实验九：食品中维生素C的含量测定 方法一2,4-二硝基苯肼比色法测定抗坏血酸总量 一、目的要求 理解2,4-二硝基苯肼比色法测定抗坏血酸总量的基本原理。学习其操作方法和了解影 响测定准确性的因素。 二、实验原理 总抗坏血酸包括还原型、脱氢型和二酮古乐糖酸，样品中还原型抗坏血酸经活性炭氧 化为脱氢抗坏血酸，再与2,4-二硝基苯肼作用生成红色脎，其呈色强度与总抗坏血酸含量 呈正比，可进行比色定量。 三、仪器与试剂 (一)试剂 1、4.5molL硫酸：量取250mL浓硫酸小心加入700mL水中，冷却后用水稀释至1000mL。 2、85%硫酸：小心加900mL浓硫酸于100mL水中。 3、2%2,4-二硝基苯胼：溶解2,4-二硝基苯肼2名于100mL4.5molL硫酸中，过滤。不用 时存于冰箱内，每次使用前必须过滤。 4、2%草酸溶液。 5、1%草酸溶液。 6、1%硫脲溶液：溶解1g硫脲于100mL1%草酸溶液中。 7、2%硫脲溶液：溶解2g硫脲于100mL1%草酸溶液中。 8、lmoL盐酸：取100mL盐酸，加入水中，并稀释至1200mL。 9、抗坏血酸标准溶液：称取100mg纯抗坏血酸溶解于100mL2%草酸溶液中，此溶液每毫 升相当于1mg抗坏血酸。 10、活性炭：将100g活性炭加到750mL1mol/L盐酸中，回流1h-2h,过滤，用水洗数次， 至滤液中无铁离子(Fe)为止，然后置于110℃烘箱中烘干。 (二)仪器 1、恒温箱或电热恒温水浴锅。 2、可见光分光光度计 3、捣碎机
实验九： 食品中维生素 C 的含量测定 方法一 2,4–二硝基苯肼比色法测定抗坏血酸总量 一、目的要求 理解 2,4–二硝基苯肼比色法测定抗坏血酸总量的基本原理。学习其操作方法和了解影 响测定准确性的因素。 二、实验原理 总抗坏血酸包括还原型、脱氢型和二酮古乐糖酸，样品中还原型抗坏血酸经活性炭氧 化为脱氢抗坏血酸，再与 2,4–二硝基苯肼作用生成红色脎，其呈色强度与总抗坏血酸含量 呈正比，可进行比色定量。 三、仪器与试剂 （一）试剂 1、4.5mol/L 硫酸：量取 250mL 浓硫酸小心加入 700mL 水中，冷却后用水稀释至 1000mL。 2、85%硫酸：小心加 900mL 浓硫酸于 100mL 水中。 3、2% 2,4–二硝基苯肼：溶解 2,4–二硝基苯肼 2g 于 100mL 4.5mol/L 硫酸中，过滤。不用 时存于冰箱内，每次使用前必须过滤。 4、2%草酸溶液。 5、1%草酸溶液。 6、1%硫脲溶液：溶解 1g 硫脲于 100mL1%草酸溶液中。 7、2%硫脲溶液：溶解 2g 硫脲于 100mL1%草酸溶液中。 8、1mol/L 盐酸：取 100mL 盐酸，加入水中，并稀释至 1200mL。 9、抗坏血酸标准溶液：称取 100mg 纯抗坏血酸溶解于 100mL 2%草酸溶液中，此溶液每毫 升相当于 1mg 抗坏血酸。 10、活性炭：将 100g 活性炭加到 750mL 1mol/L 盐酸中，回流 1h~2h，过滤，用水洗数次， 至滤液中无铁离子（Fe3+）为止，然后置于 110℃烘箱中烘干。 （二）仪器 1、恒温箱或电热恒温水浴锅。 2、可见光分光光度计。 3、捣碎机
四、实验步骤 1、样品处理（全部实验过程应避光）。 (1)鲜样的制备：称取100g鲜样即加入100mL2%草酸溶液，倒入捣碎机中打成匀浆，称 取10.0g40.0g匀浆（含1mg2mg抗坏血酸）倒入100mL容量瓶，用1%草酸溶液稀释至 刻度，混匀。过滤，滤液备用。 (2)干样制备：称取1g~4g干样（含1mg2mg抗坏血酸）放入乳钵内，加入等量的1% 草酸溶液磨成匀浆，连固形物一起倒入100mL容量瓶内，用1%草酸溶液稀释至刻度，混匀 过滤备用。 2、样品还原型抗坏血酸的氧化处理 量取25.0mL上述滤液，加入2g活性炭，振摇1min,过滤，弃去最初数毫升滤液。吸 取10.0mL此氧化提取液，加入10.0mL2%硫脲溶液，混匀，此试样为稀释液。 3、呈色反应 (1)取3支试管，各加入4mL经氧化处理的样品稀释液。基中一支试管作为空白，向其余 两试管加入1.0mL2%2,4-二硝基苯肼溶液，将所有试管放入37℃±0.5℃恒温箱或恒温水 浴中，保温3h。 (2)3劲后取出，除空白管外，将所有试管放入冰水中。空白管取出后使其冷到室温，然后 加入2%2,4-二硝基苯肼溶液1.0mL,在室温中放置10minm15min,后放入冰水内。其余步 骤同试样 4、85%硫酸处理 当试管放入冰水冷却后，向每一试管（连同空白管）中加入85%硫酸5mL,滴加时间 至少需要lmim,需边加边摇动试管。将试管自冰水中取出，在室温放置30min后比色。 5、样品比色测定 用1cm比色皿，以空白液调零点，于500m波长测定吸光值。 6、标准曲线绘制 (1)加2g活性炭于50mL标准溶液中，振动1min后过滤。吸取10.00mL滤液放入500ml 容量瓶中加5.0g硫跟，用1%草酸溶液稀释至刻度。抗坏血酸浓度20μgmL。 吸取5,10,20,25,40,50,60mL稀释液，分别放放7个100mL容量瓶中，用1% 硫脲溶液稀释至刻度，使最后稀释液中抗坏血酸的深度分别为1,2,4,5,8,10,12μgmL, 为抗坏血酸标准使用液。 (2)分别吸取4mL各不同深度的抗坏血酸标准使用液，于7个试管中，吸取4mL水于试
四、实验步骤 1、样品处理（全部实验过程应避光）。 （1）鲜样的制备：称取 100g 鲜样即加入 100mL 2%草酸溶液，倒入捣碎机中打成匀浆，称 取 10.0g~40.0g 匀浆（含 1mg~2mg 抗坏血酸）倒入 100mL 容量瓶，用 1%草酸溶液稀释至 刻度，混匀。过滤，滤液备用。 （2）干样制备：称取 1g ~ 4g 干样（含 1mg~2mg 抗坏血酸）放入乳钵内，加入等量的 1% 草酸溶液磨成匀浆，连固形物一起倒入 100mL 容量瓶内，用 1%草酸溶液稀释至刻度，混匀。 过滤备用。 2、样品还原型抗坏血酸的氧化处理 量取 25.0mL 上述滤液，加入 2g 活性炭，振摇 1min，过滤，弃去最初数毫升滤液。吸 取 10.0mL 此氧化提取液，加入 10.0mL 2%硫脲溶液，混匀，此试样为稀释液。 3、呈色反应 （1）取 3 支试管，各加入 4mL 经氧化处理的样品稀释液。基中一支试管作为空白，向其余 两试管加入 1.0mL 2%2,4–二硝基苯肼溶液，将所有试管放入 37℃±0.5℃恒温箱或恒温水 浴中，保温 3h。 （2）3h 后取出，除空白管外，将所有试管放入冰水中。空白管取出后使其冷到室温，然后 加入 2%2,4–二硝基苯肼溶液 1.0mL，在室温中放置 10min~15min，后放入冰水内。其余步 骤同试样。 4、85%硫酸处理 当试管放入冰水冷却后，向每一试管（连同空白管）中加入 85%硫酸 5mL，滴加时间 至少需要 1min，需边加边摇动试管。将试管自冰水中取出，在室温放置 30min 后比色。 5、样品比色测定 用 1cm 比色皿，以空白液调零点，于 500nm 波长测定吸光值。 6、标准曲线绘制 （1）加 2g 活性炭于 50mL 标准溶液中，振动 1min 后过滤。吸取 10.00mL 滤液放入 500mL 容量瓶中加 5.0g 硫脲，用 1%草酸溶液稀释至刻度。抗坏血酸浓度 20μg/mL。 吸取 5，10，20，25，40，50，60mL 稀释液，分别放放 7 个 100mL 容量瓶中，用 1% 硫脲溶液稀释至刻度，使最后稀释液中抗坏血酸的深度分别为 1，2，4，5，8，10，12μg/mL， 为抗坏血酸标准使用液。 （2）分别吸取 4mL 各不同深度的抗坏血酸标准使用液，于 7 个试管中，吸取 4mL 水于试
剂空白管，各加入1.0mL2%2,4-二硝基苯肼溶液，混匀，将全部试管放入37℃±5℃恒温 箱或恒温水浴中，保温3h。 3h后将8个试管取出，全部放入冰水冷却后，向每一试管中加入5mL85%硫酸，滴加 时间至少需要1min,边加边摇，。将试管自冰水取出，在室温放置30mm后，以试剂空白管 调零，并比色测定。 以吸光值为纵坐标，抗坏血酸含量(mg)为横坐标绘制标准曲线或计算回归方程。 五、结果计算 式中X一一样品中总抗坏血酸含量[mg100g: c一一由标准曲线查得或由回归方程算得试样测定液总抗坏血酸含量(mg): m一测定时所取滤液相当于样品的用量(g)。 计算结果表示到小数点后两位。 六、注意事项及说明 1、利用普鲁士蓝反应可对铁离子存在与否进行检验：将2%亚铁氰化钾与1%盐酸等量混合， 将需检测的样液滴入，如有铁离子则产生蓝色沉淀。 2、硫脲的作用在于防止抗坏血酸的继续被氧化和有助于脎的形成。 3、加硫酸显色后，溶液颜色可随时间的延长而加深，因此，在加入硫酸溶液30min后，应 即立比色测定。 4、检测过程中，测定样的吸光值不落在标准曲线上，可重新调整测定样品的量或标准曲线 的浓度范围。 5、本实验法在1“gm12μgmL抗坏血酸范围内呈良好线性关系，最低检出限为0.1 μgmL。 6、本实验适用于水果、蔬莱及其制品中总抗坏血酸的测定。 7、食品分析中的总抗坏血酸是指抗坏血酸和脱氢抗坏血酸二者的总量，若食品中本身含有 二酮古乐糖酸抗坏血酸的氧化产物，则导致检测总抗坏血酸含量偏高。 七、考思考题 1、试样制备过程为何要避光处理？ 2、为何加入85%硫酸溶液时，速度要慢而且需在冰水浴条件下完成？解释若加酸速度过快 使样品管中液体变黑的原因
剂空白管，各加入 1.0mL 2%2,4–二硝基苯肼溶液，混匀，将全部试管放入 37℃±5℃恒温 箱或恒温水浴中，保温 3h。 3h 后将 8 个试管取出，全部放入冰水冷却后，向每一试管中加入 5mL 85%硫酸，滴加 时间至少需要 1min，边加边摇，。将试管自冰水取出，在室温放置 30min 后，以试剂空白管 调零，并比色测定。 以吸光值为纵坐标，抗坏血酸含量（mg）为横坐标绘制标准曲线或计算回归方程。 五、结果计算 = 100 m c X 式中 X——样品中总抗坏血酸含量[mg/100g]； c——由标准曲线查得或由回归方程算得试样测定液总抗坏血酸含量（mg）； m——测定时所取滤液相当于样品的用量（g）。 计算结果表示到小数点后两位。 六、注意事项及说明 1、利用普鲁士蓝反应可对铁离子存在与否进行检验：将 2%亚铁氰化钾与 1%盐酸等量混合， 将需检测的样液滴入，如有铁离子则产生蓝色沉淀。 2、硫脲的作用在于防止抗坏血酸的继续被氧化和有助于脎的形成。 3、加硫酸显色后，溶液颜色可随时间的延长而加深，因此，在加入硫酸溶液 30min 后，应 即立比色测定。 4、检测过程中，测定样的吸光值不落在标准曲线上，可重新调整测定样品的量或标准曲线 的浓度范围。 5、本实验法在 1μg/ml~12μg/mL 抗坏血酸范围内呈良好线性关系，最低检出限为 0.1 μg/mL。 6、本实验适用于水果、蔬菜及其制品中总抗坏血酸的测定。 7、食品分析中的总抗坏血酸是指抗坏血酸和脱氢抗坏血酸二者的总量，若食品中本身含有 二酮古乐糖酸抗坏血酸的氧化产物，则导致检测总抗坏血酸含量偏高。 七、考思考题 1、试样制备过程为何要避光处理？ 2、为何加入 85%硫酸溶液时，速度要慢而且需在冰水浴条件下完成？解释若加酸速度过快 使样品管中液体变黑的原因
3、样品比色测定时，用样品空白管调零的目的何在？
3、样品比色测定时，用样品空白管调零的目的何在？