生态平衡破 坏，危害人的健康；③高剂量神经毒性化学物的重大中毒事件已逐渐减少，而低剂量神经毒 性化学物对人的危害逐渐被人重视。神经行为毒理学的研究方法特点之一，是在临床症状出 现前即可检出神经行为的变化即亚临床表现。 行为毒性的发生机制，与其他一般毒性的发生机制是不同的。通常一般毒性是器质性的 损伤而引起明显的功能性变化。而仅仅停留在功能性改变，并未明显地出现器质性障碍的情 况下，可以依靠行为检测方法来进行评价（如图 11-1）。 生物体（脑功能） 感觉功能 外部刺激 运动功能 行为变化（反应） 其他的内在功能（情感、动机、生理、功能等） 图 11-1 行为的发生顺序 近十几年来，神经生化学、神经生理学等学科的日新月异发展，促进了行为异常发生机 制的探讨和研究。在环境和食品中存在的许多具有潜在的神经毒性的化学物质，在低剂量， 无明显形态学改变的条件下，对其毒性的评价成为可能。 二、行为毒理学的方法 行为毒理学试验方法可以分为一般行为毒理学和行为致畸学两大类。一般行为毒理学主 要包括①一般行为；②学习能力；③感觉功能；④活动能力；⑤药理学反应性；⑥神经运动 能力等六个方面。 人和动物的行为致畸学主要包括生长、发育过程中，尤其是胚胎发育期间接触某些化学 物质所引起的行为和发育异常。 （一）化学物质行为毒性研究问题的提出 第二次世界大战之前，评价一种化学物质是否具有毒性是以半数致死量（LD50）为指标， 这是人类对化学物质安全性毒理学评价的最初阶段；自第二次世界大战到本世纪六十年代末 期，人们开始将亚急性和慢性毒理学试验用于评价化学物质的毒性；五十年代末期，震惊世 界的“反应停”（thalidomide）事件，对毒理学发展起到一个巨大的推动作用，使人们认识
到对化学物质安全性评价仅用急性、亚急性、慢性毒理学试验是不够全面的，还需要做相应 的致骑试验。与此同时，Heuper和Case等研究者关于“苯胺和茶胺染料致癌作用的流行病 学调查及研究”的报导，引起了人们对化学物质潜在致癌性的重视。六十年代以后，人们对 化学物质的致畸性 泛深入的研究 ,建立 相应的评价方法， 逐渐被各国政府列入到化学物质安全性评价的法规中，这是化学物质安全性评价发展的第 个阶段：1973年，Jones和Smith报导了胎儿酒精综合征(fetal alcohol syndrome,.FAS),即 母亲在妊娠期间长期饮用酒精性饮料引起的胎儿异常综合征，包括特殊的面部畸形，出生前 后功能发有喷碍和中叔神经系统功能碍。 七十年代，Harada等首次报道了“胎儿水保病 ，即母亲在妊娠期间接触甲 胎儿的神经系统发有 导致胎儿出 生后智力和运动功能发有障碍。日本也先后发现了水俣病人（即慢性甲基汞中毒的病人 这些发现使人们认识到在化学物质安全性评价中，仅仅从形态学的改变米评价是不够的，而 应对后代行为和功能的改变给予足够的重视。因此，自七十年代后期以来，行为毒理学尤其 是方法学的研究得到了讯速的发展。大量研究表明许多具有潜在的神经毒性化学物质，例如 农药 食品添加剂 多联装( 起明显的形态学改变的情况下，却可以引起行为功能的障碍。继七十 手代后期， 日本 英耳 相继在药品鉴定指南中明确指出，必须对后代进行行为方面如运动、学习、视觉等方面的检 查，欧洲经济共同体(EEC)也要求其成员国在化学物质安全性评价中，应做“无临床症状 生殖和生长发有方面的毒性试验”。八十年代，美国先后在新生产化学物质的安全性毒性评 价试验方法指南 增加了“行为功能观察指标测试试验组（下OB)和活动量”等行为测试 方法，把行为毒理 法作为 种敏感的的化学物质安全性评价 手段，逐渐列入化学物质安 全性评价法规中。最近，美国环境保护局制定和须布的实验指南中，明确指出了发育神经毒 性评价的重要性，并规定对准备登记、注册的杀虫剂、杀菌剂等农药必须进行啮齿类动物行 为毒理学实验，包括运动、惊厥反应、学习记忆等方面。这样，行为毒理学由产生到发展至 今天，经历了二十年左右的发展历程，同时也构成了化学物质安全性毒理学评价的第四个阶 段。 我国自1984年试行“食品安全毒理学评价程度”以来，使食品安全性评价工作逐步纳 入法律监督的轨道上来。尤其是九十年代，通过对国外有关化学物质行为毒理学评价方法的 研究，结合我国国内具体的实验条件和对行为毒理学方法学的一系列探讨，提出了一套食品 安全性行为毒理学评价方法，为今天我国食品安全性毒理学评价，特别是为保健食品和食品 新资源开发等鉴定，提供了敏感、简单、易行、可靠的方法，使我国行为毒理学方法学的研 究正逐步与世 界水平接轨 (二)困外研究的最新动态 1998年3月30日至4月1日，召开了国际0ECD神经行为毒性的研讨会。会上着重讨 论了神经毒性的评价原则及其试验方法，为化学物质和农药的安全性评价提供了统一的，标 准的，国际上认可的方法 在1995年至1996年期间，以美国和加拿大两国为中心，并且有欧洲化学物质生态和 理学中心(ECETOC)及美国工业卫生署(AIHC)协同参与下，成立了化学物质的安全性 评价组织(OECD),于1996年撰写出有关进行神经毒性试验方法指南的初搞。在本次会议 上，重新确定了有关的试验方法，尤其是强调应该重视神经系统从发生到成熟这个期间的安 275
275 到对化学物质安全性评价仅用急性、亚急性、慢性毒理学试验是不够全面的，还需要做相应 的致畸试验。与此同时，Heuper 和 Case 等研究者关于“苯胺和苯胺染料致癌作用的流行病 学调查及研究”的报导，引起了人们对化学物质潜在致癌性的重视。六十年代以后，人们对 化学物质的致畸性、致突变性和致癌性进行了广泛深入的研究，建立了相应的评价方法，并 逐渐被各国政府列入到化学物质安全性评价的法规中，这是化学物质安全性评价发展的第三 个阶段；1973 年，Jones 和 Smith 报导了胎儿酒精综合征（fetal alcohol syndrome, FAS），即 母亲在妊娠期间长期饮用酒精性饮料引起的胎儿异常综合征，包括特殊的面部畸形，出生前 后功能发育障碍和中枢神经系统功能障碍。七十年代，Harada 等首次报道了“胎儿水俣病” （fetal minamata），即母亲在妊娠期间接触甲基汞，影响胎儿的神经系统发育，导致胎儿出 生后智力和运动功能发育障碍。日本也先后发现了水俣病人（即慢性甲基汞中毒的病人）。 这些发现使人们认识到在化学物质安全性评价中，仅仅从形态学的改变来评价是不够的，而 应对后代行为和功能的改变给予足够的重视。因此，自七十年代后期以来，行为毒理学尤其 是方法学的研究得到了迅速的发展。大量研究表明许多具有潜在的神经毒性化学物质，例如 农药、食品添加剂、酒精、多氯联苯（polychlorinated biphenyl，PCB）、重金属等，在不引 起明显的形态学改变的情况下，却可以引起行为功能的障碍。继七十年代后期，日本、英国 相继在药品鉴定指南中明确指出，必须对后代进行行为方面如运动、学习、视觉等方面的检 查，欧洲经济共同体（EEC）也要求其成员国在化学物质安全性评价中，应做“无临床症状 生殖和生长发育方面的毒性试验”。八十年代，美国先后在新生产化学物质的安全性毒性评 价试验方法指南中，增加了“行为功能观察指标测试试验组（FOB）和活动量”等行为测试 方法，把行为毒理学方法作为一种敏感的的化学物质安全性评价手段，逐渐列入化学物质安 全性评价法规中。最近，美国环境保护局制定和颁布的实验指南中，明确指出了发育神经毒 性评价的重要性，并规定对准备登记、注册的杀虫剂、杀菌剂等农药必须进行啮齿类动物行 为毒理学实验，包括运动、惊厥反应、学习记忆等方面。这样，行为毒理学由产生到发展至 今天，经历了二十年左右的发展历程，同时也构成了化学物质安全性毒理学评价的第四个阶 段。 我国自 1984 年试行“食品安全毒理学评价程度”以来，使食品安全性评价工作逐步纳 入法律监督的轨道上来。尤其是九十年代，通过对国外有关化学物质行为毒理学评价方法的 研究，结合我国国内具体的实验条件和对行为毒理学方法学的一系列探讨，提出了一套食品 安全性行为毒理学评价方法，为今天我国食品安全性毒理学评价，特别是为保健食品和食品 新资源开发等鉴定，提供了敏感、简单、易行、可靠的方法，使我国行为毒理学方法学的研 究正逐步与世界水平接轨。 （二）国外研究的最新动态 1998 年 3 月 30 日至 4 月 1 日，召开了国际 OECD 神经行为毒性的研讨会。会上着重讨 论了神经毒性的评价原则及其试验方法，为化学物质和农药的安全性评价提供了统一的，标 准的，国际上认可的方法。 在 1995 年至 1996 年期间，以美国和加拿大两国为中心，并且有欧洲化学物质生态和毒 理学中心（ECETOC）及美国工业卫生署（AIHC）协同参与下，成立了化学物质的安全性 评价组织（OECD），于 1996 年撰写出有关进行神经毒性试验方法指南的初搞。在本次会议 上，重新确定了有关的试验方法，尤其是强调应该重视神经系统从发生到成熟这个期间的安
全性评价，应该进行多世代的试验，至少要了解妊娠期和哺乳期接触化学物质所产生的影响 而器官形成期的暴露试验则作为参考。会议还明确了发有神经毒性试验(developn udy)是从神经发生开始到更 上的神 经发有过程中的毒性试验。追加试 三个部分。这说明行为毒理学 经正式应用于化学物质安全性评价中。Hugh Tilson和William Sette两位化学物质安全评价 的权威人也出席了会议。会议上对神经毒性的评价方法、有效性、筛选试验及今后方向的研 究等方面讲行了认真的讨论，并对有关化学物质安全性评价方面即OECD指南(guidanc document)的出版达成意向性的建议 行为毒理学的评价原则 行为毒理学的一般评价原则主要是对那些在环境中存在的可能具有神经毒性，或者可疑 具有神经毒性的化学物质以及可能具有潜在神经毒性的物质，可通过各种途径与人类可能接 触或进入人体的，原则上都应该进行行为毒性的评价。 (四)行为毒理学的平价方法 实验动物选择 原则上是选择生理学和动物学上的分类与人类更接近的 同时也要 既容易获得，又经济的动物，如狗、兔、鼠等。目前国际上最通用的动物是大鼠和小鼠。但 也要注意，动物对化学物质敏感性问题，例如有的动物，只对某种化学物质产生特异反应， 如杀虫剂(diisopropylfurophosphate,DFP)用呐齿类动物不能检测出其毒性，但给小鸡投子 后经过一段时间 ,可以发现其神经毒性。所以，对行为毒性实验来说，化学物质的吸收、 代谢和排泄等方面与特定动物神经系统易感性的选择应予足够的重视和充分的考试， 投予的方式与投予的时间、剂量 对实验动物的化学物质投予方式， 一般为静脉 皮下、腹腔内、经口等方式，方法通常与药理学、毒理学实验相同。可以一次，也可以连续 多次，投子的时间及其时间的长短，取决于实验的目的。动物年龄的选择，针对不同的化学 物质来洗择。有的神经毒性物质加铅对幼小动物性大、敏感，而有的有机溶剂对老龄的动 物产生毒性反应更敏感，尤其是在行为致骑实验中，化学物质对神经系统发育的各个阶段产 生影响，如妊娠期尤 其器官形成期和哺乳期等。此外，化学物质投予的剂量与 实验动物后代 行为异常有者一定的关系。 一般行为毒理学方法行为是在神经系统中所产生的一种包括所有感觉、运动、认 知过程的净产物(net product)。行为反应既可以是反应性的(elicited)或操作性的(emitted) 也可以是学习得到的（条件性的）或者是非学习得到的（非条件性的）。贿着行为毒理学发 展，所应用的试验方法也越来越多，但反映的行为类型却比较固定。 根据不同的行为类型 行为毒理学试验方法可以大致分为以下六大类，以下的方法主要用于评价啮齿类动物的，以 大鼠或小鼠为例，遂一介绍。 (1)一般行为检查：①动物的外观：主要是毛发、眼险、四肢、呼吸、尾部的位置等 状态及分泌物、排泄物的颜色和量。②姿势和运动的观察：运动的种类、姿势、步态。是否 有角弓反张，探索行为过多等不安定的状态。③对刺激的反应：主要是对光、声及空气吹浮 的反应。④触摸后观察：全身状态（震、僵硬）、皮肤额色、感觉过敏等。⑤反应和生理 状况：接近反应、触摸反应、翻正反射、挟尾反应、前后肢抓力及体温、心率、呼吸等。 一般的行为观察见表111，为一般化学物质和药物进行行为毒性试验提供最基本的，必 要的试验方法
276 全性评价，应该进行多世代的试验，至少要了解妊娠期和哺乳期接触化学物质所产生的影响， 而器官形成期的暴露试验则作为参考。会议还明确了发育神经毒性试验（developmental neurotoxicity study）是从神经发生开始到更广义上的神经发育过程中的毒性试验。追加试验 方法说明包括神经行为、神经病理以及神经生理＋神经生化三个部分。这说明行为毒理学已 经正式应用于化学物质安全性评价中。Hugh Tilson 和 William Sette 两位化学物质安全评价 的权威人也出席了会议。会议上对神经毒性的评价方法、有效性、筛选试验及今后方向的研 究等方面进行了认真的讨论，并对有关化学物质安全性评价方面即 OECD 指南（guidance document）的出版达成意向性的建议。 （三）行为毒理学的评价原则 行为毒理学的一般评价原则主要是对那些在环境中存在的可能具有神经毒性，或者可疑 具有神经毒性的化学物质以及可能具有潜在神经毒性的物质，可通过各种途径与人类可能接 触或进入人体的，原则上都应该进行行为毒性的评价。 （四）行为毒理学的评价方法 1. 实验动物选择 原则上是选择生理学和动物学上的分类与人类更接近的，同时也要 既容易获得，又经济的动物，如狗、兔、鼠等。目前国际上最通用的动物是大鼠和小鼠。但 也要注意，动物对化学物质敏感性问题，例如有的动物，只对某种化学物质产生特异反应， 如杀虫剂（diisopropylflurophosphate,DFP）用啮齿类动物不能检测出其毒性，但给小鸡投予 后，经过一段时间，可以发现其神经毒性。所以，对行为毒性实验来说，化学物质的吸收、 代谢和排泄等方面与特定动物神经系统易感性的选择应予足够的重视和充分的考试。 2. 投予的方式与投予的时间、剂量 对实验动物的化学物质投予方式，一般为静脉、 皮下、腹腔内、经口等方式，方法通常与药理学、毒理学实验相同。可以一次，也可以连续 多次，投予的时间及其时间的长短，取决于实验的目的。动物年龄的选择，针对不同的化学 物质来选择。有的神经毒性物质如铅对幼小动物毒性大、敏感，而有的有机溶剂对老龄的动 物产生毒性反应更敏感，尤其是在行为致畸实验中，化学物质对神经系统发育的各个阶段产 生影响，如妊娠期尤其器官形成期和哺乳期等。此外，化学物质投予的剂量与实验动物后代 行为异常有着一定的关系。 3. 一般行为毒理学方法 行为是在神经系统中所产生的一种包括所有感觉、运动、认 知过程的净产物（net product）。行为反应既可以是反应性的（elicited）或操作性的（emitted） 也可以是学习得到的（条件性的）或者是非学习得到的（非条件性的）。随着行为毒理学发 展，所应用的试验方法也越来越多，但反映的行为类型却比较固定。根据不同的行为类型， 行为毒理学试验方法可以大致分为以下六大类，以下的方法主要用于评价啮齿类动物的，以 大鼠或小鼠为例，逐一介绍。 （1）一般行为检查：①动物的外观：主要是毛发、眼睑、四肢、呼吸、尾部的位置等 状态及分泌物、排泄物的颜色和量。②姿势和运动的观察：运动的种类、姿势、步态。是否 有角弓反张，探索行为过多等不安定的状态。③对刺激的反应：主要是对光、声及空气吹浮 的反应。④触摸后观察：全身状态（震颤、僵硬）、皮肤颜色、感觉过敏等。⑤反应和生理 状况：接近反应、触摸反应、翻正反射、挟尾反应、前后肢抓力及体温、心率、呼吸等。 一般的行为观察见表 11-1，为一般化学物质和药物进行行为毒性试验提供最基本的，必 要的试验方法