实验十五、水产品中孔雀石绿和结晶紫残留量的测定 标准依据：GB/T19857一2005水产品中孔雀石绿和结晶紫残留量的测定 一、实验目的： 学习水产品中孔雀石绿及其代谢物隐色孔雀石绿(Leucomalachite green)、结品紫及其 代谢物隐色结品紫(Leucocrystal violet)残留量的高效液相色谱的测定方法。 二、实验原理： 试样中的残留物用乙睛乙酸盐缓冲混合液提取，乙腈再次提取后，液液分配到二氯甲 烷层并浓缩，经酸性氧化铝柱净化后，高效液相色谱-P0,柱后衍生测定，外标法定量。 三、实验试剂与仪器； (一)试剂 (除另有规定外，试剂均为分析纯，水为重蒸馏水。) 乙：液相色谱纯。 二氯甲烷。 甲醇：液相色谱纯。 乙酸盐缓冲液：溶解4.95g无水乙酸钠及0.95g对-甲苯磺酸于950ml水中，用冰乙酸调 节溶液pH到4.5，最后用水稀释到1L。 20%盐酸羟胺溶液。 1.0o1/L对-甲苯磺酸：称取17.2g对-甲苯磺酸，并用水稀释至100L 50mol/L乙酸铵缓冲溶液：称取3.85g无水乙酸铵溶解于1000m水中，冰乙酸调pH 到4.5。 二甘醇。 酸性氧化铝：80-120目。 氧化铅。 硅藻土545：色谱层析级。 标准品：孔雀石绿(G)、隐色孔雀石绿(LMG)、结晶紫(CV)、隐色结晶紫(LCY), 纯度大于98%。 标准溶液：准确称取话量的孔雀石绿、隐伍引雀石绿、结品梦、隐伍结品紫，用了睹分 别配制成100g/的标准贮备液，再用乙腈稀释配制1g/L的标准溶液。-18℃光 保存。 混合标准工作溶液：用乙腈稀释标淮溶液(3.2.13)，配制成每毫升含孔雀石绿、隐色 孔雀石绿、结品紫、隐色结品紫均为20g的混合标淮溶液。-18℃避光保存。 (二)仪器和设备 3、离心机：4000r/min
实验十五、水产品中孔雀石绿和结晶紫残留量的测定 标准依据：GB/T 19857—2005 水产品中孔雀石绿和结晶紫残留量的测定 一、实验目的： 学习水产品中孔雀石绿及其代谢物隐色孔雀石绿（Leucomalachite green）、结晶紫及其 代谢物隐色结晶紫(Leucocrystal violet)残留量的高效液相色谱的测定方法。 二、实验原理： 试样中的残留物用乙腈-乙酸盐缓冲混合液提取，乙腈再次提取后，液液分配到二氯甲 烷层并浓缩，经酸性氧化铝柱净化后，高效液相色谱-PbO2柱后衍生测定，外标法定量。 三、实验试剂与仪器： （一）试剂 (除另有规定外，试剂均为分析纯，水为重蒸馏水。) 乙腈：液相色谱纯。 二氯甲烷。 甲醇：液相色谱纯。 乙酸盐缓冲液：溶解 4.95g 无水乙酸钠及 0.95g 对-甲苯磺酸于 950mL 水中,用冰乙酸调 节溶液 pH 到 4.5, 最后用水稀释到 1L。 20%盐酸羟胺溶液。 1.0 mol/L 对-甲苯磺酸：称取 17.2g 对-甲苯磺酸，并用水稀释至 100mL 。 50 mmol/L 乙酸铵缓冲溶液：称取 3.85g 无水乙酸铵溶解于 1000mL 水中，冰乙酸调 pH 到 4.5。 二甘醇。 酸性氧化铝：80-120 目。 二氧化铅。 硅藻土 545：色谱层析级。 标准品：孔雀石绿（MG）、隐色孔雀石绿（LMG）、结晶紫（CV）、隐色结晶紫（LCV）， 纯度大于 98%。 标准溶液：准确称取适量的孔雀石绿、隐色孔雀石绿、结晶紫、隐色结晶紫，用乙腈分 别配制成 100µg/mL 的标准贮备液，再用乙腈稀释配制 1µg/mL 的标准溶液。-18℃避光 保存。 混合标准工作溶液：用乙腈稀释标准溶液（3.2.13），配制成每毫升含孔雀石绿、隐色 孔雀石绿、结晶紫、隐色结晶紫均为 20ng 的混合标准溶液。-18℃避光保存。 （二）仪器和设备 1、高效液相色谱仪：配有紫外-可见光检测器。 2、匀浆机。 3、离心机：4 000 r/min
4、固相萃取装置。 5、25%Pb0,氧化柱：不锈钢预柱管(5cmx4mmi.d),两端附2μm过滤板，抽真空下，填装含 有25%Pb0,的 添加数滴 甲醇压 ,旋紧。临用前用甲醇冲洗。并将Pb0,氧化柱连 接在紫外-可见光检测器与液相色谱柱之间 6、酸性氧化铝柱：1g/3mL,使用前用5mL乙腈活化。 四、实验步骤： (一)样品制备 提 称取5.00g样品于50l离心管内，加入1.5mL20%的盐酸羟胺溶液、2.5L1.0mol/L 的对-甲苯磺酸溶液、5.0mL乙酸盐缓冲溶液，用匀浆机以10000r/min的速度均质30s, 再次震荡30s。3000r/min离心10min 10m乙腈，重复上述操作，合并乙腈层。 净化 在离心管中加入l5ml二氯甲烷，振荡10s,3000r/min离心l0min,将二氯甲烷层 转移至100l的梨形瓶中，再用5乙腈、10二氯甲烷重复上述操作一次，合并二氯甲 烷层于100l梨形瓶中。45℃旋转蒸发至约1 ,用2.5乙腈溶解残渣 将酸性氧化铝柱(3.3.6)安装在固相萃取装置上，将梨形瓶中的溶液转移到柱上，再用 乙腈洗涤瓶两次，每次2.5L,把洗涤液依次通过柱，控制流速不超过0.6ml/min,收集全 部流出液，45℃旋转蒸发至近干，残液准确用0.5l乙腈溶解，过0.45μm滤膜，滤液供液 相色谱测定。 (二)色谱分析 1、液相色谱条件 a)色增柱：C18柱，250m×4.6mm(i.d.),粒度5μm,在C18色谱柱和检测器之间 车接25%ph0,每化柱： b)流动相：乙腈和乙酸铵绥冲溶液(3.2.7).梯度洗脱参数见表1： c)流速：1.0ml/min: d)柱温：室温 e)检测波长：618nm(孔雀石绿)588nm(结品紫) )进样量：50μL. 流动相梯度表 时间(min) 乙酸铵缓冲溶液，% 0 40 4 68o 20 15 80 20 15.1 95 5 17 5
4、固相萃取装置。 5、25% PbO2 氧化柱：不锈钢预柱管(5cm4mm i.d)，两端附 2m 过滤板，抽真空下，填装含 有 25% PbO2 的硅藻土，添加数滴甲醇压实，旋紧。临用前用甲醇冲洗。并将 PbO2 氧化柱连 接在紫外-可见光检测器与液相色谱柱之间。 6、酸性氧化铝柱：1g/3mL，使用前用 5 mL 乙腈活化。 四、实验步骤: （一）样品制备 提取 称取5.00 g样品于50 mL离心管内，加入1.5 mL 20%的盐酸羟胺溶液、2.5 mL 1.0 mol/L 的对-甲苯磺酸溶液、5.0 mL乙酸盐缓冲溶液，用匀浆机以10 000 r/min的速度均质30 s， 加入10 mL乙腈剧烈震摇30 s。加入5g酸性氧化铝，再次震荡30 s。 3 000 r/min离心10 min。 把上清液转移至装有10 mL 水和2 mL 二甘醇的100 mL离心管中。然后在50 mL离心管中加入 10 mL乙腈，重复上述操作，合并乙腈层。 净化 在离心管中加入15 mL 二氯甲烷,振荡10 s， 3 000 r/min离心10 min， 将二氯甲烷层 转移至100 mL的梨形瓶中，再用5 mL乙腈、10 mL 二氯甲烷重复上述操作一次，合并二氯甲 烷层于100 mL梨形瓶中。45℃旋转蒸发至约1 mL，用2.5 mL乙腈溶解残渣。 将酸性氧化铝柱(3.3.6)安装在固相萃取装置上，将梨形瓶中的溶液转移到柱上，再用 乙腈洗涤瓶两次，每次2.5 mL, 把洗涤液依次通过柱，控制流速不超过0.6mL/min，收集全 部流出液，45℃旋转蒸发至近干，残液准确用0.5 mL乙腈溶解，过0.45μm 滤膜，滤液供液 相色谱测定。 （二）色谱分析 1、液相色谱条件 a) 色谱柱： C18柱，250 mm 4.6mm（i.d.）， 粒度5μm，在C18色谱柱和检测器之间 连接25% PbO2氧化柱; b) 流动相：乙腈和乙酸铵缓冲溶液 (3.2.7),梯度洗脱参数见表1； c) 流速：1.0 mL/min； d) 柱温：室温； e) 检测波长：618 nm(孔雀石绿); 588 nm(结晶紫)； f) 进样量：50 μL。 流动相梯度表 时间（min） 乙腈, % 乙酸铵缓冲溶液, % 0 60 40 4 80 20 15 80 20 15.1 95 5 17 95 5
17.1 60 40 20 60 40 1、液相色谱测定 根据样液中被测雀石绿、隐色孔雀石绿、结品紫或隐色结品紫含量情况，洗定峰高相 近的标准工作溶液。标淮工作溶液和样液中孔雀石绿、隐色孔雀石绿、结晶紫或隐色结品紫 响应值均应在仪器检测线性范围内。对标准工作溶液和样液等体积参插进样测定，在上述色 谱条件下，孔雀石绿、结晶紫、隐色孔雀石绿和隐色结晶紫的保留时间约为6.10min、7.88min、 17.77min、18.22min,标准品色谱图参见附录A中图A.2。 空白试验：除不加试样外，均按上述测定步骤进行。 五、计算结果与讨论： 结果计算和表述 按式(2)计算样品中孔雀石绿、隐色孔雀石绿、结晶紫和隐色结晶紫残留量。计算结 果需扣除空白值。 . A.x 式中： 一一样品中待测组分残留量， mg/kg: G-一待测组分标准工作液的浓度，μg/ 样品中待测组分的峰面积 A,一一待测组分标准工作液的峰面积： 上一样液最终定容体积，L: 严一最终样液所代表的试样量，g 测定结果的表述 方法孔雀石绿的残留量测定结果系指孔雀石绿和它的代谢物隐色孔雀石绿残留量的 之和，以孔雀石绿表示。 本方法结品紫的残留量测定结果系指结品紫和它的代谢物隐色结品紫残留量的之和，以 结晶紫表示。 方法检测限 本方法孔雀石绿、隐色孔雀石绿、结晶紫、隐色结晶紫的检测限均为2.Og/kg 大、实验注意事项与说明： 七、思考题：
17.1 60 40 20 60 40 1、 液相色谱测定 根据样液中被测孔雀石绿、隐色孔雀石绿、结晶紫或隐色结晶紫含量情况，选定峰高相 近的标准工作溶液。标准工作溶液和样液中孔雀石绿、隐色孔雀石绿、结晶紫或隐色结晶紫 响应值均应在仪器检测线性范围内。对标准工作溶液和样液等体积参插进样测定。在上述色 谱条件下，孔雀石绿、结晶紫、隐色孔雀石绿和隐色结晶紫的保留时间约为6.10min、7.88min、 17.77min、18.22min，标准品色谱图参见附录A中图A.2。 空白试验：除不加试样外，均按上述测定步骤进行。 五、计算结果与讨论： 结果计算和表述 按式（2）计算样品中孔雀石绿、隐色孔雀石绿、结晶紫和隐色结晶紫残留量。计算结 果需扣除空白值。 CAV X= . (2) AsW 式中： X- 样品中待测组分残留量， mg/kg； C- 待测组分标准工作液的浓度,μg/mL； A- 样品中待测组分的峰面积； As- 待测组分标准工作液的峰面积； V- 样液最终定容体积， mL； W- 最终样液所代表的试样量, g。 测定结果的表述 本方法孔雀石绿的残留量测定结果系指孔雀石绿和它的代谢物隐色孔雀石绿残留量的 之和，以孔雀石绿表示。 本方法结晶紫的残留量测定结果系指结晶紫和它的代谢物隐色结晶紫残留量的之和，以 结晶紫表示。 i. 方法检测限 本方法孔雀石绿、隐色孔雀石绿、结晶紫、隐色结晶紫的检测限均为2.0µg/kg。 六、实验注意事项与说明： 七、思考题：
AU 0.00 5.00 10.00 15.00 图A.2孔雀石绿、隐色孔雀石绿、结品紫、隐色结品紫标准的液相色谱图
图 A.2 孔雀石绿、隐色孔雀石绿、结晶紫、隐色结晶紫标准的液相色谱图