实验十、食品中苏丹红染料的测定 标准依据：GBT19681-2005食品中苏丹红染料的测定（高效液相色谱法） 目的要求 学习食品中苏丹红染料测定的原理和方法。 二、实验原理 苏丹红色素是应用于油彩蜡、地板蜡和香皂等化工产品中的一种非生物合成 的着色剂，非食用色素，长期食用具有致癌致畸作用。苏丹红色素一般不溶于水 易溶于有机溶剂，待测样品经有机溶剂提取，经浓缩及氧化铝柱层析萃取净化 用反相高效液相色谱一紫外可见光检测器进行色谱分析，采用外标法定量。 三、仪器与试剂 (一)试剂 1、乙腈色谱纯 2、丙酮色谱纯、分析纯 3、甲酸分析纯 4、乙醚分析纯 5、正己烷分析纯 6、无水硫酸钠分析纯 7、层析柱管：1cm(内径)x5cm(高)的注射器管 8、层析用氧化铝（中性100目~200目）：105℃千燥2h,于干燥器中冷至室 温，每100g中加入2mL水降活，均匀后密封，放置12h后使用。 9、氧化铝层析柱：在层析柱管底部塞入一薄层脱脂棉，干法装入处理过的氧 化铝至3cm高，经敲实后加一薄层脱脂棉，用10mL正己烷预淋洗，洗净柱杂 质后，各用。 10、5%丙酮的正己烷溶液：吸取50mL丙酮用正己烷定容至1L。 11、标准物质：苏丹红I、苏丹红Ⅱ、苏丹红、苏丹红V:纯度≥95% 12、标准贮备液：分别称取苏丹红I、苏丹红Ⅱ、苏丹红及苏丹红V各10.0mg (按实际含量折算)，用乙醚溶解后用正己烷定容至250mL。 (二)仪器 1、高效液相色谱仪（配有紫外可见光检测器》
实验十、食品中苏丹红染料的测定 标准依据：GB/T19681-2005 食品中苏丹红染料的测定（高效液相色谱法） 一、 目的要求 学习食品中苏丹红染料测定的原理和方法。 二、实验原理 苏丹红色素是应用于油彩蜡、地板蜡和香皂等化工产品中的一种非生物合成 的着色剂，非食用色素，长期食用具有致癌致畸作用。苏丹红色素一般不溶于水 易溶于有机溶剂，待测样品经有机溶剂提取，经浓缩及氧化铝柱层析萃取净化， 用反相高效液相色谱—紫外可见光检测器进行色谱分析，采用外标法定量。 三、仪器与试剂 （一）试剂 1、乙腈 色谱纯 2、丙酮 色谱纯、分析纯 3、甲酸 分析纯 4、乙醚 分析纯 5、正己烷 分析纯 6、无水硫酸钠 分析纯 7、层析柱管：1cm (内径) 5cm (高)的注射器管。 8、层析用氧化铝（中性 100 目~200 目）：105℃干燥 2h，于干燥器中冷至室 温，每 100g 中加入 2mL 水降活，均匀后密封，放置 12h 后使用。 9、氧化铝层析柱：在层析柱管底部塞入一薄层脱脂棉，干法装入处理过的氧 化铝至 3cm 高，经敲实后加一薄层脱脂棉，用 10mL 正己烷预淋洗，洗净柱杂 质后，备用。 10、5%丙酮的正己烷溶液：吸取 50mL 丙酮用正己烷定容至 1L。 11、标准物质：苏丹红Ⅰ、苏丹红Ⅱ、苏丹红Ⅲ、苏丹红Ⅳ；纯度≥95%。 12、标准贮备液：分别称取苏丹红Ⅰ、苏丹红Ⅱ、苏丹红Ⅲ及苏丹红Ⅳ各 10.0mg （按实际含量折算），用乙醚溶解后用正己烷定容至 250mL。 （二）仪器 1、高效液相色谱仪（配有紫外可见光检测器）
2、分析天平：感量0.1mg 3、旋转蒸发仪 4、均质机或匀浆机 5、粉碎机 6、离心机 7、0.45μm有机滤膜 四、实验步骤 (一)样品制备：将液体、浆状样品混合均匀，固体样品需粉碎磨细 (二)样品处理： 1、红辣椒粉等粉状样品 称取1g~2g(准确至0.001g)样品于三角瓶中，加入10mL~20mL正己烷 超声处理5min,过滤，用10mL正己烷洗涤残渣数次，至洗出液无色，合并正 己烷液，用旋转蒸发仪浓缩至5mL以下，慢慢加入氧化铝层析柱中，为保证层 析效果，在柱中保持正己烷液面为2mm左右时上样，在全程的层析过程中不应 使柱干涸，用正己烷少量多次淋洗浓缩瓶，一并注入层析柱。控制氧化铝表面吸 附的色素带宽宜小于0.5cm,待样液完全流出后，视样品中含油类杂质的多少用 10mL~30mL正己烷洗柱，直至流出液无色，弃去全部正己烷淋洗液，用含5% 丙酮的正己烷液60mL洗脱，收集、浓缩后，用丙酮转移并定容至5mL,经 0.45μm有机滤膜过滤后待测。 2、红辣椒油、火锅料、奶油等油状样品 称取0.5g2g(准确至0.001g)样品于小烧杯中，加入约1mL~10mL正己 烷溶解，难溶解的样品可于正己烷中加温溶解。然后按1中“慢慢加入氧化铝层 析柱.经0.45μm有机滤膜过滤后待测”操作。 3、辣椒酱、番茄沙司等含水量较大的样品 称取10g~20g(准确至0.01g)样品于离心管中，加10mL~20mL水将其分散 成糊状，含增稠剂的样品多加水，加入30mL正己烷：丙酮=3：1，匀浆5min, 3000rpm离心10min,吸出正己烷层，于下层再加入20mL×2次正己烷匀浆，过 滤。合并3次正己烷，加入无水硫酸钠5g脱水，过滤后于旋转蒸发仪上蒸干并 保持5分钟，用5mL正己烷溶解残渣后，按1中“慢慢加入氧化铝层析柱
2、分析天平：感量 0.1mg 3、旋转蒸发仪 4、均质机或匀浆机 5、粉碎机 6、离心机 7、0.45μm 有机滤膜 四、实验步骤 （一）样品制备：将液体、浆状样品混合均匀，固体样品需粉碎磨细。 （二）样品处理： 1、红辣椒粉等粉状样品 称取 1g ~ 2 g（准确至 0.001 g）样品于三角瓶中，加入 10mL ~20mL 正己烷， 超声处理 5min，过滤，用 10 mL 正己烷洗涤残渣数次，至洗出液无色，合并正 己烷液，用旋转蒸发仪浓缩至 5 mL 以下，慢慢加入氧化铝层析柱中，为保证层 析效果，在柱中保持正己烷液面为 2mm 左右时上样，在全程的层析过程中不应 使柱干涸，用正己烷少量多次淋洗浓缩瓶，一并注入层析柱。控制氧化铝表面吸 附的色素带宽宜小于 0.5cm，待样液完全流出后，视样品中含油类杂质的多少用 10mL ~30mL 正己烷洗柱，直至流出液无色，弃去全部正己烷淋洗液，用含 5% 丙酮的正己烷液 60mL 洗脱，收集、浓缩后，用丙酮转移并定容至 5mL，经 0.45μm 有机滤膜过滤后待测。 2、红辣椒油、火锅料、奶油等油状样品 称取 0.5g~2g（准确至 0.001 g）样品于小烧杯中，加入约 1mL ~ 10mL 正己 烷溶解,难溶解的样品可于正己烷中加温溶解。然后按 1 中“慢慢加入氧化铝层 析柱.经 0.45μm 有机滤膜过滤后待测”操作。 3、辣椒酱、番茄沙司等含水量较大的样品 称取 10g ~ 20g (准确至 0.01g)样品于离心管中，加 10mL ~20mL 水将其分散 成糊状，含增稠剂的样品多加水，加入 30mL 正己烷 ：丙酮 =3 ：1，匀浆 5min ， 3000 rpm 离心 10min，吸出正己烷层，于下层再加入 20mL 2 次正己烷匀浆，过 滤。合并 3 次正己烷，加入无水硫酸钠 5g 脱水，过滤后于旋转蒸发仪上蒸干并 保持 5 分钟，用 5mL 正己烷溶解残渣后，按 1 中“慢慢加入氧化铝层析柱
经0.45μm有机滤膜过滤后待测”操作 4、香肠等肉制品 称取粉碎样品10g~20g(准确至0.01g)于三角瓶中，加入60mL正己烷充分 匀浆5min,滤出清夜，再以20mL×2次正己烷匀浆，过滤。合并3次滤液，加 入5g无水硫酸钠脱水，过滤后于旋转蒸发仪上蒸至5mL以下，按1中“慢慢加 入氧化铝层析柱.经0.45μm有机滤膜过滤后待测”操作。 (三)测定 1、色谱检测条件 (1)色谱柱：Zorbax SB-C1g3.5μm4.6mm×150mm(或相当型号色谱柱) (2)流动相： 溶剂A0.1%甲酸的水溶液：乙腈=85：15 溶剂B0.1%甲酸的乙腈溶液：丙酮=80：20 (3)梯度洗脱条件 速时 流动相 曲线 (mL/min) (min) A% B% 1.0 0 25 75 线性 1.0 10.0 2 75 线性 1.0 25.0 0 100 线 10 320 0 100 线性 1.0 35.0 75 线性 1.0 40.0 25 75 线性 (4)柱温：30℃ (5)检测波长：苏丹红I478nm:苏丹红Ⅱ、苏丹红Ⅲ、苏丹红V520nm: 于苏丹红I出峰后切换。 2、标准曲线制备 吸取标准贮备液0、0.1、0.2、0.4、0.8、1.6mL,用正己烷定容至25mL, 此标准系列浓度为0、0.16、0.32、0.64、1.28、2.56μg/mL,各进样量10μL, 绘制标准曲线。 3、样品测定：吸取10μL样品处理液，按标准曲线制备检测色谱条件对样品 进行测定。与标样对照，根据峰保留时间定性以及相应峰面积定量。 五、结果计算
经 0.45μm 有机滤膜过滤后待测”操作。 4、香肠等肉制品 称取粉碎样品 10g ~ 20g (准确至 0.01g)于三角瓶中，加入 60mL 正己烷充分 匀浆 5min，滤出清夜，再以 20mL 2 次正己烷匀浆，过滤。合并 3 次滤液，加 入 5g 无水硫酸钠脱水，过滤后于旋转蒸发仪上蒸至 5mL 以下，按 1 中“慢慢加 入氧化铝层析柱.经 0.45μm 有机滤膜过滤后待测”操作。 （三）测定 1、色谱检测条件 （1）色谱柱：Zorbax SB-C18 3.5μm 4.6mm 150mm（或相当型号色谱柱） （2）流动相： 溶剂 A 0.1%甲酸的水溶液 ：乙腈 = 85 ：15 溶剂 B 0.1%甲酸的乙腈溶液 ：丙酮 = 80 ：20 （3）梯度洗脱条件 流 速 （mL/min） 时 间 （min） 流动相 曲 线 A% B% 1.0 0 25 75 线性 1.0 10.0 25 75 线性 1.0 25.0 0 100 线性 1.0 32.0 0 100 线性 1.0 35.0 25 75 线性 1.0 40.0 25 75 线性 (4) 柱温：30℃ （5）检测波长：苏丹红Ⅰ 478nm ；苏丹红Ⅱ、苏丹红Ⅲ、苏丹红Ⅳ 520nm ； 于苏丹红Ⅰ出峰后切换。 2、标准曲线制备 吸取标准贮备液 0、0.1、0.2、0.4、0.8、1.6mL ，用正己烷定容至 25mL ， 此标准系列浓度为 0、0.16、0.32、0.64、1.28、2.56μg / mL ，各进样量 10μL， 绘制标准曲线。 3、样品测定：吸取 10μL 样品处理液，按标准曲线制备检测色谱条件对样品 进行测定。与标样对照，根据峰保留时间定性以及相应峰面积定量。 五、结果计算
X=cxV 式中X一一样品中苏丹红含量(mg/kg): c一一由标准曲线得出的样液中苏丹红的浓度(“g/mL): V一一样液定容体积(mL): m一一样品质量(g)。 六、实验注意事项及说明 1、不同厂家和不同批号氧化铝的活度有差异，须根据具体购置的氧化铝产品略 作调整，活度的调整采用标准溶液过柱，将1μg/mL的苏丹红的混合标准溶液 1mL加到柱中，用5%丙酮正己烷溶液60mL完全洗脱为准，4种苏丹红在层析 柱上的流出顺序为苏丹红Ⅱ、苏丹红Ⅳ、苏丹红I、苏丹红Ⅲ，可根据每种苏丹 红回收率作出判断。苏丹红Ⅱ、苏丹红Ⅳ的回收率较低表明氧化铝活性偏低，苏 丹红Ⅲ的回收率偏低时表明活性偏高。 2、苏丹红色素色谱分离图如图4所示： 10 15 25 5 图4苏丹红色素色谱分离图 峰1一一苏丹红；峰2一一苏丹红Ⅱ；峰3一一苏丹红Ⅲ：峰4一 苏丹红 七、思考题 样品前处理时，使色素提取液过氧化铝层析柱可去除哪些杂质？
X= m c V 式中 X——样品中苏丹红含量（mg / kg）； c——由标准曲线得出的样液中苏丹红的浓度（μg / mL）； V——样液定容体积（mL）； m——样品质量（g）。 六、实验注意事项及说明 1、不同厂家和不同批号氧化铝的活度有差异，须根据具体购置的氧化铝产品略 作调整，活度的调整采用标准溶液过柱，将 1μg / mL 的苏丹红的混合标准溶液 1 mL 加到柱中，用 5%丙酮正己烷溶液 60 mL 完全洗脱为准，4 种苏丹红在层析 柱上的流出顺序为苏丹红Ⅱ、苏丹红Ⅳ、苏丹红Ⅰ、苏丹红Ⅲ，可根据每种苏丹 红回收率作出判断。苏丹红Ⅱ、苏丹红Ⅳ的回收率较低表明氧化铝活性偏低，苏 丹红Ⅲ的回收率偏低时表明活性偏高。 2、苏丹红色素色谱分离图如图 4- 所示： 图 4- 苏丹红色素色谱分离图 峰 1——苏丹红Ⅰ ；峰 2——苏丹红Ⅱ ；峰 3——苏丹红Ⅲ ；峰 4—— 苏丹红Ⅳ 七、思考题 样品前处理时，使色素提取液过氧化铝层析柱可去除哪些杂质？