实验二鼠伤寒沙门氏菌回复突变试验(3009.9-2003食品中淀粉的测定) 一、目的与要求： 1、了解化学毒物致突变性分析的原理及分析要求。 2、掌握回复突变的测试方法。 二、实验原理 鼠伤寒沙门氏组氨酸营养缺陷型菌株不能合成组氨酸，故在缺乏组 氨酸的培养基上，仅少数自发回复突变的细菌生长。假如有致突变物存 在，则营养缺陷型的细菌回复突变成原养型，因而能生长形成菌落，据 此判断受试物是否为致突变物。 某些致突变物需要代谢活化后才能引起回复突变，故需加入经诱 导剂诱导的大鼠肝制备的S9混合液。 三、培养基和试剂 1、0.5mmol/L组氨酸-0.5mmol/L生物素溶液 成分：L-组氨酸(MW155) 78mg D-生物素(MW244) 122mg 加蒸馏水至 1000ml 配制：将上述成分加热，以溶解生物素，然后在0.068MPa下高压 灭菌20min。贮于4℃冰箱。 2、顶层琼脂培养基 成分：琼脂粉 1.2g 氯化钠 1.0g 加蒸馏水至 200ml
实验二 鼠伤寒沙门氏菌回复突变试验（5009.9-2003 食品中淀粉的测定） 一、目的与要求： 1、了解化学毒物致突变性分析的原理及分析要求。 2、掌握回复突变的测试方法。 二、实验原理 鼠伤寒沙门氏组氨酸营养缺陷型菌株不能合成组氨酸，故在缺乏组 氨酸的培养基上，仅少数自发回复突变的细菌生长。假如有致突变物存 在，则营养缺陷型的细菌回复突变成原养型，因而能生长形成菌落，据 此判断受试物是否为致突变物。 某些致突变物需要代谢活化后才能引起回复突变， 故需加入经诱 导剂诱导的大鼠肝制备的 S9 混合液。 三、培养基和试剂 1、 0.5mmol/L 组氨酸-0.5mmol/L 生物素溶液 成分： L-组氨酸(MW 155) 78mg D-生物素(MW 244) 122mg 加蒸馏水至 1000ml 配制：将上述成分加热，以溶解生物素，然后在 0.068MPa 下高压 灭菌 20min。贮于 4℃冰箱。 2、顶层琼脂培养基 成分： 琼脂粉 1.2g 氯化钠 1.0g 加蒸馏水至 200ml
配制：上述成分混合后，于0.103Pa下高压灭菌30min。实验时，加入0. 5mol/L组氨酸-0.5mmo1/L生物素溶液20ml。碘溶液：称取3.6克碘化钾 溶于20毫升水中，加入1.3克碘，溶解后加水稀释至100毫升。 3、Vogel-Bonner(W-B)培养基E 成分：枸椽酸(C6H807·20) 100g 磷酸氢二钾(K2HP04) 500g 磷酸氢铵钠(NaNH4HP04·4H20) 175g 硫酸镁(MgS04·7H20) 10g 加蒸馏水至 1000ml 配制：先将前三种成分加热溶解后，再将溶解的硫酸镁缓缓倒入容 量瓶中，加蒸馏水至1000mL。于0.103MPa下高压灭菌30min。储于4℃ 冰箱。 4、20%葡萄糖溶液 成分：葡萄糖 200g 加蒸馏水至 1000ml 配制：加少量蒸馏水加温溶解葡萄糖，再加蒸馏水至1000mL。于0. 068wPa下高压灭菌20min。储于4℃冰箱。 5、底层琼脂培养基 成分：琼脂粉 7.5g 蒸馏水 480m1 V-B培养基E 10m 20%葡萄糖溶液 10ml 配制：首先将前两种成分于0.103MPa下高压灭菌30min后，再加 入后两种成分，充分混匀倒底层平板。按每皿25L制备平板，冷凝固 化后倒置于37℃培养箱中24h,备用
配制：上述成分混合后，于 0.103MPa 下高压灭菌 30min。实验时，加入 0. 5mmol/L 组氨酸—0.5mmol/L 生物素溶液 20mL。碘溶液：称取 3.6 克碘化钾 溶于 20 毫升水中，加入 1.3 克碘，溶解后加水稀释至 100 毫升。 3、Vogel-Bonner (V-B) 培养基 E 成分：枸椽酸(C6H8O7·H2O) 100g 磷酸氢二钾(K2HPO4) 500g 磷酸氢铵钠(NaNH4HPO4·4H2O) 175g 硫酸镁(MgSO4·7H2O) 10g 加蒸馏水至 1000ml 配制：先将前三种成分加热溶解后，再将溶解的硫酸镁缓缓倒入容 量瓶中，加蒸馏水至 1000mL。于 0.103MPa 下高压灭菌 30min。储于 4℃ 冰箱。 4、20%葡萄糖溶液 成分：葡萄糖 200g 加蒸馏水至 1000ml 配制：加少量蒸馏水加温溶解葡萄糖，再加蒸馏水至 1000mL。于 0. 068MPa 下高压灭菌 20min。储于 4℃冰箱。 5、底层琼脂培养基 成分：琼脂粉 7.5g 蒸馏水 480ml V-B 培养基 E 10ml 20%葡萄糖溶液 10ml 配制：首先将前两种成分于 0.103MPa 下高压灭菌 30min 后，再加 入后两种成分，充分混匀倒底层平板。按每皿 25mL 制备平板，冷凝固 化后倒置于 37℃培养箱中 24h，备用
6、营养肉汤培养基 成分：牛肉膏 2.5g 胰胨 5.0g 磷酸氢二钾(K2HP04) 1.0g 加蒸馏水至500mL 配制：将上述成分混合后，于0.103MPa下高压灭菌30min。储于 4℃冰箱。 7、盐溶液(1.65mol/LKC1+0.4mol/LMgC12) 成分：氯化钾(KC1) 61.5g 氯化镁(MgC12·6H20) 40.7g 加蒸馏水至 500ml 配制：在水中溶解上述成分后，于0.103MPa下高压灭菌30min。 储于4℃冰箱。 8、0.2mol1/L磷酸盐缓冲液(pH7.4) 成分：磷酸二氢钠(NaH2PO4·2H20) 2.965g 磷酸氢二钠(Na2HP04·12H20) 29.015g 加蒸馏水至 500ml 配制：溶解上述成分后，于0.103MPa下高压灭菌30min。储于4℃ 冰箱。 9、S9混合液 成分：每毫升S9混合液 肝S9 100μl 盐溶液 20u1 灭菌蒸馏水 380ul 0.2mol/L磷酸盐缓冲液 500ul 辅酶II(NADP) 4umol
6、营养肉汤培养基 成分：牛肉膏 2.5g 胰 胨 5.0g 磷酸氢二钾(K2HPO4) 1.0g 加蒸馏水至 500mL 配制：将上述成分混合后，于 0.103MPa 下高压灭菌 30min。储于 4℃冰箱。 7、盐溶液(1.65mol/L KCl+0.4mol/L MgCl2) 成分：氯化钾(KCl) 61.5g 氯化镁(MgCl2·6H2O) 40.7g 加蒸馏水至 500ml 配制：在水中溶解上述成分后，于 0.103MPa 下高压灭菌 30min。 储于 4℃冰箱。 8、0.2mol/L 磷酸盐缓冲液(pH7.4) 成分：磷酸二氢钠(NaH2PO4·2H2O) 2.965g 磷酸氢二钠(Na2HPO4·12H2O) 29.015g 加蒸馏水至 500ml 配制：溶解上述成分后，于 0.103MPa 下高压灭菌 30min。储于 4℃ 冰箱。 9、S9 混合液 成分：每毫升 S9 混合液 肝 S9 100l 盐溶液 20l 灭菌蒸馏水 380l 0.2mol/L 磷酸盐缓冲液 500l 辅酶 II(NADP) 4mol
6-磷酸葡萄糖(G-6-P) 5μmol 配制：将辅酶IⅡ和6-磷酸葡萄糖置于灭菌三角瓶内称重，然后按 上述相反的次序加入各种成分，使肝S9加到已有缓冲液的溶液中。该 混合液必须临用现配，并保存于冰水浴中。实验结束，剩余S9混合液 应该丢弃。 10、大鼠肝微粒体酶的诱导和S9的制备 诱导：最广泛应用的大鼠肝微粒体酶的诱导剂是多氯联苯(PCB混 合物)，选择健康雄性大鼠体重200g左右，一次腹腔注射诱导剂，剂 量为500mg/kg体重。诱导剂溶于玉米油中，浓度为200mg/mL。苯巴比 妥钠和B-萘黄酮结合也可做为诱导剂。 S9制备：动物诱导后第五日断头处死。处死前12h停止饮食，但可 自由饮水。首先，用75%酒精消毒动物皮毛，剖开腹部。在无菌条件下， 取出肝脏，去除肝脏的结缔组织，用冰浴的0.15mol/L氯化钾溶液淋洗 肝脏，放入盛有0.15mol/L氯化钾溶液的烧杯里。按每克肝脏加入0.1 5mo1/L氯化钾溶液3mL。用电动匀浆器制成肝匀浆，再在低温高速离心 机上，在4℃条件下，以9000g离心10min,取其上清液(S9)分装于 塑料管中。每管装2L~3L。储存于液氮生物容器中或-80℃冰箱中 备用。 上述全部操作均在冰水浴中和无菌条件下进行。制备肝S9所用 切手术器械、器皿等，均经灭菌消毒。S9制备后，其活力需经诊断性诱 变剂进行鉴定。 11、溶剂的选择 如果受试物为水溶性，可用灭菌蒸馏水作为溶剂；如为脂溶性，应 选择对试验菌株毒性低且无致突变性的有机溶剂，常用的有二甲基亚砜 (DMS0)、丙酮、95%乙醇。一般操作中，为了减少误差和溶剂的影响， 常按每皿使用剂量用同一溶剂配成不同的浓度，固定加入量为100l
6-磷酸葡萄糖(G-6-P) 5mol 配制：将辅酶 II 和 6-磷酸葡萄糖置于灭菌三角瓶内称重，然后按 上述相反的次序加入各种成分， 使肝 S9 加到已有缓冲液的溶液中。该 混合液必须临用现配，并保存于冰水浴中。实验结束，剩余 S9 混合液 应该丢弃。 10、大鼠肝微粒体酶的诱导和 S9 的制备 诱导：最广泛应用的大鼠肝微粒体酶的诱导剂是多氯联苯（PCB 混 合物），选择健康雄性大鼠体重 200g 左右，一次腹腔注射诱导剂，剂 量为 500mg/kg 体重。诱导剂溶于玉米油中，浓度为 200mg/mL。苯巴比 妥钠和β-萘黄酮结合也可做为诱导剂。 S9 制备：动物诱导后第五日断头处死。处死前 12h 停止饮食，但可 自由饮水。首先，用 75%酒精消毒动物皮毛，剖开腹部。在无菌条件下， 取出肝脏，去除肝脏的结缔组织，用冰浴的 0.15mol/L 氯化钾溶液淋洗 肝脏，放入盛有 0.15mol/L 氯化钾溶液的烧杯里。按每克肝脏加入 0.1 5mol/L 氯化钾溶液 3mL。用电动匀浆器制成肝匀浆，再在低温高速离心 机上，在 4℃条件下，以 9000g 离心 10min，取其上清液（S9）分装于 塑料管中。每管装 2 mL ~3 mL。储存于液氮生物容器中或-80℃冰箱中 备用。 上述全部操作均在冰水浴中和无菌条件下进行。制备肝 S9 所用一 切手术器械、器皿等，均经灭菌消毒。S9 制备后，其活力需经诊断性诱 变剂进行鉴定。 11、溶剂的选择 如果受试物为水溶性，可用灭菌蒸馏水作为溶剂；如为脂溶性，应 选择对试验菌株毒性低且无致突变性的有机溶剂，常用的有二甲基亚砜 （DMSO）、丙酮、95%乙醇。一般操作中，为了减少误差和溶剂的影响， 常按每皿使用剂量用同一溶剂配成不同的浓度，固定加入量为 100l
12、剂量的设计 决定受试物最高剂量的标准是对细菌的毒性及其溶解度。自发回变 数的减少，背景菌变得清晰或被处理的培养物细菌存活数减少，都是毒 性的标志。 对原料而言，一般最高剂量组可为5mg/皿。对产品而言，有杀菌作 用的受试物，最高剂量可为最低抑菌浓度，无杀菌作用的受试物，最高 剂量可为原液。受试物至少应设四个剂量组。每个剂量均做三个平行平 板。 四、操作方法 1、增菌培养 取营养肉汤培养基5l,加入无菌试管中，将主平板或冷冻保存的 菌株培养物接种于营养肉汤培养基内，37℃振荡(100次/min)培养10 h。该菌株培养物应每毫升不少于1~2×10°活菌数。 2、平板掺入法 实验时，将含0.5mmol/L组氨酸-0.5mmol/L生物素溶液的项层琼脂 培养基2.0mL分装于试管中，45℃水浴中保温，然后每管依次加入试验 菌株增菌液0.1mL,受试物溶液0.1mL和S9混合液0.5mL(需代谢活化 时)，充分混匀，迅速倾入底层琼脂平板上，转动平板，使之分布均匀。 水平放置待冷凝固化后，倒置于37℃培养箱里孵育48h。记数每皿回变 菌落数。 实验中，除设受试物各剂量组外，还应同时设空白对照、溶剂对照、 阳性诱变剂对照和无菌对照
12、剂量的设计 决定受试物最高剂量的标准是对细菌的毒性及其溶解度。自发回变 数的减少，背景菌变得清晰或被处理的培养物细菌存活数减少，都是毒 性的标志。 对原料而言，一般最高剂量组可为 5mg/皿。对产品而言，有杀菌作 用的受试物，最高剂量可为最低抑菌浓度，无杀菌作用的受试物，最高 剂量可为原液。受试物至少应设四个剂量组。每个剂量均做三个平行平 板。 四、操作方法 1、增菌培养 取营养肉汤培养基 5ml，加入无菌试管中，将主平板或冷冻保存的 菌株培养物接种于营养肉汤培养基内，37℃振荡（100 次/min）培养 10 h。该菌株培养物应每毫升不少于 1～2×109活菌数。 2、平板掺入法 实验时，将含 0.5mmol/L 组氨酸-0.5mmol/L 生物素溶液的顶层琼脂 培养基 2.0mL 分装于试管中，45℃水浴中保温，然后每管依次加入试验 菌株增菌液 0.1mL，受试物溶液 0.1mL 和 S9 混合液 0.5mL（需代谢活化 时），充分混匀，迅速倾入底层琼脂平板上，转动平板，使之分布均匀。 水平放置待冷凝固化后，倒置于 37℃培养箱里孵育 48h。记数每皿回变 菌落数。 实验中，除设受试物各剂量组外，还应同时设空白对照、溶剂对照、 阳性诱变剂对照和无菌对照
五、数据处理和结果判断 记录受试物各剂量组、空白对照（自发回变）、溶剂对照以及阳性 诱变剂对照的每皿回变菌落数，并求平均值和标准差。 如果受试物的回变菌落数是溶剂对照回变菌落数的两倍或两倍以 上，并呈剂量-反应关系者，则该受试物判定为致突变阳性。 受试物经上述四个试验菌株测定后，只要有一个试验菌株，无论在加S9或 未加S9条件下为阳性，均可报告该受试物对鼠伤寒沙门氏菌为致突变阳性。如 果受试物经四个试验菌株检测后，无论加S9和未加S9均为阴性，则可报告该受 试物为致突变阴性。 六、试验报告 试验报告应包括以下内容： (1)受试物名称、理化性状、配制方法、使用溶剂： (2)试验菌株：所用试验菌株： (3)代谢活化系统：所用诱导剂： (4)试验方法：简述操作步骤，除受试物剂量分组外，还应说明空白对照、溶 剂对照和阳性对照，阳性结果判定标准： (5)结果：以列表方式报告受试物的Ames实验结果（表I): (6)结论
五、数据处理和结果判断 记录受试物各剂量组、空白对照（自发回变）、溶剂对照以及阳性 诱变剂对照的每皿回变菌落数，并求平均值和标准差。 如果受试物的回变菌落数是溶剂对照回变菌落数的两倍或两倍以 上，并呈剂量-反应关系者，则该受试物判定为致突变阳性。 受试物经上述四个试验菌株测定后，只要有一个试验菌株，无论在加 S9 或 未加 S9 条件下为阳性，均可报告该受试物对鼠伤寒沙门氏菌为致突变阳性。如 果受试物经四个试验菌株检测后，无论加 S9 和未加 S9 均为阴性，则可报告该受 试物为致突变阴性。 六、试验报告 试验报告应包括以下内容： （1）受试物名称、理化性状、配制方法、使用溶剂； （2）试验菌株：所用试验菌株； （3）代谢活化系统：所用诱导剂； （4）试验方法：简述操作步骤，除受试物剂量分组外，还应说明空白对照、溶 剂对照和阳性对照，阳性结果判定标准； （5）结果：以列表方式报告受试物的 Ames 实验结果（表 1）； （6）结论
表1Ames试验菌株的回变结果（平均值±标准差） 刻量 TA97 TA98 TA100 TA102 组别 (mg 皿) 受试物 自发回变 溶剂对照 阳性物对照
表 1 Ames 试验菌株的回变结果（平均值±标准差） 组别 剂量 (mg/ 皿) TA97 -( S9) +( S9) TA98 -( S9) +( S9) TA100 -( S9) +( S9) TA102 -( S9) +( S9) 受试物 自发回变 溶剂对照 阳性物对照